專利名稱:穩(wěn)定的重組腺苷脫氨酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供突變以增強(qiáng)穩(wěn)定性的重組腺苷脫氨酶。
背景技術(shù)：
一段時(shí)間以來腺苷脫氨酶(ADA)已用于治療酶缺陷疾病，該疾病稱為重癥聯(lián)合免疫缺陷疾病(SCID)或"泡泡男孩(Bubble boy)"疾病。超過15年以前，EnzonPharmaceuticals已制備治療性ADA,其以使用牛源ADA酶制備的PEG化的ADA的形式給予患者。
最近，正嘗試使用重組體來源的酶(recombinant source enzyme)(下文稱"rADA")代替牛來源酶。重組人("rhADA")和重組牛("rbADA")都被考慮作為純化的天然牛ADA的代替品。該rbADA和rhADA酶相比目前使用的天然純化的牛的酶有些不穩(wěn)定。認(rèn)為rhADA和rbADA以與半胱氨酸降解一致的方式降解:添加氧；二硫醇的形成；隨著pH增加降解增加；沉淀,尤其當(dāng)pH增加且樣品濃縮時(shí)。在還原的狀態(tài)(reducedstate)，半胱氨酸包含反應(yīng)性-SH基(巰基)，其為易于降解的形式。
有證據(jù)表明單一的、暴露的半胱氨酸可能是對(duì)于rbADA和rhADA兩者所觀察到的降解的原因。牛ADA(即，從牛 來源純化的天然牛ADA)具有與rhADA非常相似的結(jié)構(gòu):牛ADA和rhADA在基本序列的相同位置都具有相同數(shù)量的半胱氨酸。目前獲得的重組人和重組牛ADA包含降解劑(degradants)/雜質(zhì)(二硫醇)，其與半胱氨酸反應(yīng)性一致。天然牛ADA在結(jié)構(gòu)上不同于重組牛ADA，因?yàn)樘烊慌DA具有單摩爾的半胱氨酸與每摩爾ADA鍵合。天然牛ADA也對(duì)高pH穩(wěn)定，表明與ADA鍵合的半胱氨酸的功能為保護(hù)基。
一個(gè)穩(wěn)定重組人和/或重組牛ADA的方法是用氧化的谷胱甘肽，碘乙酰胺，碘乙酸，胱氨酸，其它二硫醇中的任一種及其混合物封端該活性Cys殘基(成熟rbADA和成熟rhADA兩者的Cys 74)。該方法在共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/738，012中闡述，名稱為，"Stabilized Proteins"，其內(nèi)容以其整體在此引入作為參考。
盡管上述說法，但有利地是避免需要另外的通過修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)而進(jìn)行的封端步驟，從而提供在表達(dá)后立即具有的固有穩(wěn)定性。美國(guó)專利號(hào)5，346，823描述了通過突變而進(jìn)行的原核蛋白酶如枯草桿菌蛋白酶和中性蛋白酶的穩(wěn)定化，其使用Ser和其它氨基酸殘基代替去穩(wěn)定Cys殘基。然而，ADA中活性位點(diǎn)的突變分析顯示替換Cys殘基(Cys 262)導(dǎo)致具有活性顯著降低的酶，Bhaumik 等人 1993，The J.0f Biol Chem, 268.(8):5464_5470。因此，在本發(fā)明之前，并不知道通過用另一氨基酸殘基代替活性的和暴露的Cys殘基而穩(wěn)定腺苷脫氨酶，同時(shí)保持最佳的可用酶活性。
因此，有利地是提供穩(wěn)定的rbADA和rhADA，即，在儲(chǔ)存過程和對(duì)酶最佳PEG化有用的PH水平下的加工過程中沒有明顯降解。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明提供重組ADA，相對(duì)于野生型ADA酶，其任何可氧化的半胱氨酸殘基被不可氧化的(non-oxidizable)氨基酸殘基代替。該突變蛋白ADA包含不可氧化的氨基酸殘基，其為天然存在的L-氨基酸中的一種，例如，丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸、酪氨酸和/或現(xiàn)有技術(shù)已知的天然存在的L-氨基酸的變體和衍生物，例如，2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β -丙氨酸、β -氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4_ 二氨基丁酸、鎖鏈素、2，2’ -二氨基庚二酸、2，3_ 二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-Ν-甲基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸等。任選地，避免蛋氨酸或色氨酸，因?yàn)檫@些是潛在可氧化的。
更優(yōu)選地，該不可氧化的氨基酸殘基為絲氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸中的一種。最優(yōu)選絲氨酸。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，該可氧化的半胱氨酸位于成熟ADA蛋白的約74位。該重組ADA優(yōu)選為重組牛ADA或重組人ADA，其例如，從根據(jù)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的DNA分子翻譯，且其優(yōu)選包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3。當(dāng)重組ADA為根據(jù)SEQ ID NO:1的重組牛ADA時(shí),該ADA任選以多態(tài)性(polymorphism)表達(dá),該多態(tài)性選自Gln代替Lys198 ;Ala代替Thr245 ;和Arg代替Gly351的一種或多種。
本發(fā)明還提供聚環(huán)氧烷-ADA綴合物(conjugate)，其中所述聚環(huán)氧烷優(yōu)選為聚乙二醇。任選地，該聚乙二醇通過連接基化學(xué)物(l`inker chemistry)綴合至重組腺苷脫氨酶，該連接基化學(xué)物選自琥拍酰亞胺基碳酸酯(succinimidylcarbonate),噻唑燒硫酮,尿燒，琥珀酰亞胺基琥珀酸酯，和基于酰胺的連接基。優(yōu)選琥珀酰亞胺基碳酸酯。該聚乙二醇優(yōu)選與重組腺苷脫氨酶的Lys的ε氨基共價(jià)連接。
該聚乙二醇-ADA綴合物包含至少I個(gè)(即，I個(gè)或多個(gè))與ε氨基連接的聚乙二醇鏈，優(yōu)選至少5個(gè)(即，5個(gè)或更多)與ε氨基連接的聚乙二醇鏈，或更優(yōu)選地，約11至約18個(gè)與ε氨基連接的聚乙二醇鏈，所述ε氨基為重組ADA的Lys殘基的ε氨基。
本發(fā)明綴合物的聚乙二醇的分子量為約2,000至約100，000kDa，或更優(yōu)選約4，000 至約 45，OOOkDa0
本發(fā)明進(jìn)一步提供純化本發(fā)明的重組腺苷脫氨酶的方法。例如，該重組腺苷脫氨酶優(yōu)選通過離子交換色譜法(例如，Capto Q，DEAE和SP色譜法)純化，且SEQ ID NO:1的重組腺苷脫氨酶優(yōu)選通過疏水作用色譜法純化。
本發(fā)明進(jìn)一步提供在哺乳動(dòng)物中治療ADA-介導(dǎo)的病癥的方法，包括給藥有效量的本發(fā)明的重組ADA。所述ADA-介導(dǎo)的病癥包括，例如，SCID、癌癥等。
發(fā)明詳述
本發(fā)明提供穩(wěn)定的重組腺苷脫氨酶。本發(fā)明的腺苷脫氨酶通過用可接受的可選氨基酸殘基替換當(dāng)酶在溶液中時(shí)經(jīng)受氧化過程的半胱氨酸殘基而提供，該可選氨基酸殘基保留酶的活性、電荷和三級(jí)結(jié)構(gòu)同時(shí)去除分解不穩(wěn)定性的來源。
A.定義
