專利名稱:原子力顯微鏡研究dna所用樣品的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于采用超純水中擴(kuò)散法制備樣品的方法，具體地說(shuō)是一種原子力顯微鏡研究DNA所用樣品的制備方法。
背景技術(shù)：
原子力顯微鏡是繼光學(xué)顯微鏡，電子顯微鏡之后發(fā)展起來(lái)的第三代新型顯微鏡之一。它依靠微小的探針來(lái)探測(cè)被測(cè)物的形貌及其電、磁、粘彈力、硬度等性質(zhì)。由于其超高的分辨率、不需要基底具有導(dǎo)電性、能夠在液體和大氣環(huán)境下操作等優(yōu)點(diǎn)，原子力顯微鏡已經(jīng)被廣泛地用于成像DNA和研究DNA與其它分子的相互作用中。在這些研究中，云母以其原子級(jí)平整度、超大的單晶面和容易解離制備新的表面等特點(diǎn)而成為廣泛使用的基底。因此基于云母基底制備DNA樣品成為人們研究的主要目標(biāo)。以往所使用的二價(jià)金屬離子法固定DNA時(shí)，是先將DNA滴在云母表面吸附幾分鐘(1~3分鐘)，然后用超純水沖洗，最后空氣干燥(如Nucleic Acids Research 24(14)(1996)713-720)。這種處理方法由于在水沖洗的過(guò)程中無(wú)法控制性，使得制備的DNA樣品成功率很低(破壞了吸附到基底上的DNA構(gòu)像及造成DNA的部分群集等)。再者短時(shí)間的沖洗并不能有效地去除吸附在DNA分子上的鹽離子，使得在干燥過(guò)程中它們?cè)诒砻婕癉NA分子上析出形成鹽的結(jié)晶體嚴(yán)重干擾了DNA的成像。此外水沖洗也去除了大量的DNA分子，使得吸附到基底表面的DNA分子變得很少，造成DNA樣品的浪費(fèi)。其它基于表面修飾的方法，如硅烷化、戊二酸化等也同樣存在這些問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，基于無(wú)機(jī)鹽離子與DNA相互作用和在兩個(gè)不同濃度的溶液中擴(kuò)散的理論，改進(jìn)了以往制樣中水沖洗步驟，將吸附有DNA樣品的基底放在超純水中進(jìn)行擴(kuò)散制備DNA樣品。本發(fā)明的目的是提供一種原子力顯微鏡研究DNA所用樣品的制備方法。
本發(fā)明的步驟如下1)、將DNA與適量的醋酸鎂混合配成溶液，二者基本配比為，1ng/μlDNA1mM醋酸鎂，于37～40℃加熱30～60分鐘。最佳溫度為38℃，最佳時(shí)間為30分鐘；2)、將加熱好的DNA上述混合溶液，滴在新解離的云母表面。云母表面為室溫25℃，吸附5～8分鐘。一般是20μl滴在1.5cm2表面上；3)、將吸附有DNA溶液的云母于4～25℃下放在超純水(18.2MΩcm)中進(jìn)行擴(kuò)散。吸附在DNA上的陽(yáng)離子便向超純水中擴(kuò)散，DNA磷酸骨架上由于陽(yáng)離子失去，負(fù)電性增加而產(chǎn)生排斥作用使得DNA分子自發(fā)地分散、展開；4)、然后，取出樣品放在無(wú)水乙醇中10～40秒，最佳為30秒。吸附在樣品表面的水分子向乙醇中擴(kuò)散，加速了樣品的干燥也增強(qiáng)了DNA分子的穩(wěn)定性。最后于25℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下干燥至少2小時(shí)。
這種方法制備的DNA樣品經(jīng)原子力顯微鏡表征發(fā)現(xiàn)DNA分散性較好(DNA分子的兩條鏈幾乎完全伸展且很少有交疊)且均勻(樣品的表面密度均勻)，樣品清潔(幾乎沒(méi)有鹽的結(jié)晶體存在于基底表面及DNA分子上)，樣品重復(fù)性可高達(dá)95％以上。制作過(guò)程較為簡(jiǎn)單、實(shí)用、DNA用量少?？捎糜谥苽渚o密的DNA單分子膜(條件是DNA濃度為10～25ng/μl，滴在云母表面的量與云母面積的基本配比為20μl/1.5cm2，擴(kuò)散時(shí)間為10～30分鐘)、完全伸展的線性DNA(條件是線性DNA濃度小于2.5ng/μl，滴在云母表面的量與云母面積的基本配比為20μl/1.5cm2，擴(kuò)散時(shí)間為10～30分鐘)、開環(huán)的質(zhì)粒DNA(條件是質(zhì)粒DNA濃度小于2.5ng/μl，滴在云母表面的量與云母面積的基本配比為20μl/1.5cm2，擴(kuò)散時(shí)間10～30分鐘)等。這種方法制備的樣品非常適合原子力顯微鏡成像，特別是研究DNA分子與其它分子的相互作用。
