專利名稱：產(chǎn)acc脫氨酶并拮抗多種病原真菌的大豆根際固氮菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)ACC脫氨酶并拮抗多種病原真菌的大豆根際固氮菌及其用途，特別涉及一種可以產(chǎn)生ACC脫氨酶、拮抗作物赤霉病菌、菌核病菌和黃萎病菌，并具有在大豆根際進行高效固氮功能的細菌。
背景技術(shù)：
氮肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的生產(chǎn)資料之一。生產(chǎn)化學(xué)氮肥消耗大量能源，占生產(chǎn)總成本的70% 80%。近年來能源日趨緊張，我國化肥生產(chǎn)用煤價格飚升導(dǎo)致化學(xué)氮肥價格上漲，農(nóng)民難以承受，反響強烈。此外，化學(xué)氮肥在提高作物產(chǎn)量、保障我國糧食安全方面發(fā)揮了巨大作用，但是不合理施氮已經(jīng)形成了嚴重的面源污染，造成一系列的嚴重危害，如太湖藍藻事件令人觸目驚心。城市地下水硝酸鹽污染已經(jīng)對飲用水安全造成了威脅。大氣中含有78%的氮素，但其存在形式是分子態(tài)氮氣，動植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大氣中氮氣的能力，將其還原成氨，這就是生物固氮作用。選用高效固氮微生物菌種工廠化生產(chǎn)制成菌劑，或進一步與其它富含植物營養(yǎng)的物料復(fù)合加工成生物制品，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以提供作物氮素營養(yǎng)，改善作物根際生態(tài)環(huán)境，提高土壤生物肥力性狀，這就是通常所說的固氮微生物菌劑或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多種優(yōu)勢①生物氮肥由可再生的生化制劑和活體微生物組成，可以再生，不存在資源枯竭問題，是可持續(xù)發(fā)展農(nóng)資產(chǎn)品。②生物氮肥是環(huán)境友好型肥料，其生產(chǎn)和使用過程均不產(chǎn)生三廢等污染性物質(zhì)，而且能改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤肥力，是生態(tài)農(nóng)業(yè)農(nóng)資產(chǎn)品。③生物氮肥生產(chǎn)耗能少、成本低，其成本僅為等效化學(xué)氮肥的20% 40%，可以為國家節(jié)省大量的煤炭和石油等能源戰(zhàn)略物資。④使用生物氮肥可以顯著降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，提升土壤肥力，使農(nóng)民受益，促進社會和諧發(fā)展。作物赤霉病的病原菌為玉米赤霉菌(Gibberella zeae)，無性世代為禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)，是糧食作物的重要致病菌。我國小麥赤霉病有95%是麥類赤霉病菌引起的，是長江中下游冬麥區(qū)和東北春麥區(qū)的重要病害，發(fā)病時經(jīng)常造成20% 30%的產(chǎn)量損失。此外，該菌還侵染玉米、水稻、大麥等作物，引起苗枯、莖腐、基腐、穗腐等。菌核病的病原菌是核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)，其形態(tài)特征表現(xiàn)為子囊盤小，呈小杯狀，淺肉色至褐色，單個或幾個從菌核上生出，直徑0. 5-lcm,柄褐色細長，彎曲， 長3-5cm，向下漸細，與菌核相連。菌絲體可以形成菌核，長柄的褐色子囊盤產(chǎn)生在菌核上。 菌核形狀多樣，長3-15 μ m。子囊圓柱形，120-140 μ mX 11 μ m，孢子通常8個，單行排列，橢圓形，8-14 μ mX 4-8 μ m，側(cè)絲細長，線形，無色，頂部較粗。該菌是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，廣泛地侵染、危害十字花科、豆科、茄科、蕓香科等植物，如造成油菜、大豆、向日葵、黃瓜、辣椒等經(jīng)濟作物和蔬菜菌核病。棉花黃萎病菌(大麗輪枝菌 Verticillium dahliae)以土壤傳播為主，寄主范圍很廣，除侵染棉花引起黃萎病外，還侵染經(jīng)濟作物煙草、油料作物大豆、花生、向日葵、芝麻、蔬菜作物馬鈴薯、茄子、辣椒、番茄、黃瓜、西瓜，以及林木、花卉等，危害嚴重，造成巨大經(jīng)濟損失。目前對上述真菌病害的防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，然而化學(xué)防治不僅成本高、污染環(huán)境，而且防效也不理想，同時食品的安全性也受到嚴重影響。近年來，干旱、洪澇、土壤次生鹽堿化及重金屬污染等逆境條件造成農(nóng)作物減產(chǎn)等問題日益嚴重，如何有效提高植物抗逆能力和增加農(nóng)作物產(chǎn)量已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展工作的重要內(nèi)容。乙烯是高等植物的內(nèi)源激素，植物生長發(fā)育通常只需要較低水平的乙烯， 但在接近成熟或遇到干旱、淹水、高溫、機械損傷、病蟲害侵襲時會大量產(chǎn)生乙烯，這是植物對環(huán)境的一種生理應(yīng)激反應(yīng)，但過量乙烯會導(dǎo)致植物生長發(fā)育受阻甚至死亡。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-l-carboxylate，ACC)是乙烯合成的前體物質(zhì)，近年來發(fā)現(xiàn)，許多植物促生細菌(plant growth promoting kicteria，PGP^具有ACC脫氨酶活性， 能夠把ACC分解成氨和α - 丁酮酸減少乙烯合成，從而降低植物對逆境的敏感性，提高植物抗逆能力，而且可以促進有機物污染和重金屬污染土壤的植物修復(fù)，因此人們采用檢測ACC 脫氨酶的方法來篩選植物促生細菌。菌種是微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，限制我國微生物肥料行業(yè)發(fā)展的瓶頸就是高效菌種的選育問題。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性強、貨架期長的微生物肥料生產(chǎn)用菌種。