為了對(duì)本發(fā)明提供清楚的說明，多個(gè)術(shù)語如下進(jìn)行定義。
術(shù)語"重組體"是指一種蛋白質(zhì)，其使用在天然狀態(tài)不具有能表達(dá)蛋白質(zhì)的DNA的內(nèi)源性拷貝的細(xì)胞而產(chǎn)生。該細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鼈円淹ㄟ^引入合適分離的核酸序列而遺傳性改變。該術(shù)語還涉及細(xì)胞，或核酸，或載體(vector)，其已通過引入異源的(外源性或外來)核酸或?qū)⑻烊缓怂岣淖兂蓪?duì)于細(xì)胞而言非天然的形式而進(jìn)行修飾，或該細(xì)胞是從如此修飾的細(xì)胞衍生而來。因此，例如，重組細(xì)胞表達(dá)天然(非重組)形式的細(xì)胞中沒發(fā)現(xiàn)的基因，表達(dá)天然形式中發(fā)現(xiàn)的基因的突變體，或表達(dá)原本異常表達(dá)、表達(dá)不充足或根本不表達(dá)的天然基因。
如本文所述，"核酸"或"核酸序列"涉及單或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，且除非另有限定，包括以與天然存在的核苷酸類似的方式與核酸雜交的天然核苷酸的已知類似物。除非另有所述，具體的核酸序列包括其互補(bǔ)序列。
與特定核酸有關(guān)的術(shù)語"編碼"，其包括涉及包含用于翻譯成特定蛋白質(zhì)的信息的核酸。該信息通過使用密碼子而指定。
"宿主細(xì)胞"是一種細(xì)胞，其可支持表達(dá)載體的復(fù)制或表達(dá)。宿主細(xì)胞可為原核細(xì)胞如大腸桿菌，或真核細(xì)胞如酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，兩棲動(dòng)物細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
如本文所述，"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"可互換使用，且包括涉及氨基酸殘基的聚合物。
術(shù)語"殘基"或"氨基酸殘基"或"氨基酸"包括涉及摻入至蛋白質(zhì)、多肽或肽(統(tǒng)稱為"肽")的氨基酸。該氨基酸可為天然存在的氨基酸，且除非另有限定，可包括天然氨基酸的已知類似物，其 可以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用。
"轉(zhuǎn)染"是指表達(dá)載體被宿主細(xì)胞吸收，無論任何編碼序列是否實(shí)際被表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種轉(zhuǎn)染方法。例如，轉(zhuǎn)染在表達(dá)載體和高濃度的磷酸鈣的存在下，通過電穿孔，通過使用噬菌體或病毒表達(dá)載體以插入宿主細(xì)胞，通過機(jī)械插入核酸，甚至通過在未包裝的(unpackaged)核酸片段的存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞而完成。通常當(dāng)操作感興趣的載體的任何指示在宿主細(xì)胞中出現(xiàn)時(shí)確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功。
"轉(zhuǎn)化"描述了將核酸引入至生物體中，使得核酸是可復(fù)制的，或者作為染色體外元件或通過整合進(jìn)入宿主染色體。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化使用適合具體宿主細(xì)胞的本領(lǐng)域已知的方法而完成。使用氯化I丐的I丐處理，如描述于Cohen, S.N.Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA),69:2110(1972)和Mandel 等人，J.Mol.Biol.53:154(1970)，通常用于原核生物或其它包封在細(xì)胞壁中的細(xì)胞(例如，許多細(xì)菌和/或植物細(xì)胞)。對(duì)于沒有這樣的細(xì)胞壁的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選 Graham, F.和 van der Eb, A.,Virology, 52:456-457 (1978)的憐酸鈣沉淀法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主體系轉(zhuǎn)化的一般方面已描述于1983年8月16日授權(quán)的美國(guó)專利號(hào)4，399，216。引入到酵母的轉(zhuǎn)化通常根據(jù)Van Solingen, P.，等人，J.Bact.，130:946 (1977)和 Hsiao, C.L.，等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.(USA) 76:3829 (1979)的方法進(jìn)行。然而，也可使用任何其他本領(lǐng)域已知的將核酸,例如，DNA，引入細(xì)胞的方法，如，例如，通過核注射，脂轉(zhuǎn)染，或通過原生質(zhì)體融合。
如本文所述，關(guān)于核酸的術(shù)語"互補(bǔ)"是指當(dāng)使用第一核酸分子作為模板復(fù)制該分子以形成新的第二核酸鏈時(shí)產(chǎn)生的相反鏈(使用Watson-Crick堿基配對(duì))。在本發(fā)明一個(gè)方面，當(dāng)它們?cè)趪?yán)格條件下雜交或結(jié)合在一起時(shí)，認(rèn)為兩個(gè)核酸分子是彼此互補(bǔ)的。
"可操作連接(Operablylinked)"是指組分(例如，調(diào)節(jié)區(qū)和可讀框)的并置(juxtaposition),使得可進(jìn)行組分的正常功能。因此，"可操作連接"至控制序列的可讀框是指一種構(gòu)型，其中所述編碼序列可在這些序列的控制下表達(dá)。
"控制序列"是指在具體宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所需的核酸序列。適于原核生物的控制序列，例如，包括啟動(dòng)子，任選包括操縱基因序列(operatorsequence)，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，以及可能的其它仍然了解很少的序列。已知例如真核細(xì)胞使用這些控制序列作為啟動(dòng)子、聚腺苷酸化(polyadenylation)信號(hào)和增強(qiáng)子，僅舉數(shù)例。
"表達(dá)體系"或"表達(dá)載體"是指以可操作的連接含有所需的編碼序列和控制序列的核酸序列，以使得用這些序列轉(zhuǎn)化的宿主能產(chǎn)生編碼的蛋白質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，該表達(dá)體系可包含在載體上；然而，相關(guān)核酸分子可隨后也整合在宿主染色體中。
如本文所述，"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"和"細(xì)胞培養(yǎng)物"可互換使用且所有這些名稱包括子代。因此，"轉(zhuǎn)化體"或"轉(zhuǎn)化細(xì)胞"包括原代主體細(xì)胞(primarysubject cell)和其來源的培養(yǎng)物，而不考慮轉(zhuǎn)移的次數(shù)。也應(yīng)理解由于故意的或無意的突變，所有子代的基因組內(nèi)含物可能不完全相同。包括與在原始轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選時(shí)具有相同功能的突變體子代?？梢允褂貌煌拿Q，其從上下文看是清楚的。
就本發(fā)明而言，術(shù)語"殘基"應(yīng)理解是指化合物的部分，其涉及，例如，PEG、ADA、氨基酸，等，其在經(jīng)歷被另一化合物取代的反應(yīng)后保留。
就本發(fā)明而言，術(shù)語"聚合物殘基"例如，"PEG殘基"每個(gè)應(yīng)理解為聚合物或PEG的部分，其在經(jīng)歷與其它化合物、部分等反應(yīng)后保留。
就本發(fā)明而言，本文使用的術(shù)語“烷基”是指飽和脂肪烴，包括直鏈，支鏈和環(huán)狀烷基。術(shù)語“燒基”還包括燒基-硫基-燒基，燒氧基燒基，環(huán)燒基燒基，雜環(huán)燒基和Cu燒基羰基烷基。優(yōu)選地，該烷基具有I至12個(gè)碳。更優(yōu)選地，其為約I至7個(gè)碳的低級(jí)烷基，還更優(yōu)選約I至4個(gè)碳。該烷基可為取代的或未取代的。當(dāng)為取代的時(shí)，該取代的基團(tuán)優(yōu)選包括齒素、氧基、置氣基、硝基、氰1基、燒基、燒氧基、燒基_硫基、燒基_硫基_燒基、燒氧基燒基、燒基氣基、二齒代甲基、輕基、疏基、輕基、氛基、燒基娃燒基、環(huán)燒基、環(huán)燒基燒基、雜環(huán)燒基、雜芳基、烯基、炔基、C1^烴基(hydrocarbonyl)、芳基和氨基。
就本發(fā)明而言，本文使用的術(shù)語“取代”是指添加選自以下的一個(gè)基團(tuán)或用選自以下的一個(gè)基團(tuán)替換官能團(tuán)或化合物中包含的一個(gè)或多個(gè)原子:鹵素、氧基、疊氮基、硝基、氰基、燒基、燒氧基、燒基_硫基、燒基_硫基_燒基、燒氧基燒基、燒基氣基、二齒代甲基、輕基、疏基、輕基、氰1基、燒基娃燒基、環(huán)燒基、環(huán)燒基燒基、雜環(huán)燒基、雜芳基、稀基、塊基、C^6烴基、芳基和氨基。
本文使用的術(shù)語“烯基”是指含至少一個(gè)碳-碳雙鍵的基團(tuán)，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀基團(tuán)。優(yōu)選地，該烯基具有約2至12個(gè)碳。更優(yōu)選地，其為約2至7個(gè)碳的低級(jí)烯基，還更優(yōu)選約2至4個(gè)碳。該烯基可為取代的或未取代的。當(dāng)為取代的時(shí)，該取代的基團(tuán)優(yōu)選
包括齒素、氧基、置氣基、硝基、氰1基、燒基、燒氧基、燒基_硫基、燒基_硫基_燒基、燒氧基燒基、燒基氣基、二齒代甲基、輕基、疏基、輕基、氛基、燒基娃燒基、環(huán)燒基、環(huán)燒基燒基、雜環(huán)燒基、雜芳基、稀基、塊基、C1^燒基擬基燒基、芳基和氣基。[0039]本文使用的術(shù)語“炔基”是指含至少一個(gè)碳-碳三鍵的基團(tuán)，包括直鏈、支鏈和環(huán)狀基團(tuán)。優(yōu)選地，該炔基具有約2至12個(gè)碳。更優(yōu)選地，其為約2至7個(gè)碳的低級(jí)炔基，還更優(yōu)選約2至4個(gè)碳。該炔基可為取代的或未取代的。當(dāng)為取代的時(shí)，該取代的基團(tuán)優(yōu)
選包括齒素、氧基、置氣基、硝基、氰1基、燒基、燒氧基、燒基_硫基、燒基_硫基_燒基、燒氧基燒基、燒基氣基、二齒代甲基、輕基、疏基、輕基、氛基、燒基娃燒基、環(huán)燒基、環(huán)燒基燒基、雜環(huán)烷基、雜芳基、烯基、炔基、Cp6烴基、芳基和氨基。"炔基"的實(shí)例包括炔丙基、丙炔和
3-己炔。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“芳基”是指包含至少一個(gè)芳環(huán)的芳香烴環(huán)體系。該芳環(huán)可任選與其它芳香烴環(huán)或非芳香烴環(huán)稠合或連接。芳基的實(shí)例包括，例如，苯基、萘基、1，2，3，
4-四氫萘和聯(lián)苯基。芳基的優(yōu)選實(shí)例包括苯基和萘基。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“環(huán)烷基”是指C3_8環(huán)烴。環(huán)烷基的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基和環(huán)辛基。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“環(huán)烯基”是指包含至少一個(gè)碳-碳雙鍵的C3_8環(huán)烴。環(huán)烯基的實(shí)例包括環(huán)戊烯基、環(huán)戊二烯基、環(huán)己烯基、1，3-環(huán)己二烯基、環(huán)庚烯基、環(huán)庚三烯基和環(huán)
辛烯基。
就本發(fā)明而目，術(shù)語“環(huán)燒基燒基”是指被C3_8環(huán)燒基取代的燒基。環(huán)燒基燒基的實(shí)例包括環(huán)丙基甲基和環(huán)戊基乙基。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“烷氧基”是指通過氧橋連接至母體分子部分的指定碳原子數(shù)的燒基。燒氧基的實(shí)例包括， 例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基和異丙氧基。
就本發(fā)明而目，“燒基芳基”是指被燒基取代的芳基。
就本發(fā)明而目，“芳燒基”是指被芳基取代的燒基。
就本發(fā)明而目，術(shù)語“燒氧基燒基”是指被燒氧基取代的燒基。
就本發(fā)明而目，術(shù)語“燒基_硫基_燒基”是指燒基_S_燒基硫釀，例如甲基硫基甲基或甲基硫基乙基。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“氨基”是指現(xiàn)有技術(shù)已知的從氨衍生的含氮基團(tuán)，其通過用有機(jī)基團(tuán)代替一個(gè)或多個(gè)氫基而得到。例如，術(shù)語“?；被焙汀巴榛被狈謩e是指具有?；屯榛〈奶囟ǖ腘-取代的有機(jī)基團(tuán)。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“烷基羰基”是指被烷基取代的羰基。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“鹵素’或“鹵”是指氟、氯、溴和碘。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“雜環(huán)烷基”是指包含至少一個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的非芳環(huán)體系。該雜環(huán)烷基環(huán)可任選與其它雜環(huán)烷基環(huán)和/或非芳香烴環(huán)稠合至或連接。優(yōu)選雜環(huán)烷基具有3至7元。雜環(huán)烷基的實(shí)例包括，例如，哌嗪、嗎啉、哌啶、四氫呋喃、吡咯烷和吡唑。優(yōu)選雜環(huán)烷基包括哌啶基、哌嗪基、嗎啉基和吡咯烷基。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“雜芳基”是指包含至少一個(gè)選自氮、氧和硫的雜原子的芳環(huán)體系。該雜芳基環(huán)可與一個(gè)或多個(gè)雜芳基環(huán)、芳香或非芳香烴環(huán)或雜環(huán)烷基環(huán)稠合或連接。雜芳基的實(shí)例包括，例如、吡啶、呋喃、噻吩、5，6，7，8-四氫異喹啉和嘧啶。雜芳基的優(yōu)選實(shí)例包括噻吩基、苯并噻吩基、吡啶基、喹啉基、吡嗪基、嘧啶基、咪唑基、苯并咪唑基、呋喃基、苯并呋喃基、噻唑基、苯并噻唑基、異噁唑基、噁二唑基、異噻唑基、苯并異噻唑基、三唑基、四唑基、批咯基、噴哚基、吡唑基和苯并吡唑基。[0054]就本發(fā)明而言，術(shù)語“雜原子”是指氮、氧和硫。
在一些實(shí)施方案中，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羥基烷基和疏基燒基；取代的稀基包括竣基稀基、氣基稀基、二稀基氣基、輕基稀基和疏基稀基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羥基炔基和巰基炔基；取代的環(huán)烷基包括基團(tuán)如4-氯環(huán)己基；芳基包括基團(tuán)如萘基；取代的芳基包括基團(tuán)如3-溴苯基；芳烷基包括基團(tuán)如甲苯基；雜烷基包括基團(tuán)如乙基噻吩；取代的雜烷基包括基團(tuán)如3-甲氧基-噻吩；烷氧基包括基團(tuán)如甲氧基；且苯氧基包括基團(tuán)如3-硝基苯氧基。鹵素應(yīng)理解為包括氟、氯、碘和溴。
就本發(fā)明而言，“正整數(shù)”應(yīng)理解為包括等于或大于I的整數(shù)，且本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解在合理的范圍內(nèi)。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“連接”應(yīng)理解為包括共價(jià)(優(yōu)選)或非共價(jià)連接一個(gè)基團(tuán)至另一個(gè)基團(tuán)上，即，由于化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果。
術(shù)語"有效量"和“足夠量”就本發(fā)明而言應(yīng)是指達(dá)到所需效果或治療效果的量，該效果是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的。
就本發(fā)明而言，術(shù)語“腺苷”應(yīng)理解為包括核苷腺苷和脫氧腺苷。腺苷還包括以AMP、ADP、ATP、dAMP、dADP或dATP形式存在的腺苷和脫氧腺苷。
就本發(fā)明而言，“腺苷介導(dǎo)的病癥”或“腺苷脫氨酶-響應(yīng)性病癥(responsivecondition) ”應(yīng)以廣義理解,包括任何受益于給藥ADA或其活性部分(active fraction)的疾病、病癥或障礙等，且不考慮給藥途徑。
就本發(fā)明而言，“腺苷介導(dǎo)的病癥的治療”或“腺苷脫氨酶-響應(yīng)性病癥的治療”如SCID應(yīng)理解為是指當(dāng)與在沒有ADA治療的情況下觀察到的相比，該病癥或疾病被避免、最小化或減輕。該治療的病癥可通過例如，腺苷的減少而證實(shí)。
廣義上說，應(yīng)認(rèn)為腺苷介導(dǎo)的病癥的成功治療在獲得所需臨床響應(yīng)時(shí)發(fā)生?；蛘叱晒Φ闹委熆赏ㄟ^當(dāng)與在沒有ADA治療的情況下觀察到的相比時(shí)，獲得至少20%或優(yōu)選30%，更優(yōu)選40%或更高(S卩，50%或80%)的腺苷減少而定義，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮的其它臨床指標(biāo)。
而且，單數(shù)術(shù)語在說明書中的方便使用決不是為了限制。因此，例如，包含酶(anenzyme)的組合物是指一個(gè)或多個(gè)分子的該酶。還應(yīng)理解本發(fā)明不限于本文公開的具體構(gòu)型、方法步驟和材料，這些構(gòu)型、方法步驟和材料可稍加修改。
還應(yīng)理解本文使用的術(shù)語僅是用于描述具體實(shí)施方案的目的，不是為了限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍將由所附權(quán)利要求
和其等價(jià)物而限定。
B.重組產(chǎn)生的ADA酶
為獲得重組ADA酶(包括由人或牛源基因表達(dá)的酶)的最初努力，揭露了之前在源自牛腸的天然ADA中未觀察到的儲(chǔ)存不穩(wěn)定性。進(jìn)行了 rhADA和rbADA的分解產(chǎn)物的研究，且證實(shí)兩種ADA酶以與半胱氨酸降解一致的方式降解。例如，向rhADA添加氧導(dǎo)致親水性比rhADA更大的化合物的形成，該化合物的質(zhì)量比rhADA高16和32Da。此外，這導(dǎo)致二硫醇的形成(通過添加二硫蘇糖醇[“DTT”，將亞群的降解劑逆轉(zhuǎn)而指示)；隨著pH增加降解增加；沉淀，尤其是隨PH增加且樣品濃縮時(shí)，表明分子間二硫鍵形成產(chǎn)生不溶的聚集物。
我們已確定單一、暴露的半胱氨酸是觀察到的rhADA降解的原因。牛ADA(未降解的)具有與rhADA非常類似的結(jié)構(gòu):牛ADA和rhADA在基本序列的相同位置都具有相同數(shù)量的半胱氨酸。rbADA還包含與半胱氨酸反應(yīng)性一致的降解劑/雜質(zhì)(二硫醇)。天然牛ADA在結(jié)構(gòu)上不同于rbADA:天然牛ADA具有單摩爾的半胱氨酸鍵合至每摩爾ADA，且天然牛ADA對(duì)高pH穩(wěn)定，表明鍵合至ADA的半胱氨酸的功能為保護(hù)基。鍵合至天然牛ADA的半胱氨酸可通過用還原劑，如巰基乙醇或DTT處理而去除。不希望被任何理論或假說束縛，這表明半胱氨酸基團(tuán)通過二硫鍵綴合至ADA，如下所示:
ADA-S-S-半胱氨酸
其中ADA的基本序列中的一個(gè)半胱氨酸鍵合至半胱氨酸分子。該二硫鍵接合的半胱氨酸對(duì)第一段所述的氧化降解途徑穩(wěn)定。半胱氨酸殘基出現(xiàn)在人和牛的成熟ADA的74，152，153，168和261位。對(duì)X射線晶體學(xué)得到的牛ADA的3-維結(jié)構(gòu)的觀察(Kinoshita等人，2005, Biochemistry,44: 10562-10569)表明在 74，152，153，168 和 261 位的半胱氨酸沒有機(jī)會(huì)接合形成分子內(nèi)二硫鍵。已知結(jié)構(gòu)幾何位阻通常阻止附近的半胱氨酸殘基接合形成二硫鍵，如出現(xiàn)在ADA的152和153位的那些。因此，所有半胱氨酸殘基可能為還原狀態(tài)，且因此是氧化降解反應(yīng)的潛在候選位點(diǎn)。然而，可視觀察上述牛ADA的3-維結(jié)構(gòu)表明，相比另外4個(gè)半胱氨酸，半胱氨酸74以更大的程度清楚地暴露于溶劑，而且，似乎另外4個(gè)半胱氨酸以能防止與溶劑化的反應(yīng)物的顯著相互作用的程度埋藏在酶結(jié)構(gòu)內(nèi)(條件是蛋白質(zhì)未變性)。單一反應(yīng)性半胱氨酸殘基的存在將解釋天然牛腺苷脫氨酶的單衍生化(monoderivatization),其可能是由于翻譯后修飾的結(jié)果。
上述事實(shí)表明在74位的反應(yīng)性半胱氨酸可能是在rhADA和rbADA中觀察到降解的原因，且封端半胱氨酸的反應(yīng)性-S-H基團(tuán)將防止rhADA或rbADA經(jīng)歷對(duì)于那些重組酶觀察到的明顯的氧化降解途徑。進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)以確定是否是這種情況。在37°C將濃度為約0.6mg/mL的重組hADA與125mM碘乙酰胺(IAA)在pH 7.4的磷酸鈉緩沖液中反應(yīng)16小時(shí)。開始反應(yīng)幾分鐘內(nèi)，通過有UV和質(zhì)譜檢測(cè)的RP-HPLC的樣品分析顯示約70.9 %的rhADA被IAA單衍生化，且 17.2%在兩個(gè)位點(diǎn)衍生化。在孵育2和16小時(shí)后，色譜圖形沒有明顯變化，表明該衍生物對(duì)rhADA典型的氧化降解途徑是穩(wěn)定的。制備rhADA的類似樣品(缺失IAA)，并類似地進(jìn)行分析。在37°C和pH 7.4孵育16小時(shí)后，該rhADA蛋白降解至30%的程度(超過樣品最初的降解)。該結(jié)果與單個(gè)、主要暴露的半胱氨酸一致，該半胱氨酸可通過用碘乙酰胺封端而保護(hù)。這些實(shí)驗(yàn)在共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)序列號(hào)11/738,012中更詳細(xì)的描述，其名稱為，"Stabilized Proteins,"在此引入作為參考，如上引用。
盡管封端對(duì)消除ADA中反應(yīng)性半胱氨酸的氧化降解有效，但使用這種封端的酶需要增加制備步驟。因此，對(duì)通過用不同的氨基酸代替從編碼基因直接消除不穩(wěn)定的Cys殘基進(jìn)行了研究。合適的替換氨基酸是不進(jìn)行相同類型氧化的氨基酸，且其不會(huì)破壞折疊的ADA蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，且在本發(fā)明的典型實(shí)施方案中，其經(jīng)選擇從而在綴合物形成的過程中不會(huì)隨機(jī)綴合至活化的聚環(huán)氧烷(polyalkylene oxide) 0根據(jù)本發(fā)明，認(rèn)為任何滿足該標(biāo)準(zhǔn)的現(xiàn)有技術(shù)已知的天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸和/或其衍生物都適于代替可氧化的半胱氨酸。該氨基酸的示例性列表包括天然存在的L-氨基酸如:丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和酪氨酸。色氨酸和蛋氨酸相對(duì)容易氧化，在某些任選實(shí)施方案中，其為較不優(yōu)選的。[0072]在宿主細(xì)胞中位點(diǎn)特異性摻入非天然氨基酸的重組蛋白質(zhì)的制備方法已在文獻(xiàn)中有描述，例如，Liu 等人，2007，Nat.Methods 4(3):239_44，Xie 等人，2006 Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.7 (10):775_82，Ryu 等人，2006，Nat.Methods3 (4):263_65，Deiters 等人，2004, Bioorg.Med.Chem Lett.14(23):5743_5，Bogosian 等人，1989，J.Biol.Chem.264 (I):531-9，Tang 等人，2002，Biochemistry 41(34): 10635-45，Budisa 等人，1995，Eur.J.Biochem.230(2):788_96，和 Randhawa 等人，1994，Biochemistry，33 (14):4352_62。因此，替代氨基酸也可包括修飾的或較不典型的氨基酸，如:2_氨基己二酸、3-氨基己二酸、β -丙氨酸、β -氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4 二氨基丁酸、鎖鏈素、2，2’- 二氨基庚二酸、2，3_二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、羥基賴氨酸、別羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、別異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-Ν-甲基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。
在重組ADA中任選代替半胱氨酸的更優(yōu)選的天然存在的氨基酸，包括，例如，丙氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和纈氨酸。最優(yōu)選絲氨酸，且在下文示例。
因此，獲得表達(dá)野生型人和牛腺苷脫氨酶的DNA分子并進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在大腸桿菌中表達(dá)，且還進(jìn)行突變以表達(dá)在各個(gè)成熟蛋白的74位(翻譯的蛋白質(zhì)的75位)各自含有Ser殘基代替天然存在的Cys殘基的突變蛋白rbADA和突變蛋白rhADA。這些分別% Ser74TbADA(SEQ ID NO:1)和 Ser74_rhADA(SEQ ID NO:3)。此外，應(yīng)注意從牛腸分離的天然牛ADA也具有6個(gè)翻譯后從C-末端去除的殘基。本發(fā)明的Ser74-rbADA表達(dá)沒有所述6個(gè)C-末端殘基(作為突變蛋白)，或被翻譯后修飾以去除純化的天然牛ADA缺少的相同的C-末端殘基，這是本發(fā)明的任選特征。
還應(yīng)注意，從牛腸分離的天然牛ADA具有多態(tài)性:關(guān)于SEQ ID NO:5，牛ADA多態(tài)性包括，例如，谷氨酰胺在198位代替賴氨酸、丙氨酸在245位代替蘇氨酸；精氨酸在351位代替甘氨酸。因此認(rèn)為本發(fā)明的重組74位突變蛋白牛ADA，還可在一個(gè)或多個(gè)所關(guān)注的位置或那些位置的類似位置具有其它 取代:Gln代替Lys198 ；Ala代替Thr245 ；Arg代替Gly351。
在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明提供分離的DNAs，其編碼具有本文所述的氨基序列SEQID NO:1或SEQ ID NO:3的突變蛋白ADA。其它用一種或多種取代而編碼突變蛋白ADA的DNAs:Gln代替Lys198 ;Ala代替Thr245 ;Arg代替Gly351也認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
合適的表達(dá)載體可分別從編碼rhADA或rbADA的基因組或cDNA制備，其任選在合適的可操作連接的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。該DNA優(yōu)選是為合適的宿主細(xì)胞優(yōu)化的密碼子且通過任何現(xiàn)有技術(shù)已知的便利方法突變，例如，通過高效寡核苷酸-定向的誘變(OlsenDB和 Eckstein F，Proc Natl Acad SciUSA 87:1451_5 ;1990)，具有重疊長(zhǎng)寡核苷酸的全基因合成(Vasantha N和Filpula D,Gene 76:53-60 ;1989) ,PCR介導(dǎo)的基因合成(JayaramanK 等人，Proc Natl Acad Sci USA 88:4084_88 ;1991)，或重疊延伸 PCR(Pogulis RJ 等人，Methods Mol Biol 57:167-76 ; 1996)。
通常，原核生物對(duì)于初始克隆DNA序列和構(gòu)建本發(fā)明使用的載體是優(yōu)選的。例如，大腸桿菌K12菌株MM 294(八10:號(hào)31，446)是特別有用的?？墒褂玫钠渌⑸锞?，僅僅是作為實(shí)例，包括大腸桿菌菌株如大腸桿菌B和大腸桿菌X1776 (ATCC號(hào)31，537)。可使用上述菌株，以及，例如，大腸桿菌菌株W3110 (F-，λ -，原養(yǎng)型，ATCC號(hào)27，325)，Κ5772 (ATCC號(hào)53，635)，和SRlOl，芽孢桿菌屬如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，和其他腸桿菌科如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)或粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcesans)和各種假單胞菌屬菌種。