本發(fā)明改進(jìn)了以往制樣中水沖洗步驟，將吸附有DNA的云母放在超純水(18.2MΩcm)中自發(fā)擴(kuò)散去除吸附的鹽離子，使DNA分子自發(fā)展開。避免了水沖洗的缺點(diǎn)，制備的DNA樣品成功率高達(dá)95％以上。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
12.5ng/μlλ～DNA與12.5mM Mg2+混合溶液于38℃加熱30分鐘，取其20μl滴在1.5cm2新解離的云母表面吸附7～8分鐘(25℃)，將該云母于4℃下放在超純水中擴(kuò)散30分鐘，取出后放在無(wú)水乙醇中30秒，最后于25℃，氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥2小時(shí)。原子力顯微鏡表征此方法制備了DNA緊密的單分子膜。
實(shí)施例22.5ng/μl質(zhì)粒DNA pBR 322與2.5mM醋酸鎂混合溶液于38℃加熱30分鐘，取其20μl滴在1.5cm2新解離的云母表面吸附7～8分鐘(25℃)，將該云母于4℃下放在超純水中擴(kuò)散30分鐘，取出后在無(wú)水乙醇中放置30秒，最后于25℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥2小時(shí)。原子力顯微鏡表征此方法制備了展開的質(zhì)粒DNA分子。
實(shí)施例32.5ng/μl線性DNA pBR 322/PstI與2.5mM醋酸鎂混合溶液于38℃加熱30分鐘后，取其20μl滴在1.5cm2新解離的云母表面吸附7～8分鐘(25℃)，將該云母于4℃下放在超純水中擴(kuò)散30分鐘，取出后放在無(wú)水乙醇中30秒，最后于25℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)下干燥2小時(shí)。原子力顯微鏡表征此方法制備了完全伸展的線型DNA分子。
權(quán)利要求
1.一種原子力顯微鏡研究DNA所用樣品的制備方法，其特征在于1)將DNA與醋酸鎂混合溶液，于37～40℃加熱30～60分鐘，DNA與醋酸鎂基本配比為1ng/μl DNA1mM醋酸鎂；2)將加熱好的DNA上述混合溶液滴在新解離的云母表面于25℃下吸附5～8分鐘；3)將吸附有DNA溶液的云母于4～25℃下放在18.2MΩcm的超純水中進(jìn)行擴(kuò)散；4)然后，取出樣品放在無(wú)水乙醇中10～40秒后于25℃、氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下干燥至少2小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的原子力顯微鏡研究DNA所用樣品的制備方法，其特征在于所述的DNA濃度為10～25ng/μl時(shí)，DNA與醋酸鎂混合溶液滴在云母表面的量與云母面積的基本比為20μl/1.5cm2，擴(kuò)散時(shí)間為10～30分鐘制備出DNA單分子膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的原子力顯微鏡研究DNA所用樣品的制備方法，其特征在于所述的線性DNA濃度大于零、小于2.5ng/μl時(shí)，DNA與醋酸鎂混合溶液滴在云母表面的量與云母面積的基本比為20μl/1.5cm2，擴(kuò)散時(shí)間為10～30分鐘制備出伸展的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的原子力顯微鏡研究DNA所用樣品的制備方法，其特征在于所述的質(zhì)粒DNA PBR 322濃度大于零、小于2.5ng/μl時(shí)，DNA與醋酸鎂混合溶液滴在云母表面的量與云母面積的基本比為20μl/1.5cm2，擴(kuò)散時(shí)間為10～30分鐘制備出質(zhì)粒DNA。
專利摘要
本發(fā)明是一種原子力顯微鏡研究DNA所用樣品的制備方法。首先將DNA與適量的二價(jià)金屬離子混合溶液，二者基本配比為，1ng/μl DNA1mM Mg
文檔編號(hào)G01Q30/20GKCN1696312SQ200510016720
公開日2005年11月16日 申請(qǐng)日期2005年4月18日
發(fā)明者宋永海, 李壯, 劉志國(guó), 魏剛, 王麗, 孫蘭蘭 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan