專利名稱:川草二號老芒麥轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專利涉及一種川草二號老芒麥(Elymus sibiricus L.‘chuancao No.2’)抗蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域：
或植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
牧草是草食動物的主要飼料來源，也是發(fā)展畜牧業(yè)的前提。但近年來，由于草地退化和荒漠化，再加上蝗災(zāi)的危害，致使川西北草地的生態(tài)環(huán)境更為惡化，嚴重的影響了我國西部地區(qū)畜牧業(yè)的發(fā)展。草原的過度開發(fā)利用和蝗災(zāi)，是草原生態(tài)系統(tǒng)惡化的主要因素。造成蝗蟲危害的主要原因有以下幾個方面1)環(huán)境因素干旱有利蝗蟲的發(fā)生，荒漠化增加了蝗蟲產(chǎn)卵繁殖場所；2)天敵減少化學(xué)防治大量殺傷了蝗蟲天敵；3)生態(tài)破壞過渡放牧，草原嚴重退化、沙化，導(dǎo)致生物多樣性減低，蝗蟲天敵種類、數(shù)量劇減；4)技術(shù)局限滅菌技術(shù)手段單一，抗蟲品種缺乏。這些因素增加了對蝗蟲危害控制的難度，而現(xiàn)在普遍采用的化學(xué)防治方法，只能治標不能治本，還會帶來環(huán)境污染等諸多社會公害，因此尋求生物防治和培育抗蟲植物就顯得十分重要。目前，在抗蟲基因工程中使用的抗蟲基因有三大類一是從微生物蘇云金桿菌(Bacillus thuringiensis.B.T)分離出的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystalProtein，ICP)基因，簡稱Bt基因；二是從植物中分離出的蛋白酶抑制劑基因；三是植物外源凝集素基因(Lectin gene)。其中，殺蟲結(jié)晶蛋白基因和蛋白酶抑制劑基因應(yīng)用的較為普遍。1985年，Vasil在國際草原學(xué)大會上第一次提出利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將其它來源的特定基因?qū)肽敛莸目尚行?，為基因工程技術(shù)改良牧草，包括改善牧草營養(yǎng)品質(zhì)，提高產(chǎn)量和利用率，增加牧草對逆境的適應(yīng)能力，增強對各種蟲害、病害的抗性等奠定了理論基礎(chǔ)。
自1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草(Zambrysh，1983)誕生以來，植物轉(zhuǎn)基因研究和應(yīng)用發(fā)展迅速。到1997年為止，全世界轉(zhuǎn)基因植物涉及到至少35科的200多個種，涵蓋了絕大多數(shù)主要經(jīng)濟作物、觀賞植物、藥用植物、蔬菜、果樹、樹木和牧草(Birch，1997).截止1999年，至少30個國家進行了總計三萬次以上的轉(zhuǎn)基因作物的田間試驗，改良的經(jīng)濟性狀有十多個已有大豆、玉米、棉花、油菜、蕃茄、馬鈴薯、煙草、西葫蘆和蕃木瓜等九種作物的轉(zhuǎn)基因品種投入了商業(yè)化生產(chǎn)。1999年，全球轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化種植面積達到3990萬公頃，創(chuàng)造商業(yè)收入21-23億美元，比1998年分別增加1210萬公頃和5-7億美元(James，1999)。2000年全球轉(zhuǎn)基因作物品種商業(yè)化種植面積為4420萬公頃，預(yù)計市場銷售收入將達到30億美元(James，2000)。
目前，植物轉(zhuǎn)基因已成為植物分子生物學(xué)研究的強有力的實驗手段；更是基因克隆、功能基因組研究必不可少的實驗工具。一大批外源目的基因得到分離和克隆，并被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物研究。以基因槍和農(nóng)桿菌為主導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系日臻完善。到2000年底為止，已有50多個種的植物得到轉(zhuǎn)化并獲得再生植株。
20世紀80年代以來，我國的植物基因工程研究也發(fā)展很快，尤其是農(nóng)業(yè)生物基因工程技術(shù)發(fā)展迅速。目前報道的轉(zhuǎn)基因牧草主要有苜蓿、多年生黑麥草(Lolium perenne L.)、中華結(jié)縷草(Zoysia sinica Steud.)及草地早熟禾(Poa pratensis L.)等少數(shù)品種，而且研究主要集中在提高其抗逆性和品質(zhì)的改良上，而利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育抗蟲牧草品種，國內(nèi)外的研究都比較少。
川草二號老芒麥(Elymus sibiricus L.‘chuancao No.2’)是我國優(yōu)良的多年生栽培牧草，對川西北高原寒溫草甸環(huán)境有極強的適應(yīng)性，并能在低熱量條件下正常開花結(jié)實，是川西北牧區(qū)建設(shè)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)打貯草基地的主要栽培草種。但在推廣過程中發(fā)現(xiàn)該優(yōu)良牧草是蝗蟲主要取食牧草。一般年份，因蝗蟲危害減少10-20％。若遇蝗蟲爆發(fā)，基本無收。故蝗蟲危害嚴重，是推廣應(yīng)用后保持草場穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的一大障礙，也是急待解決的技術(shù)難題。