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性， 可以在作物根際進行高效固氮，并且拮抗作物赤霉病菌(Gibberella zeae)、菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)禾口棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)的細菌。本發(fā)明所提供的細菌是伯克霍爾德氏菌(Burlcholderia sp.)⑶571，該菌株已于 2011年7月6日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJ* 址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 5039。本發(fā)明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)GD571 CGMCC No. 5039。該菌劑除包含作為活性成分的伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039外，還可包括輔料，如草炭、動物的糞便、各類作物的秸稈、松殼、稻草、花生皮等。該菌劑可用于抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、促進植物生長、抑制植物產(chǎn)生乙烯、降低植物對逆境敏感性、提高植物抗逆性、產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶及固氮酶等。所述伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)GD571 CGMCC No.5039在制備下述 1)-9)中任一菌劑中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍1)用于抑制病原真菌的菌劑；2)用于防治植物真菌病害的菌劑；3)用于固氮的菌劑；4)促進植物生長的菌劑；5)抑制植物產(chǎn)生乙烯的菌劑；6)降低植物對逆境敏感性的菌劑；
7)提高植物抗逆性的菌劑；8)產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶的菌劑；9)產(chǎn)生固氮酶的菌劑。所述病原真菌可為通過土壤、施入土壤中的肥料、和/或種子傳播的真菌，具體可為引起赤霉病的真菌、或為引起菌核病的真菌、或為引起黃萎病的真菌；所述植物真菌病害具體可為赤霉病、菌核病或黃萎?。凰瞿婢尘唧w可為干旱、淹水、高溫、機械損傷、病蟲害侵襲或重金屬污染等。所述引起赤霉病的真菌可為玉米赤霉菌(Gibberella zeae)或禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)；所述弓I起菌核病的真菌可為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)；所述引起黃萎病的真菌可為棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039或以該伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039為活性成分的菌劑在生產(chǎn)固氮酶或 1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶中的應(yīng)用以及在制備生物有機肥中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的再一個目的是提供一種含有伯克霍爾德氏菌(Burldiolderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039 或以該伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039 為活性成分的菌劑的生物有機肥。本發(fā)明的又一個目的是提供一種培養(yǎng)伯克霍爾德氏菌(Burldiolderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039 的方法，包括將伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCCNo. 5039
在用于培養(yǎng)伯克霍爾德氏菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的又一目的是提供一種制備所述菌劑的方法，該方法包括如下步驟將所述的伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039作為活性成分，得到所述菌劑。實驗證明，本發(fā)明是從土壤樣品中經(jīng)過層層篩選，最終篩選出了伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)GD571 CGMCC No. 5039，該菌株可產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙燒-1-羧酸 (ACC)脫氨酶，且固氮酶活性很高，能夠拮抗作物赤霉病病原菌玉米赤霉菌(GitDberella zeae)、菌核病病原菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和棉花黃萎病菌(大麗輪枝菌 Verticillium dahliae)，競爭適應(yīng)能力強，接種效果好，在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。保藏說明菌種名稱伯克霍爾德氏菌拉丁名(Burkholderia sp.)菌株編號⑶571保藏機構(gòu)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱CGMCC地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期2011年7月6日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 5039


圖1為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039的固氮酶活性。圖2為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039拮抗赤霉病菌玉米赤霉菌(Gibberella zeae)。左側(cè)菌落為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.) GD57ICGMCC No. 5039，右側(cè)菌落為赤霉病菌玉米赤霉菌(Gibberella zeae)。圖3為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039拮抗菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。左側(cè)菌落為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039，右側(cè)菌落為菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)。圖4為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)⑶571 CGMCC No.5039拮抗棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。左側(cè)菌落為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.) GD57ICGMCC No. 5039，右側(cè)菌落為棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。圖 5 為伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039 的 1_ 氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。固氮菌富集培養(yǎng)液ACCC55 成份蔗糖 10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、MgSO4 · 7H20 0. 2g、蒸餾水 IOOOmUpH 7. 0 7. 2。改良的ACCC55固氮菌固體培養(yǎng)基成份蔗糖IOg^K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、 CaCO3 lg、MgSO4 · 7H20 0. 2g、酵母膏 0. 5g、蒸餾水 1000ml、瓊脂 1. 5% 2· 0%, pH 7· 0 7. 2。無氮培養(yǎng)基蔗糖10g, NaCl 0. 12g，K2HPO4 · 3H20 0. 5g，CaCO3 lg, MgSO4 · 7H20 0. 2g，蒸餾水 lOOOmL，pH7. 2。DF 培養(yǎng)基=KH2PO4 4. Og, Na2HPO4 6. Og, MgSO4 · 7H20 0. 2g，葡萄糖 2. Og,葡萄糖酸鈉 2. 0g，檸檬酸 2. 0g, (NH4)2SO4 2. 0g，組分一、組分二溶液各 0. lml, H2O IOOOmL, pH 7. 2 ； 其中組分一 =H3BO3 1 Omg，MnSO4 · H2O 11. 19mg，ZnSO4 · 7H20 124. 6mg，CuSO4 · 5H20 78. 22mg, MoO3 10mg，溶于IOOmL滅菌蒸餾水中；組分二 FeS04 ·7Η20 IOOmg溶于IOmL滅菌蒸餾水中。ADF培養(yǎng)基將ACC(1-氨基環(huán)丙烷羧酸)溶于超純水，過濾滅菌，加到不含 (NH4) 2S04的滅菌DF培養(yǎng)基中，終濃度為3. OmM。圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103 (參見“孫建光等.高效固氮芽孢桿菌篩選及其生物學(xué)特性.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42 (6) :2043-2051”)。赤霉病菌-玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae)(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ACCC31053)。菌核病菌-核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ACCC30046)。棉花黃萎病菌-大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)(中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，ACCC30308)。實施例1、大豆根際固氮菌⑶571的分離與鑒定
一、大豆根際固氮菌的富集與分離取IOg 土樣(采自中國黑龍江)放入90ml無菌水中搖床振蕩20min制成混濁液， 吸取5ml放入30ml固氮菌富集培養(yǎng)液ACCC55中，lOOrpm，進行搖床振蕩培養(yǎng)，7 后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)培養(yǎng)3次后進行固氮芽孢菌分離。吸取Iml上述固氮菌富集培養(yǎng)物放到9ml無菌水中制成KT1稀釋度，繼續(xù)稀釋制成10_2、10_3、10_4、10_5稀釋度的菌懸液，在100°C沸水中加熱lOmin，冷卻后每個稀釋度取0. Iml涂布在固氮菌分離培養(yǎng)基平板上，29°C靜置培養(yǎng)。2 3d待菌落形成后，在改良的ACCC55固氮菌培養(yǎng)基平板上用平板劃線法進行菌種純化。二、ACC脫氨酶陽性菌株篩選對步驟一所得的大豆根際固氮菌進行ACC脫氨酶陽性菌株篩選，具體方法如下所述把分離到的內(nèi)生固氮菌，接入5mL液體無氮培養(yǎng)基中，30°C、200r/min振蕩培養(yǎng)Mi ；吸取上述培養(yǎng)液0. ImL接種至5mL DF培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)24h ；吸取上述培養(yǎng)液0. ImL接種至5mL ADF培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)M 48h ；將在ADF中生長的菌種重復(fù)轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)，并以ADF培養(yǎng)基作為陰性對照，能夠以ACC為唯一氮源生長的菌株為ACC脫氨酶陽性菌株。將篩選所得的一株ACC脫氨酶陽性菌株命名為大豆根際固氮菌GD571。三、大豆根際固氮菌⑶571的鑒定從以下幾個方面鑒定步驟一和二分離純化并篩選得到的大豆根際固氮菌⑶571 1、形態(tài)學(xué)鑒定將處于對數(shù)生長期，且菌落大小穩(wěn)定，上述步驟一分離并純化得到的固氮菌⑶571 進行單菌落狀態(tài)描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī)則、放射狀等)。對于處于對數(shù)生長期的所述固氮菌⑶571，經(jīng)涂片染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察菌體的形態(tài)。結(jié)果表明，上述步驟一和二分離純化并篩選得到的固氮菌GD571菌落圓形臍狀凸起，乳白色，有光澤，表面光滑濕潤，邊緣整齊；菌體卵圓形，0.5X1. 0 μ m，革蘭氏陰性。2、生理生化特征分析參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊.北京科學(xué)出版社，2011.)和《微生物學(xué)實驗》(沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實驗(第三版).北京高等教育出版社，1999.)測定上述固氮菌⑶571的生理生化特征。所述固氮菌⑶571的生理生化特征測定結(jié)果如下接觸酶反應(yīng)陰性氧化酶反應(yīng)陰性生長溫度4°C生長，28°C生長，37°C生長，60°C不生長耐鹽性試驗:2% NaCl生長，5% NaCl不生長，7% NaCl不生長，10% NaCl不生長苯丙氨酸脫氨酶試驗陰性利用檸檬酸鹽陽性水解淀粉陰性卵黃卵磷脂酶陽性甲基紅試驗陽性
V. P試驗陽性PH 5. 7生長陽性糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸葡萄糖陽性，甘露醇陽性，乳糖陽性，蔗糖陽性3、16s rDNA序列同源性分析常規(guī)方法培養(yǎng)上述步驟一和二分離純化并篩選得到的固氮菌⑶SD571， 提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，以細菌16s rDNA通用引物，27f 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘ , 1492r 5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘進行 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系采用上海生物工程有限公司PCR擴增試劑盒。反應(yīng)程序為95°C變性30s、 55°C退火lmin、72°C延伸2min，共30個循環(huán)。DNA測序由北京三博遠志生物技術(shù)公司完成， 序列拼接及相似性分析使用DNAMar軟件完成，序列比對通過美國國家生物技術(shù)信息中心 NCBI 數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)在線完成。大豆根際固氮菌⑶571菌株16s rDNA的序列詳見序列表中序列1。4、生長特性分析進行了菌株最適溫度和最適pH生長實驗。采用無氮培養(yǎng)基，分別在4°CJ8°C、 37°C、60°C培養(yǎng)、觀察、記錄菌株的溫度適應(yīng)性，每個處理3次重復(fù)。調(diào)整酸度分別為pH3、 pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pHIO、pHll，每個處理3次重復(fù)，培養(yǎng)、觀察、記錄菌株生長的最適pHo結(jié)果表明，所述大豆根際固氮菌⑶571的最適生長溫度為^°C，最適生長pH為 pH7 8。鑒于上述形態(tài)、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析結(jié)果，將步驟一和二分離純化并篩選得到的大豆根際固氮菌GD571鑒定為變型細菌β亞群伯克霍爾德氏菌科伯克霍爾德氏菌屬(BurWiolderia sp.)。該大豆根際固氮菌⑶571已于2011年7月6 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 5039。實施例2、伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039固氮酶活性測定對實施例1所得到的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039 進行固氮酶活性測定，具體方法如下所述在15X150mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培養(yǎng)基制成斜面，接種伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039J8°C培養(yǎng)。同時以微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌(AzotcAacter chroococcum)ACCCl 1103 為陽性對照，不接種空白斜面為陰性對照，設(shè)3個重復(fù)。培養(yǎng)7 后，換橡膠塞，注入乙炔氣體使終濃度為10 %，用醫(yī)用膠布密封，繼續(xù)培養(yǎng)72h，取100 μ 1反應(yīng)氣體，用氣相色譜儀測定乙烯生成量，根據(jù)以下公式計算菌株(伯克霍爾德氏菌(Burid10Ideria sp.)⑶571 CGMCC No. 5039 或圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCCl 1103)的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg *h) = C2H4nmol/[菌體蛋白量(mg) X反應(yīng)時間(h)]，其中C2H4nmol = IOOOXC2H4 體積(μ 1) X 273 X P/[22. 4 X (273+t) X 760]，其中 P 為氣壓(mm 汞柱)，t 為反應(yīng)溫度CC )。其中，菌體蛋白含量測定方法如下所述用5ml生理鹽水將試管斜面上的菌苔洗入離心管中，收集菌體(伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039或圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103)，向沉淀中加入 3ml 0. 5M 的 NaOH沸水煮沸5min，加入:3ml 0. 5M的HCl混合，離心后取上清1. 0ml，加入5ml考馬斯亮藍溶液，在漩渦混合器上混合，顯色3min，測定595nm處的吸光值A(chǔ)595，根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌體蛋白含量。結(jié)果顯示，篩選到的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039 的固氮酶活性為32. 268nmol C2H4/h · mg蛋白，統(tǒng)計分析顯著高于微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌ACCCl 1103的固氮酶活性25. lOOnmol/h ^mg蛋白，如圖1所示。這一結(jié)果表明，本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039能高效固氮。實施例3、伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039拮抗病原真菌抑菌率測定采用兩點對峙法對實施例1所得到的伯克霍爾德氏菌(Burldiolderia sp.) GD571CGMCC No. 5039進行拮抗病原真菌抑菌率測定，具體操作如下所述在PDA平板上距離中心2cm的兩點上分別接種作物赤霉病菌(Gibberella zeae)(或者菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum),或者棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae))禾口伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039，每個篩選處理3個重復(fù)，以只接病原真菌不接伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp.)GD571 CGMCC No. 5039的平板為對照。恒溫培養(yǎng)，15d后用毫米刻度尺測量對峙平板上病原真菌沿被測伯克霍爾德氏菌 (Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039方向的菌落半徑巧、及對照平板上病原真菌的菌落半徑4。病原真菌生長抑制率(％)=(對照半徑Α-對峙培養(yǎng)病原真菌菌落半徑Γι)/ 對照半徑rQ X 100%。結(jié)果顯示，赤霉病菌(Gibberella zeae)的r。是63. 3士2. Smnur1 是33· 9士2. 3mm ； 菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的 r0 是 63. 0 + 2. lmm, T1 是 31. 3 + 2. 5mm ；棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)的 rQ 是 41. O士 1. 9mm，巧是 25. O士 1. 5mm。將平均值代入上述公式計算得所述伯克霍爾德氏菌(Burldiolderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039對赤霉病菌(Gibberella zeae)的抑菌率為46. 45 %，如圖2所示；對菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率為50. 32 %，如圖3所示；對棉花黃萎病菌 (Verticillium dahliae)的抑菌率為39. 02%，如圖4所示。這一結(jié)果表明所述伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)GD57ICGMCC No. 5039可以有效拮抗作物赤霉病菌(Gibberella zeae)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)禾口棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。實施例4、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp. )GD571 CGMCC No. 50391-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶活性測定對實施例1所得到的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039 進行ACC脫氨酶活性測定，具體方法如下所述以圓褐固氮菌(AzotcAacter chroococcum) ACCCl 1103作為對照組，實施例1篩選所得的伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039作為實驗組。用5ml無氮液體培養(yǎng)基活化菌株，吸取0. 5ml培養(yǎng)液接種到60ml培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)24 48h，4°C、8000rpm離心IOmin收集菌體，用15ml不含 (NH4)2SO4的DF液體培養(yǎng)基離心洗滌菌體2次，將菌體重懸于2細1 ADF培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)Mh，收集并記錄菌體重量。用0. IM Tris-HCl緩沖液(pH 7. 6)離心洗滌菌體2次，將菌體平均分在3個EP管中，-20°C貯存。取貯存菌體重懸于Iml 0. IM Tris-HCl緩沖液(pH7. 6)，12000rmp 離心 5min 收集菌體，重懸于 600 μ 10. IM Tris-HCl 緩沖液(ρΗ 8. 5)中，加入30 μ 1甲苯，迅速振蕩30s破碎細胞，取100 μ 1粗酶液4°C貯存，用于測定蛋白濃度；其余粗酶液進行ACC脫氨酶活性測定。取粗酶液200 μ 1加入20 μ 1濃度為0. 5Μ的ACC溶液混勻，置于30°C水浴反應(yīng)15min，加入Iml 0. 56MHC1終止反應(yīng)，12000rmp離心5min，取上清 lml，加入 800 μ 1 0. 56Μ HCl 和 300 μ 1 0. 2% 2，4-二硝基苯胼溶液 QM HCl 中溶解)，30°C 保溫30min ；加入aiil 2M NaOH混勻，540nm測吸光度值。對照α-酮丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線和蛋白測定標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌株的酶活性。ACC脫氨酶表示方法為反應(yīng)條件下，每毫克菌體蛋白每小時催化ACC脫氨形成α-丁酮酸的微摩爾數(shù)，單位是(μ mol α - 丁酮酸/h · mg蛋白)。 蛋白質(zhì)測定方法同實施例2。測定結(jié)果為3次重復(fù)平均值。 結(jié)果顯示，所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)GD571 CGMCC No. 5039 的ACC脫氨酶活性為5. 393 μ mol α-丁酮酸/h Ig蛋白，遠高于對照組圓褐固氮菌 (Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103的酶活性，如圖5所示。這一結(jié)果表明，所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)⑶571 CGMCC No. 5039具有ACC脫氨酶活性，進而可以提高作物抵御干旱、淹水、高溫、機械損傷、病蟲害侵襲或重金屬污染等逆境條件的潛能。