通常，含復(fù)制子和控制序列(其源自與宿主細(xì)胞相容的種類)的質(zhì)粒載體與這些宿主關(guān)聯(lián)使用。常規(guī)質(zhì)粒載體是優(yōu)選用下述酶識(shí)別位點(diǎn)工程化的雙鏈環(huán)狀DNA分子，該酶識(shí)別位點(diǎn)適于插入外源性DNA序列，抗生素可選基因，用于在宿主細(xì)胞中自主繁殖的復(fù)制起點(diǎn)，和用于鑒別或選擇包含重組插入DNA的克隆的基因。適用于大腸桿菌的可用質(zhì)粒載體包括，例如，ρΕΤ3,ρΕΤ9,ρΕΤ11 和延長(zhǎng)的 pET 系列(由 Novagen Corporation編目),pBAD,trc, phoA, trp,和 Oi7kA3i7k 質(zhì)粒。
僅僅是作為實(shí)例，大腸桿菌通常使用由大腸桿菌菌種得到的質(zhì)粒PBR322轉(zhuǎn)化(參見，例如，Bolivar等人，1977，Gene, 2:95)。pBR322包含氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因且因此提供鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)單方法。類似的，PUC質(zhì)粒提供便利的克隆載體，其具有用于選擇和復(fù)制的DNA分子(Yanisch-Perron，等人，1985，Gene 33:103_119，其公開內(nèi)容以其整體在此引入作為參考)。該P(yáng)BR322質(zhì)粒，或其它微生物質(zhì)?；蚴删w，也必須包含，或被修飾而包含啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可被微生物有機(jī)體用于表達(dá)其自己的編碼的蛋白質(zhì)。
在重組DNA構(gòu)建中最經(jīng)常使用的那些啟動(dòng)子包括內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子體系(Chang 等人，1978Nature, 375:615 ；Itakura 等人，1977, Science, 198:1056 ；GoeddeI 等人，1979, Nature, 281:544)和色氨酸(trp)啟動(dòng)子體系(Goeddel 等人，1980,Nucleic Acids Res.，8:4057 ；ΕΡ0申請(qǐng)公開號(hào)0036，776)。盡管最經(jīng)常使用這些，但已發(fā)現(xiàn)和使用其它微生物啟動(dòng)子，且關(guān)于它們的核苷酸序列的具體詳情已被公開，使得技術(shù)人員可將它們與本領(lǐng)域已知的載體，例如，質(zhì)粒載體功能性連接。
僅僅是作為實(shí)例，大腸桿菌中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可用任何以下誘導(dǎo)型啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn):lac，trp,phoA,araBAD,T7,trc,和λ P1和Pk啟動(dòng)子的衍生物，以及本領(lǐng)域已知的其它誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(例如，Makrides, 1996, Microbiol.Rev.60:512_538，其公開內(nèi)容以其整體在此引入作為參考)。
任選與載體相容的合適的誘導(dǎo)子條件包括，例如，阿拉伯糖，乳糖，或熱誘導(dǎo)，磷酸鹽限制(phosphate limitation),色氨酸限制(tryptophan limitation),僅舉數(shù)例。優(yōu)選地，該誘導(dǎo)子元件為L(zhǎng)ac操縱子，其可被異丙基硫代半乳糖苷("IPTG")誘導(dǎo)。
·[0084]合適的信號(hào)序列(信號(hào)肽)可源自pelB, fd pill或ompA。
合適的抗生素選擇標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的且包括，例如，賦予氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、利福平或四環(huán)素抗性的那些，等。
合適的復(fù)制起點(diǎn)序列包括以下質(zhì)粒中所發(fā)現(xiàn)的那些:pUC19，pACYC177，pUBllO,pE194, pAMBl, pIJ702, pBR322, pBR327 和 pSClOl。
合適的終止序列包括,例如，曬菌體fd主要終止子(major terminator), ΤΦ和rrnBo
除了原核生物，還可使用真核微生物，如酵母培養(yǎng)物。釀酒酵母或普通的面包酵母是真核微生物中最經(jīng)常使用的，雖然通常也可使用多種其它菌株。為在酵母屬(Saccharomyces)中表達(dá)，通常使用質(zhì)粒 YRp7,例如(Stinchcomb 等人，1979, Nature, 282:39 ；Kingsman 等人，1979, Gene, 7: 141 ；Tschemper 等人，1980, Gene, 10: 157)。該質(zhì)粒已包含ixni基因，該衛(wèi)I基因提供用于缺乏在色氨酸中生長(zhǎng)能力的酵母的突變株的選擇標(biāo)記，例如，ATCC 號(hào) 44,076 或 PEP4-1 (Jones，1977，Genetics，85:12)。然后作為酵母宿主細(xì)胞基因組特征的Ixnl損傷的存在提供有效的環(huán)境用于通過在色氨酸不存在的情況下的生長(zhǎng)來檢測(cè)轉(zhuǎn)化。
已顯示巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)體系實(shí)現(xiàn)獲得幾種蛋白質(zhì)的高水平產(chǎn)生(Cregg，J.M.等人，1993，Bio/Technology 11:905_910，其公開以其整體在此引入作為參考)，且可用于表達(dá)ADA作為在巴斯德畢赤酵母的細(xì)胞質(zhì)中的可溶蛋白質(zhì)。
酵母載體中合適的啟動(dòng)序列包括3-磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子(Hitzeman等人，J.1980, Biol.Chem.，255:2073)或其它糖酵解酶(Hess 等人，1968，J.Adv.Enzyme Reg.，7:149 !Holland等人，1978,Biochemistry, 17:4900),如烯醇化酶、甘油醒_3_磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。在構(gòu)建合適的表達(dá)質(zhì)粒中，與這些基因相關(guān)的終止序列也連接至序列的表達(dá)載體3'，該序列需要被表達(dá)以提供mRNA的聚腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止。其它具有由生長(zhǎng)條件控制的轉(zhuǎn)錄的其它優(yōu)點(diǎn)的啟動(dòng)子是以下的啟動(dòng)子區(qū)域:乙醇脫氫酶2 (alcohol dehydrogenase 2)、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解性酶、和上述甘油醛-3-磷酸脫氫酶，以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。任何含與酵母相容的啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)和終止序列的質(zhì)粒載體都是適合的。