本實驗室克隆到一種類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)殺蟲蛋白基因，命名為ppIP，該基因在大腸桿菌中能夠表達有活力的蛋白質(zhì)，對蝗蟲有很好的殺滅效果(楊志榮，朱文，葛紹榮等，類產(chǎn)堿假單胞菌防治草地蝗蟲的研究[J]。中國生物防治，1996，12(2)55-57；劉世貴，朱文，楊志榮等，一株蝗蟲病原菌的分離與鑒定[J]。微生物學(xué)報，1994，3586-90)。該殺蟲蛋白與蘇云金桿菌伴孢晶體相比較，存在著顯著的差異性，且不易被蝗蟲體內(nèi)蛋白酶降解，因此，類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白是一種新的更為安全的細菌殺蟲蛋白(張文，楊志榮，朱文等。類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲物質(zhì)的分離純化和鑒定[J]。微生物學(xué)報，1998，3857-62；楊志榮，朱文，葛紹榮等。中國生物防治[J]，1996，12(3)114-116)。而有關(guān)類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白基因克隆及轉(zhuǎn)基因植物的研究，國內(nèi)外均未見報道。
利用基因工程培育和改良禾本科牧草品種是一種便捷和實用的途徑，而且農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)已趨成熟，該方法具有操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、較少的插入拷貝數(shù)以及整合機制相對簡單等優(yōu)點，被植物轉(zhuǎn)基因工作者廣泛推崇。但由于禾本科植物自身的特點，許多牧草植物組織培養(yǎng)和再生體系的建立和完善較為困難，而禾本科草的轉(zhuǎn)基因操作和應(yīng)用研究難度更大。針對于此，本研究對禾本科牧草的組織培養(yǎng)和植株再生進行了探索性研究，在此基礎(chǔ)上，建立了老芒麥的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期為其轉(zhuǎn)基因操作奠定良好的基礎(chǔ)；同時，將類菌殺蟲蛋白基因?qū)氪ú荻柪厦Ⅺ?，以提高其在病害環(huán)境中的生存能力，為畜牧業(yè)的發(fā)展提供保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及川草二號老芒麥轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)，抗蟲轉(zhuǎn)基因川草二號老芒麥(Elymussibiricus L.‘chuancao No.2’)新材料的創(chuàng)建。該殺蟲蛋白基因來自類產(chǎn)堿假單孢菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)，該基因轉(zhuǎn)入川草二號老芒麥基因組后，能夠編碼殺蟲蛋白質(zhì)，對直翅目蝗蟲有致死作用。
蝗蟲屬直翅目(Orthoptera)蝗科(Locustidae)，是一種世界性的有害昆蟲。在我國是全國性分布和危害。尤其以北方最為嚴重，在北方草原，以其“種類多、數(shù)量大、分布廣、危害重”等特點成為草地第一害蟲，僅北方草原和青藏高原草地，每年發(fā)生并危害的面積近1000萬公頃，嚴重危害牧草生長，使草地產(chǎn)草量下降30-70％(李克夫、馬耀，杜文亮，中國草地[J]，1992，(1)50-52。)，造成巨大經(jīng)濟損失?；认x的危害還是導(dǎo)致草地退化、沙化、自然生態(tài)環(huán)境條件惡化等的重要因素之一。
1991年在重慶市歌樂山林場發(fā)現(xiàn)了許多黃脊竹蝗(Ceracris kiangsu)的自然病死蟲，從蟲尸內(nèi)分離到一種病原菌，經(jīng)回復(fù)感染原宿主，能引起原宿主致病并死亡，從蟲尸體中分離到同樣的病原菌，證明該病原菌為蝗蟲自身的致病菌。經(jīng)感染主要草地害蟲的初步試驗結(jié)果表明，該病原菌對多種草地蝗蟲具有較高的感染力，5天的致死率高達90％以上，對草地的草原毛蟲(Gynephorap runergensis)、粘蟲(Leucania separata)也有一定的感染力。并對多種草地蝗蟲有較強的感染力該菌株經(jīng)鑒定為類產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(劉世貴，朱文，楊志榮，等。微生物學(xué)報[J]，1995，35(2)86-89)。
近年來對其殺蟲致死機理、殺蟲蛋白(張文，楊志榮。微生物學(xué)報[J]，1998，38(1)57-62)、安全性(楊志榮，朱文，葛紹榮等。中國生物防治[J]，1996，12(3)114-116)等方面進行了深入研究，證明該菌對蝗蟲致病，是由于其代謝產(chǎn)生的一種殺蟲蛋白所致。該蛋白分子量為25100Da，在國內(nèi)外屬首次報道。經(jīng)研究表明該菌無芽孢，本身具有較強毒蛋白，故具有構(gòu)建成為遺傳工程菌廣泛用于生物防治的潛力。
老芒麥(Elymus sibiricus L.)是我國優(yōu)良的多年生栽培牧草，以刈割與放牧為主，也用于天然草原的補播改良。根據(jù)多年對不同地域老芒麥的系統(tǒng)觀察，發(fā)現(xiàn)本地原產(chǎn)類型對川西北高原寒溫草甸環(huán)境有極強的適應(yīng)性，并能在低熱量條件下正常開花結(jié)實。但也發(fā)現(xiàn)在本地域作為人工栽培的本地老芒麥存在的問題，如播種當(dāng)年生長緩慢，盛產(chǎn)年產(chǎn)量低，(一般利用3-4年)等等。針對這些存在問題，選育的優(yōu)質(zhì)品種川草二號老芒麥(Elymus sibiricus L.‘chuancao No.2’)系四川省草原研究所以阿壩本地老芒麥為原始材料，采用系統(tǒng)選擇方法和規(guī)范的育種程序，經(jīng)過10年的努力，選育成功的多年生禾草新品種，分別于1990、1991年經(jīng)農(nóng)業(yè)部全國牧草品種審定委員會評審?fù)ㄟ^，獲《中國牧草品種合格證書》。川草二號老芒麥是適合川西北牧區(qū)建設(shè)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)打貯草基地的主要栽培草種。但該牧草蝗蟲危害嚴重，是推廣應(yīng)用后保持草場穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的一大障礙，也是急待解決的技術(shù)難題。
本發(fā)明的一個目的就是建立川草二號老芒麥轉(zhuǎn)抗蟲基因技術(shù)體系。
具體地，就是建立川草二號老芒麥愈傷組織再生系統(tǒng)，利用具有自主知識產(chǎn)權(quán)的類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)化川草二號老芒麥愈傷組織的表達載體，然后對轉(zhuǎn)化后愈傷組織進行抗性篩選和分化，再生出植株，從而創(chuàng)建抗蝗蟲轉(zhuǎn)基因川草二號老芒麥。
本發(fā)明所需的類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白基因的克隆和類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白的分離純化及方法詳見本實驗室的另一專利-類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白基因(公開號CN 1616486A)。該殺蟲蛋白基因能夠在大腸桿菌中進行表達，其表達產(chǎn)物對直翅目昆蟲有毒殺作用。該殺蟲蛋白基因可以不經(jīng)改造，利用全長的野生型基因或只用其5’端314-1078核苷酸共765bp的毒性區(qū)序列，均可直接用于植物細胞核轉(zhuǎn)化。同時對基因序列進行人工改造，并選擇適宜的表達載體，可顯著提高其表達量或殺蟲效果。
本發(fā)明所需的表達載體是已知的，為一種雙元載體pCAMBIA1304。在進行植物轉(zhuǎn)化時，可將該基因插入到單子葉植物通用的質(zhì)粒pCAMBIA1304上，并在植物基因啟動子的驅(qū)動下，其T-DNA可定點插入植物基因組中。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種生產(chǎn)抗蟲的轉(zhuǎn)基因單子葉植株的方法，包括川草二號老芒麥愈傷組織再生系統(tǒng)的建立方法和殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)化單子葉植物的程序。
將外源基因?qū)胫参锏姆椒ㄊ且阎?，可使用該方法將類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白基因構(gòu)建體插入植物宿主細胞，所述方法包括生物和物理植物轉(zhuǎn)化法，例見Niki等，1993，“將外源DNA導(dǎo)入植物的方法”，植物分子生物學(xué)和生物技術(shù)方法，Glick和Thompson編，CRC出版公司，Boca Raton，p67-88。選定的方法隨宿主植物的不同而不同，包括化學(xué)轉(zhuǎn)染法如磷酸鈣，微生物指導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移如農(nóng)桿菌(Horsch等，科學(xué)，2271229-31，1985)，電穿孔，顯微注射，基因槍和biolistic轟擊。但通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，把殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)入單子葉植物，創(chuàng)建抗蟲轉(zhuǎn)基因川草二號老芒麥，這在國內(nèi)外尚屬首次。
單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化是否成功的關(guān)鍵之一就是建立其高效而穩(wěn)定的愈傷組織再生系統(tǒng)。本發(fā)明通過選擇適宜的外植體材料，優(yōu)化影響川草二號老芒麥出愈和分化的各種參數(shù)，首次建立了高效而穩(wěn)定的川草二號老芒麥愈傷組織再生系統(tǒng)，為其遺傳轉(zhuǎn)化提供了保障。



圖1是pCAMBIA1304-ppIP轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建圖2是pCAMBIA1304-ppIp轉(zhuǎn)化載體的驗證M1和M2為DNA marker，1是pUC18-ppIP質(zhì)粒的PCR片段，2是pCAMBIA1304質(zhì)粒PCR，3～6是pCAMBIA1304-ppJP質(zhì)粒的PCR片段，7是pCAMBIA1304-ppIP質(zhì)粒NcoI和Bst EII雙酶切片段，8是pCAMBIA1304-PPIP質(zhì)粒。
圖3是轉(zhuǎn)化植株的PCR驗證1和15Marker；2-9是轉(zhuǎn)化植株植株(引物為SCF和SCR)；10是非轉(zhuǎn)化植株(引物為SCF和SCR)；11和13是轉(zhuǎn)化植株(引物為hptII F和hptII R)；12和14是非轉(zhuǎn)化植株(引物為hptII F和hptII R)。
圖4是轉(zhuǎn)化植株的Southern雜交鑒定1-6是轉(zhuǎn)化植株，其中3號插入了3個拷貝，4號植株呈陰性，7是非轉(zhuǎn)化植株圖5是轉(zhuǎn)化植株的Northern雜交鑒定1-6為轉(zhuǎn)化陽性植株，其中4號植株Northern雜交為陰性，7是非轉(zhuǎn)化植株圖6是川草二號老芒麥抗性愈傷組織的再生過程A成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織；B潮霉素篩選后的抗性愈傷組織；C和D抗性愈傷組織的分化和再生具體實施方式
下文將通過實施例對本發(fā)明做進一步說明，但實施例不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1川草二號老芒麥愈傷組織再生系統(tǒng)的建立1.1外植體準備將成熟種子經(jīng)過兩次溫水浸泡和陰干后，剝?nèi)ネ鉂}殼后，用70％乙醇浸泡90s，再轉(zhuǎn)入0.1％升汞浸泡15min，中間搖動2-3次，用無菌水沖洗3-4次，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)基上生長5d后，取下胚軸(3-5mm)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)。在培養(yǎng)基上生長10d后，取其幼葉(3-5mm)于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)。待長出愈傷組織后，接到繼代培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每2周繼代一次。當(dāng)愈傷組織形成大量結(jié)構(gòu)致密、顆粒狀、黃白色的胚性愈傷組織后，可將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基上。經(jīng)過6-8周培養(yǎng)后，長出1-2cm的幼苗，再將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基。待苗長大并長出根后經(jīng)2-3天的溫室煉苗后移植到土中。
愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)在黑暗中進行，愈傷組織的分化和幼苗生根培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為25-26℃，每日光照12h，光強20001x。愈傷組織誘導(dǎo)和分化頻率的計算為1.2愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選選用單子葉植物愈傷誘導(dǎo)常用的MS，MSN6，N6和NB四種基本培養(yǎng)基，在其愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，分別接種120粒成熟的牧草種子，并設(shè)置三個重復(fù)，30天后計數(shù)每種培養(yǎng)基的出愈數(shù)，計算其出愈率。
1.32，4-D濃度和不同外植體的選擇設(shè)置2mg/L、5mg/L、8mg/L1和10mg/L四個不同的2，4-D濃度，在MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，分別對牧草品種的成熟胚、幼葉和下胚軸進行愈傷組織誘導(dǎo)，以期對不同材料的愈傷誘導(dǎo)尋求一個較為適宜的激素濃度。
1.4添加植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織誘導(dǎo)的影響分別在MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加NAA、6-BA、KT和ABA四種植物激素和CH有機物，設(shè)置三個重復(fù)，每個接種120粒外植體，培養(yǎng)20天后觀察出愈情況，并計算出愈率，篩選適宜老芒麥和披堿草出愈的激素種類和有機物。實驗結(jié)果表明，2，4-D和KT是川草二號老芒麥愈傷組織再生的必須生長調(diào)節(jié)劑。單獨使用2，4-D或其它的植物生長調(diào)節(jié)劑，川草二號老芒麥的出愈率極低或不出愈，并且難以分化。愈傷組織誘導(dǎo)的最佳的激素組合為5.0mg/L2，4-D和0.05mg/LKT；而愈傷組織分化的最佳激素組合為1.Smg/L2，4-D和0.1mg/LKT。所以愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基并添加5.0mg/L2，4-D和0.05mg/L，出愈率可達到85.6％，而最適的分化培養(yǎng)基為1/2MS鹽添加1.5mg/L2，4-D和o.1mg/LKT，約有54.3％的愈傷組織能分化出芽并生根。
1.5光照對種子出愈率的影響在MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上分別接種120枚牧草的成熟胚、幼葉和下胚軸，設(shè)置三個重復(fù)，分別在光下和黑暗兩種條件下培養(yǎng)30天，觀察外植體的出愈情況，根據(jù)出愈率確定外植體出愈的光照條件。
1.6愈傷組織分化培養(yǎng)基的篩選在MS，N6，MSN6和NB四種不同的基本培養(yǎng)基上，分別接種50粒質(zhì)地基本一致的胚性愈傷組織，設(shè)置三個重復(fù)，在25-26℃，光強20001x條件下，每日光照12h，培養(yǎng)30天，觀察愈傷組織的分化情況，選擇適宜愈傷組織分化的培養(yǎng)基。
