本發(fā)明屬于用于人病原微生物快速檢測的體外診斷試劑，具體涉及一種快速聯(lián)合檢測多種與妊娠不良結局相關的病原體核酸的試劑盒及其用途。

背景技術：

1、正常妊娠期婦女的生殖道菌群中乳酸桿菌占主導地位，其存在分泌乳酸維護生殖道的低ph環(huán)境并產(chǎn)生過氧化氫、細胞因子等抗菌成分，以及占據(jù)生殖道微環(huán)境生態(tài)位阻止致病菌生長繁殖，維護生殖道的正常生態(tài)。除此之外，乳酸桿菌還能夠通過產(chǎn)生乳酸影響陰道上皮細胞的免疫因子的表達。當生殖道菌群微環(huán)境發(fā)生改變，乳酸菌不再占主導地位，而是其他致病菌或條件致病菌主導，則可導致陰道炎，甚至上行引起宮頸炎等生殖系統(tǒng)驗證。研究表明，生殖道感染是引起自然流產(chǎn)的高危因素，對妊娠期婦女和新生兒都可能造成影響。因此探究妊娠期婦女的生殖道病原體感染情況和研發(fā)相應的快速檢測方法對于預防不良妊娠結局具有重要意義。

2、在對妊娠期婦女生殖道病原體分布的研究中發(fā)現(xiàn)，念珠菌和支原體的占比均較高，其中念珠菌主要為白色念珠菌、支原體則大部分為解脲脲原體，因此需格外重視白色念珠菌和解脲脲原體陰道感染對妊娠期婦女的影響。除此之外衣原體（主要是沙眼衣原體）也是主要的生殖道感染病原體。

3、目前臨床上常用的生殖道感染疾病的檢測方法為培養(yǎng)法、pcr法、測序法。培養(yǎng)法成本低、應用廣泛，但不適用于部分生殖道病原如衣原體且常需要數(shù)天甚至一周時間，不能滿足快速診斷需求；pcr法靈敏度高，耗時短，但臨床上常開展單項病原的pcr檢測，在出現(xiàn)癥狀不特異的感染時難以確定病原；測序法檢測范圍極廣，可檢測出數(shù)萬種病原體。但其一般用于無法探明原因的感染，成本較高，不適用于預防和早期干預。因此尋找生殖道病原檢測新方法具有一定的意義。

4、微流控芯片（microfluidic?chip），又稱微流體芯片或芯片實驗室（lab-on-a-chip）將各反應單元全部集成到只有巴掌甚至指甲大小的芯片上并可實現(xiàn)生化反應的全部過程。在生物科學研究領域中，微流控芯片可與pcr核酸檢測結合，將pcr反應全過程集成在芯片上，具有微量化、集成化和快速檢測的優(yōu)勢。

5、本發(fā)明首次將微流控芯片結合pcr核酸檢測技術應用于臨床上與不良妊娠結局相關的女性生殖道病原體的檢測，通過收取臨床相應病原體陽性樣本用于該方法的檢測，將結果與目前臨床微生物檢驗常用培養(yǎng)法進行方法學上的比對，從而開發(fā)了一種可通過快速檢測妊娠期婦女生殖道病原體而預測妊娠結局的方法。

技術實現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術中存在的缺陷和不足，本發(fā)明提出了一組臨床上對妊娠結局有不同程度不良影響的病原體，運用微流控芯片快速檢測技術和核酸擴增技術達到快速檢測、多重檢測的目的，從而可以快速便捷地確定目前妊娠婦女的不良預后風險，及時采取針對措施，避免不良預后的發(fā)生。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用了如下的技術方案：

3、在第一個方面中，本發(fā)明提供了一種快速聯(lián)合檢測多種與妊娠不良結局相關的病原體核酸的試劑盒，所述病原體選自以下一種或多種：大腸埃希菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、b族鏈球菌、乳酸桿菌、淋病鏈球菌、沙眼衣原體或解脲脲原體，所述試劑盒包含病原體快速檢測微流控芯片，所述微流控芯片上固定有用于檢測所述病原體核酸的引物組以及擴增對照和空白對照組成的陣列。

4、作為可選的方式，在上述試劑盒中，所述擴增對照是含有陽性擴增模板或陰性擴增模板的對照樣本，用于監(jiān)測擴增系統(tǒng)運行正常與否。

5、作為可選的方式，在上述試劑盒中，所述空白對照是不含模板的對照樣本，用于監(jiān)測反應系統(tǒng)是否出現(xiàn)非特異性熒光信號。

6、作為可選的方式，在上述試劑盒中，所述提取對照是含有內參基因的對照樣本，用于監(jiān)測從提取到擴增過程的正常與否。

7、作為可選的方式，在上述試劑盒中，所述病原體為大腸埃希菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、b族鏈球菌、乳酸桿菌、淋病鏈球菌、沙眼衣原體和解脲脲原體。