復(fù)制起點(diǎn)可通過構(gòu)建載體以包括外源起點(diǎn)，如可源自SV40或其它病毒(例如，Polyoma, Adeno, VSV, BPV)來源的外源起點(diǎn)來提供,或可通過宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)理而提供。如果載體整合入宿主細(xì)胞染色體中，后者通常是足夠的。其它有用的質(zhì)粒元件可包括表達(dá)的編碼侶伴蛋白質(zhì)、脯氨酸異構(gòu)酶蛋白質(zhì)或二硫鍵重排的(disulfide shuffling)蛋白質(zhì)的基因。
`[0092]C.聚合綴合物(polymer conjugate)
在本發(fā)明另一方面，該突變蛋白ADA如Ser74-rbADA(SEQ ID NO:1)和Ser74ThADA(SEQ ID NO:3)蛋白質(zhì)綴合至合適的聚合物以制備聚合綴合物。
在優(yōu)選方面,該突變蛋白ADA多肽綴合至基本(substantially)非抗原性聚合物，優(yōu)選聚環(huán)氧烷("ΡΑ0")。
該ADA-聚合綴合物通常相應(yīng)于式(I):
(I) [R-NHJz-(ADA)
其中
(ADA)表示重組突變蛋白腺苷脫氨酶或其活性片段；
NH-為在用于連接至聚合物的突變蛋白ADA上的氨基酸的氨基；
(Z)為正整數(shù),優(yōu)選約I至約80,更優(yōu)選約5至約80,還更優(yōu)選約11至約18 ;且
R包括基本非抗原性聚合物殘基，其以可釋放或不可釋放的形式連接至ADA。
在更優(yōu)選的方面，該聚合物包括聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG可為直鏈、支鏈或多臂的PEG。通常，聚乙二醇具有下式:
-O- (CH2CH2O)n-
其中(η)為正整數(shù)，優(yōu)選約10至約2，300，更優(yōu)選約40至約2，300。聚合物的平均分子量為約2，OOO至約100，OOODa0更優(yōu)選地，該聚合物的平均分子量為約4，OOODa至約45，OOODa，還更優(yōu)選地，4，OOODa至約20，OOODa0最優(yōu)選地，該P(yáng)EG為約5，000道爾頓。其它分子量也在考慮范圍內(nèi)以滿足技術(shù)人員的需要。
或者本發(fā)明的聚乙二醇(PEG)殘基部分可由以下結(jié)構(gòu)表示:
-Y11-(CH2CH2O) ^CH2CH2Y1 r,
-Y11-(CH2CH2O) n-CH2C ( = Y12) -Y11-,
-Y11-C ( = Y12)-(CH2)all-Y13-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y13-(CH2) an-C( = Y12)-Y11-,
-Y11- (CR11R12) al2-Y13- (CH2) bll-0_ (CH2CH2O) n_ (CH2) bll_Y13- (CR11R12) al2_Yn_，
-Y11-(CH2CH2O)n-CH2CH2-,
-Y11-(CH2CH2O) n-CH2C ( = Y12)-，
-C ( = Y12)- (CR11R12) al2-Y13- (CH2) bll-0- (CH2CH2O) n_ (CH2) bll_Y13- (CR11R12) al2-，
其中:
Y11 和 Y13 獨(dú)立地為 0，S，SO, SO2, NR13 或鍵；
Y12 為 0，S，或 NR14 ;
R11-M獨(dú)立地選自龜*、C^6燒基、C2_6稀基、C2_6塊基、C3_19支鏈燒基、C3_8環(huán)燒基、C^6取代的烷基、C2_6取代的烯基、c2_6取代的炔基、c3_8取代的環(huán)烷基、芳基、取代的芳基、雜芳基、取代的雜芳基、C1^6雜烷基、取代的CV6雜烷基、C1^6烷氧基、芳基氧基、C1^6雜烷氧基、雜芳基氧基、c2_6烷?；?、芳基羰基、c2_6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、c2_6烷?；趸?、芳基羰基氧基、C2_6取代的燒酸基、取代的芳基擬基、C2_6取代的燒酸基氧基、取代的芳基氧基擬基、C2-Q取代的燒酸基氧基和取代的芳基擬基氧基；
(all), (al2)和(bll)獨(dú)立地為O或正整數(shù)，優(yōu)選0_6，且更優(yōu)選0，I或2 ;和
(η)為約10至約2300的整數(shù)。
作為實(shí)例，該P(yáng)EG可以以下述非限制性方式起作用:
-C ( = Y14)-C ( = Y14) -Y- (CH2) m- (CH2CH2O) n_，
-C ( = Y14) -NR11- (CH2) m_ (CH2CH2O) n_，
-CR15R16- (CH2) ffl- (CH2CH2O) n_
其中
Rn、R15和R16獨(dú)立地選自HXh烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、雜烷基、取代的雜烷基和取代的Cu烷基；
(m)為O或?yàn)檎麛?shù)，且優(yōu)選I或2 ;
Y14 為 O 或 Sj
(η)表示聚合度。
在這些方面，該聚合物(R基)包括封端基團(tuán)，即，在聚合物的末端的基團(tuán)。該封端基團(tuán)可選自以下的任一種:nh2、OH、SH、CO2H, C16烷基，優(yōu)選甲基，這些基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的。
在另一方面，該綴合物的聚合物部分可以是為ADA提供多個(gè)連接點(diǎn)中的一個(gè)?；蛘叨鄠€(gè)PEG可連接至ADA。[0132]PEG化的ADA的藥代動(dòng)力學(xué)和其它特性可通過控制PEG分子量、連接基化學(xué)物(linker chemistry)和PEG鏈與酶的比例按需要調(diào)節(jié)以用于所需的臨床應(yīng)用。
在這些方面，該ADA可以以可釋放或不可釋放的形式通過本領(lǐng)域已知的多種連接基連接至非抗原性聚合物。
該可釋放聚合物體系可基于芐基消除或三甲基鎖內(nèi)酯化(locklactonization)?？舍尫啪酆衔矬w系的活化的聚合物連接基可根據(jù)共同授讓的美國(guó)專利號(hào)6，180,095,6，720，306，5，965，119，6，624，142和6，303，569而制備，其內(nèi)容在此引入作為參考。或者該ADA聚合綴合物使用某些N-二(羥乙基)甘氨酸(bicine)聚合物殘基制備，如描述于共同授讓的美國(guó)專利號(hào)7，122，189和7,087, 229和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/557，522,11/502, 108和11/011,818的那些，在此引入作為參考。其它考慮的可釋放聚合物體系也描述于PCT/US07/78600，其內(nèi)容在此引入作為參考。
本文考慮的可釋放或不可釋放ADA聚合綴合物的示例性實(shí)例描述于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/913，039，其內(nèi)容在此引入作為參考。
聚合物綴合優(yōu)選為PEG化反應(yīng)，這些反應(yīng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。簡(jiǎn)言之，突變蛋白rbADA或rhADA與活化的聚合物反應(yīng)以形成ADA-聚合綴合物。在這點(diǎn)上,可使用多種活化的或官能化的(functionalized)聚乙二醇,包括描述于例如共同授讓的美國(guó)專利號(hào)5，122，614，5，324，844，5，612，460和5，808，096 (琥珀酰亞胺基碳酸酯_活化的聚乙二醇(SC-PEG)和相關(guān)活化的PEG' S)，美國(guó)專利號(hào)5，349，001 (環(huán)狀亞胺硫酮(cyclicimide thione)活化的PEG' s)，美國(guó)專利號(hào)5，650，234，和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些。上述每個(gè)的公開內(nèi)容在此引入作為參考。還參見從Nektar/Shearwater Polymers得到的活化的聚合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用多種活化形式的用于連接的聚合物，而沒有過多的實(shí)驗(yàn)。
如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，這些綴合反應(yīng)通常在合適的緩沖液中使用幾倍摩爾過量的活化的PEG而進(jìn)行。一 些優(yōu)選用直鏈PEG(如上述SC-PEG)制備的綴合物每個(gè)ADA酶可包含平均約10至約80個(gè)PEG鏈。因此，可使用幾百倍摩爾過量，例如，200-1000倍。用于支鏈PEG和連接至酶的PEG的摩爾過量將是較低的，且可使用本文所述的描述它們的專利和專利申請(qǐng)中描述的技術(shù)而確定。
在這些方面，該聚環(huán)氧烷通過連接基化學(xué)物綴合至蛋白質(zhì)，該連接基化學(xué)物包括，例如，琥珀酰亞胺基碳酸酯、噻唑烷硫酮、尿烷和基于酰胺的連接基。該聚環(huán)氧烷優(yōu)選共價(jià)連接至ADA上的Lys的ε氨基，雖然其它共價(jià)連接的位點(diǎn)是本領(lǐng)域已知的。該ADA聚合綴合物可包括至少5個(gè)聚乙二醇鏈連接至酶上的Lys的ε氨基,但也可包括約11_18個(gè)PEG鏈連接至酶上的Lys的ε氨基。
盡管ADA每個(gè)酶分子通過賴氨酸連接綴合約11至約18個(gè)PEG分子，但可改變PEG與ADA的比例以修改組合的綴合物的物理和動(dòng)力學(xué)特性以適合任何具體臨床情形。
從上述可明顯地是本發(fā)明的其它方面包括使用任何可商購(gòu)的或報(bào)道的活化的PEG或類似聚合物綴合ADA酶或其片段，以提供本文所述的治療方法中使用的綴合物。參見，例如，Nektar Advanced Pegylation 目錄，2004 (Nektar, San Carlos, California),以其整體在此引入作為參考.[0141]活化的PEGs可包括直鏈、支鏈的或U-PEG衍生物如描述于美國(guó)專利號(hào)5，681，567，5，756，593,5, 643，575,5, 919，455,6, 113，906,6, 566，506,6, 153，655,6, 395，266 和6，638，499,6, 251，382和6，824，766的那些(也在此引入作為參考)。該聚合物的非限制
性實(shí)例相應(yīng)于具有以下結(jié)構(gòu)的聚合物體系(i)-(vii):
權(quán)利要求
1.組腺苷脫氨酶，其中以野生型腺苷脫氨酶表達(dá)的可氧化的氨基酸殘基被不可氧化的氨基酸殘基代替，其中所述可氧化的氨基酸殘基為74位的半胱氨酸，所述不可氧化的氨基酸殘基為絲氨酸。
2.權(quán)利要求
1的重組腺苷脫氨酶，其為重組牛腺苷脫氨酶。
3.權(quán)利要求
2的重組腺苷脫氨酶，其從根據(jù)SEQID NO:2的DNA分子翻譯。
4.權(quán)利要求
2的重組腺苷脫氨酶，其包含SEQID NO:1或具有選自以下的氨基酸取代的 SEQ ID NO:1:Gln 代替 Lys198; Ala 代替 Thr245; Arg 代替 Gly351,及其組合。
5.環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述腺苷脫氨酶為權(quán)利要求
1的重組腺苷脫氨酶。
6.權(quán)利要求
5的聚環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚環(huán)氧烷為聚乙二醇。
7.權(quán)利要求
6的聚環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇通過選自以下的連接基綴合至重組腺苷脫氨酶:琥珀酰亞胺基碳酸酯、噻唑烷硫酮、尿烷和基于酰胺的連接基。
8.權(quán)利要求
6的聚環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇與重組腺苷脫氨酶的Lys的ε氨基共價(jià)連接。
9.權(quán)利要求
6的聚環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述重組腺苷脫氨酶包含一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇鏈，所述聚乙二醇鏈與重組腺苷脫氨酶的一個(gè)或多個(gè)Lys殘基的ε氨基連接。
10.權(quán)利要求
6的聚環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述重組腺苷脫氨酶包含約11至約18個(gè)聚乙二醇鏈，所述聚乙二醇鏈與重組腺苷脫氨酶的一個(gè)或多個(gè)Lys殘基的ε氨基連接。
11.權(quán)利要求
6的聚環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇通過琥珀酰亞胺基碳酸酯連接基綴合至重組腺苷脫氨酶。
12.權(quán)利要求
6的聚環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇的分子量為約2，000 至約 100，000。
13.權(quán)利要求
6的聚環(huán)氧烷-腺苷脫氨酶綴合物，其中所述聚乙二醇的分子量為約4，000 至約 45，000。
14.權(quán)利要求
6的聚乙二醇-腺苷脫氨酶綴合物，其中每個(gè)聚乙二醇鏈重約5，000道爾頓。
15.權(quán)利要求
1-14中任一項(xiàng)的重組腺苷脫氨酶在制備用于在哺乳動(dòng)物中治療腺苷脫氨酶-介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。
16.權(quán)利要求
15的用途，其中所述腺苷脫氨酶-介導(dǎo)的病癥為嚴(yán)重聯(lián)合免疫疾病。
17.化權(quán)利要求
5的重組腺苷脫氨酶的方法，包括通過離子交換色譜法純化該蛋白質(zhì)。
18.化包含SEQID NO:1的權(quán)利要求
5的重組腺苷脫氨酶的方法，包括通過疏水作用色譜法純化蛋白質(zhì)。
19.過權(quán)利要求
17的方法制備的重組腺苷脫氨酶。
20.過權(quán)利要求
18的方法制備的重組腺苷脫氨酶。
21.離的DNA，其編碼具有氨基酸序列SEQID NO:1或具有選自以下的氨基酸取代的SEQ ID NO:1的重組腺苷脫氨酶:Gln 代替 Lys198; Ala 代替 Thr245; Arg 代替 Gly351,及其組合。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種突變蛋白重組腺苷脫氨酶，其具有的任何可氧化的半胱氨酸殘基被不可氧化的氨基酸殘基所替代。本發(fā)明還公開了穩(wěn)定的重組腺苷脫氨酶、聚合綴合物和使用它們治療的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN101688244 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200880021124
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2008年4月18日
發(fā)明者戴維·R·菲爾普拉, 斯蒂芬·K·揚(yáng)斯特 申請(qǐng)人:希格馬托罕見疾病公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (1),