1.7愈傷組織繼代培養(yǎng)時間對其分化能力的影響在愈傷組織易分化的培養(yǎng)基MS和MSN6培養(yǎng)基上，分別接種50粒質(zhì)地基本一致的胚性愈傷組織，觀察繼代培養(yǎng)20天、40天、60天、80天和100天后，愈傷組織的分化情況，根據(jù)分化率來確定愈傷組織的繼代時間。
1.8植物生長調(diào)節(jié)劑對愈傷組織分化能力的影響在MS分化培養(yǎng)基里分別添加不同濃度的NAA、KT和NAA與KT組合，觀察每種組合愈傷組織的分化率，以確定添加物的種類和濃度。同時，研究減少蔗糖和MS濃度對老芒麥愈傷組織分化率的影響。
實驗結(jié)果表明，光線和繼代時間對愈傷組織的誘導(dǎo)和分化產(chǎn)生影響。暗培養(yǎng)有利于愈傷組織的誘導(dǎo)，光線則利于愈傷組織的分化。剛誘導(dǎo)出的愈傷組織分化能力很弱，繼代一定時間后，愈傷組織分化為不同類型的愈傷組織，其中質(zhì)地緊密，顆粒狀，黃色愈傷組織分化能力最強，而其他類型分化能力很弱甚至不分化。同時實驗表明，在愈傷組織誘導(dǎo)和分化時，添加一定濃度的酪蛋白，可以有效的改善愈傷組織的質(zhì)量；在愈傷組織分化時，降低培養(yǎng)基中無機鹽特別是鈣離子的濃度，可以促進愈傷組織的分化。
1.9川草二號老芒麥組培體系的建立經(jīng)過篩選和優(yōu)化，建立了川草二號老芒麥組培體系的最佳方案愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方(暗培養(yǎng)40d)MS+2，4-D5.0mg/L+CH600mg/L+KT0.05mg/L+3％Sucrose+1.0％瓊脂，pH5.8愈傷組織繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方(暗培養(yǎng)，每4周繼代一次，共2次)MS+2，4-D5.0mg/L+CH600mg/L+KT0.05mg/L+3％Sucrose+1.0％瓊脂，pH5.8愈傷組織預(yù)分化的培養(yǎng)基配方(暗培養(yǎng)1周)MS+KT0.1mg/L+2，4-D1.5mg/L+2％Sucrose+1％瓊脂，pH5.8愈傷組織分化的培養(yǎng)基配方(26℃，2000Lux，光照培養(yǎng)4周)1/2MS+KT0.1mg/L+2，4-D1.5mg/L+IBA0.5mg/L+2％Sucrose+1％瓊脂，pH5.8生根培養(yǎng)基的配方(26℃，2000Lux，光照培養(yǎng))1/2MS+NAA2.0mg/L+2％Sucrose+1％瓊脂，pH5.8
在此組培體系下，老芒麥成熟胚的出愈率可達到85％以上，分化率在50％以上，移栽成活率達到45％以上(再生過程見附圖3)。
實施例2川草二號老芒麥程序化轉(zhuǎn)基因體系的建立。
2.1川草二號老芒麥轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1304-ppIP的構(gòu)建。
使用primer premier 5.0分別設(shè)計含有NcoI和Bst EII的正向和反向引物，以含有殺蟲蛋白基因的pUC18質(zhì)粒為模板，probestTMDNA聚合酶，通過PCR高保真克隆出包含殺蟲蛋白基因信號肽序列和UTR序列的目的片斷。用核酸內(nèi)切酶NcoI和Bst EH對pCAMBIA1304質(zhì)粒載體和從PUC18-scp質(zhì)粒上高保真擴增出的ppIP片段進行雙酶切，電泳回收pCAMBIA1304質(zhì)粒載體約10kb片段和ppIP雙酶切后的約900bp的片段。加T4連接酶，以約2∶1的比例加入雙酶切后得到的ppIP片段和pCAMBIA1304質(zhì)粒載體，使連接體系內(nèi)DNA量達到約10ng/ul，20℃連接4h以上，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選有KM抗性的菌落，然后挑選抗KM的單菌落，提取質(zhì)粒，通過雙酶切和PCR來驗證PPIP片段是否連接到pCAMBIA1304質(zhì)粒上(具體的構(gòu)建方法和驗證見附圖1)。
2.2農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化2.2.1大腸桿菌CaCl2法感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Esherichia coli)DH5α感受態(tài)細胞的制備。LB平板上挑取DH5α單菌落，在2ml LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。取0.5ml培養(yǎng)物，加入50ml LB培養(yǎng)基中28℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.5。加入1.5ml離心管中，4℃離心收集菌體。用500μl 0.1mol/L冰CaCl2重懸，冰浴30分鐘后再離心，用200μl 0.1mol/L冰CaCl2重懸，于0℃保存30分鐘至24小時后用于轉(zhuǎn)化。
大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。在200μl感受態(tài)細胞中加入5-10μl質(zhì)粒，冰浴30分鐘后，迅速放入42℃水浴中熱激2分鐘，迅速取出后0℃放置2分鐘。然后加入800μl LB，37℃培養(yǎng)1小時。最后離心2分鐘，將菌體涂布于LB+抗生素的平板上，37℃培養(yǎng)過夜。
2.2.2農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化(王關(guān)林等，植物基因工程原理與技術(shù)，科學(xué)出版社，1999).