權(quán)利要求
1.伯克霍爾德氏菌(Burlcholderiasp.)⑶571，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5039。
2.一種菌劑，它的活性成分為權(quán)利要求1所述的伯克霍爾德氏菌(Buricholderia sp.) GD571 CGMCC No. 5039。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于所述菌劑為下述1)-9)中任一的菌劑1)用于抑制病原真菌的菌劑；2)用于防治植物真菌病害的菌劑；3)用于固氮的菌劑；4)促進植物生長的菌劑；5)抑制植物產(chǎn)生乙烯的菌劑；6)降低植物對逆境敏感性的菌劑；7)提高植物抗逆性的菌劑；8)產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的菌劑；9)產(chǎn)生固氮酶的菌劑。
4.權(quán)利要求1所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp. )GD571 CGMCC No. 5039在制備下述1)-9)中任一的菌劑中的應(yīng)用1)用于抑制病原真菌的菌劑；2)用于防治植物真菌病害的菌劑；3)用于固氮的菌劑；4)促進植物生長的菌劑；5)抑制植物產(chǎn)生乙烯的菌劑；6)降低植物對逆境敏感性的菌劑；7)提高植物抗逆性的菌劑；8)產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶的菌劑；9)產(chǎn)生固氮酶的菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的菌劑或權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述病原真菌為引起赤霉病的真菌、或為引起菌核病的真菌、或為引起黃萎病的真菌；所述植物真菌病害為赤霉病、菌核病或黃萎病；所述逆境為干旱、淹水、高溫、機械損傷、病蟲害侵襲或重金屬污染。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑或應(yīng)用，其特征在于所述引起赤霉病的真菌為玉米赤霉菌(Gibberella zeae)或禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)；所述引起菌核病的真菌為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)；所述引起黃萎病的真菌為棉花黃萎病菌 (Verticillium dahliae)。
7.權(quán)利要求1所述的伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp. )GD571 CGMCC No. 5039或權(quán)利要求2、3、5或6所述的菌劑在生產(chǎn)固氮酶或1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶中應(yīng)用；或，權(quán)利要求1所述的伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039或權(quán)利要求2、3、5或6所述的菌劑在制備生物有機肥中的應(yīng)用。
8.含有權(quán)利要求1所述伯克霍爾德氏菌(BurWiolderiasp. )GD571 CGMCC No. 5039或權(quán)利要求2、3、5或6所述的菌劑的生物有機肥。
9.培養(yǎng)伯克霍爾德氏菌(Burkholderiasp. )GD571 CGMCC No. 5039的方法，包括將伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039在用于培養(yǎng)伯克霍爾德氏菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
10.權(quán)利要求2、3、5或6所述菌劑的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1所述的伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia sp. )GD571 CGMCC No. 5039作為活性成分，得到所述菌劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了產(chǎn)ACC脫氨酶并拮抗多種病原真菌的大豆根際固氮菌及其用途。該大豆根際固氮菌是伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)GD571，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No.5039。本發(fā)明所提供的伯克霍爾德氏菌(Burkholderia sp.)GD571 CGMCC No.5039具有較高的固氮活性，具有ACC脫氨酶活性，可以有效拮抗作物赤霉病菌(Gibberella zeae)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)，在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A01P21/00GK102286402SQ201110197670
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者孫建光, 徐晶, 胡海燕, 高淼 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所