8、作為可選的方式，在上述試劑盒中，所述試劑盒適用于微流控芯片結合pcr核酸檢測技術。

9、作為可選的方式，在上述試劑盒中，所述微流控芯片可以是本領域公知的任何微流控芯片。

10、作為一個實例，本發(fā)明可以使用如圖1所示的微流控芯片。本發(fā)明中使用的微流控芯片可以基于連續(xù)流原理，由恒流泵驅動含有待測樣本的擴增體系勻速通過不同溫區(qū)，在三個不同的溫度區(qū)域內，樣本可完成dna變性、退火和延伸，每完成一次位置轉移，就完成了一個dna擴增的過程。當樣本自微流控芯片中流出，即完成了擴增全過程?；谏鲜鲈?，核酸擴增過程速度不再受限制于溫控裝置的升降溫速率，取而代之的是控制液體流動速度和芯片內微管道下液固兩相的傳熱效率。該方法可在5秒內完成一個pcr擴增循環(huán)，如以45個循環(huán)為例，全部擴增完成約4分鐘。

11、作為可選的方式，在上述試劑盒中，用于檢測所述病原體核酸的引物組包括以下一種或多種，5’到3’方向：

12、大腸埃希菌：f引物：gttaatacctttgctcattga（seq?id?no.?1）；r引物：accagggtatcttaatcctgtt（seq?id?no.?2）；

13、白色念珠菌：f引物：gactagcattagtgggttgcg（seq?id?no.?3）；r引物：cacccagcagaatacaccg（seq?id?no.?4）；

14、光滑念珠菌：f引物：acagggtctgatcagcaacca（seq?id?no.?5）；r引物：gccaactatcccaactggtgt（seq?id?no.?6）；

15、b族鏈球菌：f引物：cagttgtaaggaatgtggtaaagg（seq?id?no.?7）；r引物：aaagttggcttcagcatagg（seq?id?no.?8）；

16、解脲脲原體：f引物：cacagatgtccttgatgtaccc（seq?id?no.?9）；r引物：gtaaaaattatttgtaaattgggc（seq?id?no.?10）；

17、淋病奈瑟菌：f引物：ccggaactggtttcatctg（seq?id?no.?11）；r引物：gtttcagcggcagcattca（seq?id?no.?12）；

18、沙眼衣原體：f引物：cctgctgaaccaagccttat（seq?id?no.?13）；r引物：tgatagcgtcacaccaagtg（seq?id?no.?14）；

19、乳酸桿菌：f引物：gaggcagcagtagggaatcttc（seq?id?no.?15）；r引物：ggccagttactacctctatccttcttc（seq?id?no.?16）。

20、作為可選的方式，在上述試劑盒中，所述試劑盒的檢測樣品是陰道來源組織樣品，包括陰道分泌物、宮頸分泌物或宮頸陰道脫落細胞。

21、在第二個方面中，本發(fā)明提供了上述第一個方面所述的試劑盒在制備快速聯(lián)合檢測多種與妊娠不良結局相關的病原體核酸的產(chǎn)品中的用途。

22、作為可選的方式，在上述用途中，如果檢測出淋病奈瑟菌、沙眼衣原體或b族鏈球菌，無論是否檢測出乳酸桿菌，則提示妊娠婦女有較高不良妊娠結局風險，有早產(chǎn)、流產(chǎn)或其他不良妊娠結局風險，即使檢測出乳酸桿菌，仍需要密切監(jiān)測并及時采取適當治療措施。

23、作為可選的方式，在上述用途中，如果檢測出大腸埃希菌、解脲脲原體、白色念珠菌或光滑念珠菌且未檢測出乳酸桿菌，則提示妊娠婦女陰道菌群失調程度嚴重，具有較高不良妊娠結局風險，應重點關注并采取適當治療措施。

24、作為可選的方式，在上述用途中，如果檢測出大腸埃希菌、解脲脲原體、白色念珠菌或光滑念珠菌且檢測出乳酸桿菌，則提示妊娠婦女具有中等不良妊娠結局風險，但仍需定期檢測和采取適當治療措施。

25、作為可選的方式，在上述用途中，如果未檢測出病原體且未檢測出乳酸桿菌，則提示妊娠婦女陰道菌群失調，出現(xiàn)感染風險高，需要進一步監(jiān)測和評估，以防止?jié)撛诟腥尽?/p>

26、作為可選的方式，在上述用途中，如果未檢測出病原體且檢測出乳酸桿菌，則提示妊娠婦女陰道菌群健康，出現(xiàn)不良妊娠結局的風險較低，繼續(xù)常規(guī)隨訪即可，無需特別干預。

27、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有以下有益效果：

28、（1）本發(fā)明提出了一組臨床上對妊娠結局有不同程度不良影響的病原體，并運用微流控芯片快速檢測技術和核酸擴增技術達到快速檢測、多重檢測的目的，從而可以快速便捷地確定目前妊娠婦女的不良預后風險，及時采取針對措施，避免不良預后的發(fā)生。

29、（2）通過使用包含多種病原體設計的引物組，以及固定有上述引物組微流控芯片的檢測方法對樣本中的病原體進行聯(lián)合檢測。本發(fā)明提供的檢測方法可檢出的病原體具有特異性強、方便快捷、適用范圍廣等優(yōu)點，同時，還有試劑消耗量小，污染小等優(yōu)點，該實驗全程為閉蓋式反應，減少了污染的可能性，成本低、且便攜。

30、（3）本發(fā)明方法可聯(lián)合檢測多種臨床常見危害妊娠的生殖道病原體，從而對妊娠結局進行初步的風險評估，所采用方法檢測效率高，幾小時內即可完成檢測，相較于臨床常用培養(yǎng)法需要三天左右時間大大縮短，并且準確性高，相較于培養(yǎng)法能夠檢出更多病原體，更細致地評估不良妊娠風險。