根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，感受態(tài)細胞的制備。根癌農(nóng)桿菌菌液于28℃培養(yǎng)至OD600≈0.5時，4℃離心收集菌體，用0.1mol/L冰CaCl2重懸，冰浴30分鐘后離心，用0.1mol/L冰CaCl2重懸后，于0℃保存。
凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。在200μl感受態(tài)細胞中加入5-10μl質(zhì)粒，冰浴30分鐘后，在液氮中速凍1-2分鐘，迅速取出，放入37℃水浴中溶解。溶解完全后加入800μl LB，28℃培養(yǎng)3～5小時。最后離心2分鐘，將菌體涂布于LB+利福平(40mg/L)+鏈霉素(25mg/L)+卡那霉素(75mg/L)平板上，28℃培養(yǎng)2天。
2.3通過愈傷組織轉(zhuǎn)化川草二號老芒麥2.3.1潮霉素(Hn)有效篩選濃度的試驗設(shè)置20mg/L、40mg/L、60mg/L和80mg/L四個潮霉素濃度處理，每個處理接入100個左右長勢旺的胚性愈傷組織。26.0℃暗培養(yǎng)10d后，觀察愈傷組織生長情況，選擇合適的潮霉素篩選濃度。實驗結(jié)果顯示，60mg/L和80mg/L潮霉素濃度造成老芒麥愈傷組織迅速死亡，而細胞在死亡過程中會分泌大量的有毒次生代謝物質(zhì)，因此在選擇培養(yǎng)基上使用這個潮霉素濃度篩選轉(zhuǎn)化細胞，勢必造成轉(zhuǎn)化細胞的生長受抑制，影響轉(zhuǎn)化效率。20mg/L潮霉索不能有效抑制老芒麥愈傷組織生長，若用于抗性愈傷組織篩選，容易造成大量的非轉(zhuǎn)化細胞的逃逸。而40mg/L潮霉素既能有效抑制愈傷組織的生長，又不至于造成細胞迅速死亡，是比較理想的篩選濃度。
2.3..2愈傷組織生理狀態(tài)與農(nóng)桿菌侵染的關(guān)系取兩個不同狀態(tài)的愈傷組織，即直接誘導(dǎo)25d的愈傷組織和繼代8周的愈傷組織。經(jīng)相同條件的預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)和抗性篩選，然后統(tǒng)計和比較兩處理的抗性愈傷率，選擇適合農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織生理狀態(tài)。實驗發(fā)現(xiàn)直接誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織的質(zhì)地較硬，成塊狀，黃白色而繼代以后的愈傷的質(zhì)地較松散，顆粒狀，黃色。取大小基本相同的兩種愈傷，經(jīng)相同條件的預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)。試驗結(jié)果表明，繼代培養(yǎng)的愈傷組織經(jīng)轉(zhuǎn)化后能獲得更高的抗性愈傷率。
2.3.3不同預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基與農(nóng)桿菌侵染的關(guān)系設(shè)置五種不同的預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基處理。經(jīng)相同預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)時間、相同的農(nóng)桿菌處理濃度和相同篩選培養(yǎng)基的條件培養(yǎng)后，通過統(tǒng)計和比較不同處理的抗性愈傷率，確定最適的預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基。不同處理的抗性愈傷組織數(shù)和抗性愈傷率的結(jié)果見下表。
預(yù)培養(yǎng)與共培養(yǎng)培養(yǎng)基對抗性愈傷率的影響


注1培養(yǎng)基1)MS+2，4-D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1％AGAR Powder2)1/2MS+2，4-D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％AGAR Powder3)1/4MS+2，4·D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucosc+1.0％AGAR Powder4)1/4MS+100μMAS+CH600mg/L+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％AGAR Powder5)AA+2，4-D5.0mg/L+100μMAS+2％Sucrose+1％Glucose+1.0％AGAR Powder注2培養(yǎng)基pH預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基pH5.8，共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH5.6統(tǒng)計結(jié)果顯示，不同的預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)培養(yǎng)基對農(nóng)桿菌的侵染影響很大。隨著培養(yǎng)基無機鹽濃度的降低，抗性愈傷率逐漸增高，也即農(nóng)桿菌的侵染力逐漸增強。培養(yǎng)基中添加氨基酸和短肽可提高抗性愈傷率，即提高農(nóng)桿菌對愈傷組織的侵染能力。這些結(jié)果與前人結(jié)果相同。第五種培養(yǎng)基是常用于農(nóng)桿菌懸浮的AAM，從結(jié)果看，它與第四種培養(yǎng)基產(chǎn)生的抗性愈傷率差異不大。
2.3.4農(nóng)桿菌處理菌液濃度與其侵染力的關(guān)系。
用相同的懸浮培養(yǎng)基配制0.5OD、1.0OD、1.5OD和2.0OD四種農(nóng)桿菌菌液濃度，分別處理預(yù)培養(yǎng)后的質(zhì)地、大小和生理狀態(tài)基本一致的愈傷。處理后，經(jīng)相同的方法共培養(yǎng)和篩選，最后統(tǒng)計和比較不同處理的抗性愈傷率，確定農(nóng)桿菌的最適使用濃度。
用接種環(huán)將LB培養(yǎng)基上生長2d后的農(nóng)桿菌刮入MS0液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)3～4h，用分光光度計600nm波長光測定，調(diào)至0.5OD、1.0OD、1.5OD和2.0OD四種菌液濃度。按前面介紹的方法侵染、共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)。兩次篩選培養(yǎng)后，統(tǒng)計抗性愈傷數(shù)，結(jié)果顯示，并不是農(nóng)桿菌苗液濃度越高，則抗性愈傷率越高；而是1.0OD濃度的農(nóng)桿菌苗液侵染愈傷組織才能獲得最高的抗性愈傷率。
2.3.5共培養(yǎng)溫度與農(nóng)桿菌侵染的關(guān)系預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織，經(jīng)相同的農(nóng)桿菌苗液處理后，分別置于15℃，19℃，23℃和27℃四種溫度條件下共培養(yǎng)。共培養(yǎng)后，經(jīng)相同的方法和條件篩選，最后統(tǒng)計和比較不同處理的抗性愈傷率，確定最適的共培養(yǎng)溫度。實驗結(jié)果表明，19℃～23℃共培養(yǎng)溫度條件下，農(nóng)桿菌具有最高的侵染活性，產(chǎn)生最高的轉(zhuǎn)化率。
2.3.6程序化轉(zhuǎn)基因體系的建立及其有效性的驗證試驗根據(jù)各項參數(shù)優(yōu)化試驗的結(jié)果，建立模式化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的牧草轉(zhuǎn)基因操作體系，并嚴格按照這個操作程序進行三次重復(fù)實驗，驗證該實驗程序的有效性和穩(wěn)定性。
2.4轉(zhuǎn)化植物的分子檢測2.4.1轉(zhuǎn)基因植株基因組總DNA的提取、PCR和southern blotting分析取1-2g新鮮葉片，采用CTAB法抽提待測的植株的基因組DNA。用DNA含量測定儀測定DNA濃度，用TE將各樣品的DNA濃度調(diào)至300ng/ul和30ng/ul各一份，存于4.0℃?zhèn)溆?。以插入了ppIP片斷的質(zhì)粒作陽性對照，非轉(zhuǎn)化植株作陰性對照，通過PCR來驗證試驗材料的基因組DNA中是否轉(zhuǎn)入了類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白基因(ppIP)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hpt II)基因，操作方法見分子克隆實驗指南。
通過Southern blotting分析驗證ppIP基因是否轉(zhuǎn)入目的植株。取10μg待測材料的基因組DNA，用HindIII消化；取10μg非轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA，用同樣的酶消化，作陰性對照；同時取10pg質(zhì)粒pCAMBIA1304-ppIP進行EcoRV酶切，作為陽性對照。電泳檢測酶切是否完全。在電壓為45V，膠濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠中電泳16-18h，然后轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。用擴增ppIP基因約900bp片斷作為雜交探針的模板，采用PCR法對探針實行地高辛-dUTP(digoxigenin(DIG)-dUTP)(PCR DIG Probe Synthesis Kit，Roche)標記。然后用(DIG)-dUTP)標記的PPIP基因探針與尼龍膜上的DNA片段進行雜交，具體操作見植物基因工程(王關(guān)林，方宏筠.2002)。
2.4.2轉(zhuǎn)基因植株Northern雜交分析提取待測植株的總RNA，事先采用乙醇沉淀法將RNA樣品濃縮至3μg/μL以上。取30μgRNA，加入甲醛、去離子甲酰胺、10×MOPS和DEPC處理過的水，補足至40μL，混勻后于65℃變性10min，冰上急冷，加入微量溴乙錠和6μL RNase-free的上樣buffer，立即上樣，在1×MOPS緩沖液中于1v·cm-1電泳，待溴酚蘭遷移至凝膠的一半距離時轉(zhuǎn)膜。使用Southern雜交后收集并保存在-20℃的探針，與膜上的RNA雜交，檢測待測植株是否有PPIP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。具體的操作過程見植物基因工程(王關(guān)林，方宏筠.2002)。
2.4.4轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性鑒定取殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)化體(T1代)的葉片飼喂竹蝗，四天后統(tǒng)計幼蟲死亡率。結(jié)果表明川草二號老芒麥殺蟲蛋白基因轉(zhuǎn)化體具有較高的抗蟲性。此結(jié)果證明了本發(fā)明中的類產(chǎn)堿假單胞菌殺蟲蛋白基因在川草二號老芒麥中能夠高效表達，并且殺蟲效果顯著。
2.5農(nóng)桿菌介導(dǎo)的川草二號老芒麥轉(zhuǎn)基因操作體系及體系效率的驗證根據(jù)以上的試驗結(jié)果，建立操作程序如下(1)成熟胚去殼，70％乙醇泡1min，0.15％升汞消毒20min，無菌水洗3～-4次，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織。
(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)40d后，取活力強、顆粒狀愈傷轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。
(3)取繼代培養(yǎng)8周的愈傷顆粒，接入預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基，26℃暗培養(yǎng)4d。然后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)(4)在預(yù)培養(yǎng)的第三天，用LB(LB+1.5％瓊脂)劃線接種農(nóng)桿菌菌株，28℃靜止培養(yǎng)2d之后，將農(nóng)桿菌全部刮入MS0液體培養(yǎng)基；28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)3--4h。分光光度計600nm波長光測定菌液濃度，調(diào)至1.0OD。
(5)將預(yù)培養(yǎng)后的愈傷組織接入100ml桶形瓶，加入調(diào)制好的農(nóng)桿菌苗液，浸泡30min；中間搖動數(shù)次。
(6)倒去菌液，將愈傷置于滅菌濾紙上吸干表面菌液，接入共培養(yǎng)培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)3d，(7)將共培養(yǎng)后的愈傷用無菌水先快速搖動清洗兩次；然后加入無菌水浸泡10min，使愈傷組織內(nèi)部的菌體游離出來；倒去洗液，再加入含400mg/L羧芐青霉素的無菌水浸泡15min；倒干洗液，將愈傷置于滅菌濾紙上吸干，接入篩選培養(yǎng)基；26℃暗培養(yǎng)。每兩周繼代一次，共兩次。
(8)將篩選培養(yǎng)基的抗性愈傷組織接入預(yù)分化培養(yǎng)基，26℃暗培養(yǎng)一周。
(9)將預(yù)分化培養(yǎng)一周的抗性愈傷轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基(改用三角瓶或平底試管)；25℃，2000Lux光照培養(yǎng)，再生轉(zhuǎn)基因植株。
(10)待小植株3～5cm轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上發(fā)根。
(11)將根系健壯的植株移入盆缽，涼棚過渡3～5d；然后移到自然條件下生長，直至成熟。
建立的這個經(jīng)過優(yōu)化的轉(zhuǎn)基因體系，效率究竟如何？需要經(jīng)過試驗驗證。試驗設(shè)三個重復(fù)嚴格按上面操作程序，試驗結(jié)果下表。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的川草二號老芒麥基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率


從試驗的結(jié)果看，建立的川草二號老芒麥農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系具有很高的抗性愈傷率最高達到66.7％，平均為62.2％；以及很高的轉(zhuǎn)化率，平均為29.8％，完全能滿足實際工作的需要。
權(quán)利要求
1.一種川草二號老芒麥抗蟲轉(zhuǎn)基因技術(shù)，包括(1)外植體制備；(2)所述外植體在含5.0mg/L2，4-D和0.05mg/L激動素的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出愈傷組織，愈傷組織繼代培養(yǎng)8周之后，選擇黃白色、顆粒狀的胚性愈傷組織，在1/4MS+2，4·D5.0mg/L+100μM乙酰丁香酮+2％蔗糖+1％葡萄糖+1.0％瓊脂粉，pH5.6的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)4天，然后用含目標基因表達載體的農(nóng)桿菌菌液浸染；(3)在含40mg/L潮霉素選擇壓的所述培養(yǎng)基上篩選抗性愈傷組織并除去農(nóng)桿菌；(4)在含1.5mg/L2，4-D、0.1mg/L激動素和40mg/L潮霉素的所述培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織體細胞胚；(5)體細胞胚萌發(fā)，利用40mg/L潮霉素來篩選抗性轉(zhuǎn)基因再生苗；(6)對轉(zhuǎn)化后獲得的抗性苗進行分子檢測。
2.權(quán)利要求
1的川草二號老芒麥，屬禾本科披堿草屬多年生疏叢型上繁草，中熟型品種。
3.權(quán)利要求
1的基因，其來源是類產(chǎn)堿假單胞菌，是抗蟲性基因，具有抗直翅目蝗蟲的作用。
4.權(quán)利要求
1的方法，所述的外植體是川草二號老芒麥的成熟胚。
5.權(quán)利要求
1的表達載體，是改造后的pCAMBIA1304，其T-DNA是用NcoI和BstEII消化后并連接有權(quán)利要求
3的基因。
6.含有權(quán)利要求
6的根癌農(nóng)桿菌EHA105，其用來轉(zhuǎn)化權(quán)利要求
1所述材料的胚性愈傷組織。
7.權(quán)利要求
1的方法，所述的轉(zhuǎn)化后愈傷組織的分化和再生所需的選擇壓均為40mg/L潮霉素。
8.權(quán)利要求
1的方法，體細胞胚誘導(dǎo)所需的培養(yǎng)基為1/2MS并添加1.5mg/L2，4-D和0.1mg/L激動素。
9.權(quán)利要求
1的方法，抗性苗的再生所需的培養(yǎng)基為1/2MS并添加2.0mg/LNAA。
10.按權(quán)利要求
1的方法，獲得的抗蟲轉(zhuǎn)基因川草二號老芒麥新材料。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種川草二號老芒麥轉(zhuǎn)抗蟲基因的技術(shù)，按照本技術(shù)，以川草二號老芒麥成熟胚為外植體，進行了愈傷組織再生、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗蟲基因轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性研究，建立了高效的愈傷組織再生體系；進行了遺傳轉(zhuǎn)化條件的研究，獲得的抗性愈傷組織以體細胞胚發(fā)生途徑形成再生植株，經(jīng)過分子鑒定和抗蟲性實驗，獲得了抗蟲轉(zhuǎn)基因川草二號老芒麥植株?？瓜x轉(zhuǎn)基因川草二號老芒麥具有抗蝗蟲特性，在我國草原畜牧業(yè)發(fā)展、防止草地沙化等方面有廣闊的市場前景。
文檔編號A01H4/00GKCN1888071SQ200510021175
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月27日
發(fā)明者楊志榮, 李達旭, 張 杰, 趙建 申請人:四川大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan