本發(fā)明屬于醫(yī)學檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用于prader-willi綜合征（pws）/angelman綜合征（as）快速診斷的引物組、試劑盒及系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、prader-willi綜合征（pws）又稱普拉德-威利綜合征，俗稱小胖威利綜合征，是一種罕見的遺傳性疾病，主要癥狀表現(xiàn)為肌張力低下、智能障礙、性腺發(fā)育滯后以及肥胖。angelman綜合征（as）又稱天使綜合征，是由于母源印記基因缺失或下調(diào)導(dǎo)致的神經(jīng)遺傳性疾病，主要特征包括嚴重的智力障礙、語言發(fā)育障礙、運動或平衡障礙、特殊的面部特征等。

2、prader-willi綜合征（以下簡稱pws）和angelman綜合征（以下簡稱as）都是由于印記基因功能缺陷所致，都與第15號染色體上的遺傳異常有關(guān)，15號染色體q11-q13區(qū)域缺失、平衡易位或該區(qū)域內(nèi)相關(guān)基因突變等都可能致病。在人群中，pws的發(fā)病率為1/30000-1/10000，as的發(fā)病率約為1/50000-1/24000，大部分病例呈散發(fā)狀態(tài)。

3、基因組印記是表觀遺傳學的一種現(xiàn)象，指一條染色體或同一種基因的改變，由不同性別的親代傳遞給子代時可引起不同表型的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象最可能的發(fā)生機制是dna的甲基化。pws和as有共同的遺傳背景，但從遺傳機制上分析，二者存在一定程度差異。pws通常是由于個體從父親那里繼承的第15號染色體上的特定區(qū)域缺失所致，其他情況包括母源性單親二倍體（沒有父源的15號染色體）（upd）和基因印跡缺陷（id）。as通常是由于個體從母親那里繼承的第15號染色體上的特定區(qū)域缺失所致，其他情況包括父源性單親二倍體（沒有母源的15號染色體）（upd）、ube3a基因突變和基因印跡缺陷（id）。

4、現(xiàn)有診斷方法的技術(shù)缺陷和不足：

5、目前，pws和as通過高分辨率染色體分析（hrb）、熒光原位雜交法（fish）、甲基化-特異性聚合酶鏈反應(yīng)（ms-pcr）、甲基化特異性多重連接依賴性探針擴增法（ms-mlpa）、染色體微陣列分析（cma）等方法進行基因檢測，發(fā)現(xiàn)染色體異?；蚧蛲蛔?，可作為診斷的依據(jù)。其中高分辨率染色體分析（hrb）可以檢測染色體區(qū)域15q11-q13的缺失，但無法檢出單親二倍體（upd）、印記基因突變以及微小缺失，總體檢出率較低。熒光原位雜交（fish）用于檢測15號染色體上特定區(qū)域的缺失，可以區(qū)分pws和as的遺傳缺失原因，但同樣無法檢出upd及印記基因突變，且該技術(shù)檢測操作難度大，對儀器、環(huán)境、人員操作要求高。甲基化特異性多重連接依賴性探針擴增法（ms-mlpa）檢測基因的缺失或重復(fù)，檢出率較高，但該技術(shù)的開發(fā)難度及成本較高。染色體微陣列分析（cma）方法可以檢測染色體不平衡的拷貝數(shù)變異，但不能區(qū)分缺失來自父源或母源，總體檢出率較低。而采用甲基化-特異性聚合酶鏈反應(yīng)（ms-pcr）可以通過dna甲基化分析檢測染色體區(qū)域15q11-q13的缺失、upd和印記缺陷。但ms-pcr的實驗方法，只對單一位點的甲基化水平進行檢測。如人體15號染色體q11.2-q13區(qū)域，共含113個可能的甲基化位點，ms-pcr檢測位點數(shù)不足其中的1%，可能會出現(xiàn)假陰性或假陽性的情況。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于pws/as快速診斷的引物組、試劑盒及系統(tǒng)。

2、本發(fā)明提供一種用于prader-willi綜合征（pws）和angelman綜合征（as）快速診斷的分子生物學檢測方法。本方法通過對人體15號染色體q11.2-q13區(qū)域的snrpn基因甲基化水平進行檢測，可以準確檢測染色體區(qū)域15q11.2-q13的甲基化水平異常。本方法通過ms-pcr對目標基因進行富集，操作便捷、價格低廉；結(jié)合高通量測序技術(shù)，檢測結(jié)果靈敏度高，準確性好且通量高，適于臨床快速診斷應(yīng)用。

3、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

4、本發(fā)明根據(jù)人體基因組人體15號染色體q11.2-q13區(qū)域分別設(shè)計了10條特異性引物，分別用于擴增基因snrpn-cgi1、snrpn-cgi2、snrpn-cgi3、klf4、rhog，其中snrpn-cgi1、snrpn-cgi2、snrpn-cgi3作為15q11.2-q13甲基化水平評估、klf4作為非甲基化區(qū)域質(zhì)控基因，rhog基因作為甲基化區(qū)域質(zhì)控基因。全基因組dna經(jīng)甲基化處理后，分別進行5個基因片段的ms-pcr擴增，將5個pcr產(chǎn)物末端修復(fù)后，在3'端加“a”堿基，經(jīng)接頭連接，文庫擴增，構(gòu)建成ngs文庫并進行ngs測序，分析15q11.2-q13區(qū)域甲基化水平，從而根據(jù)表觀遺傳甲基化水平實現(xiàn)pws和as的快速分子診斷。

5、本發(fā)明第一方面，提供用于pws/as快速診斷的引物組，其所述引物組包括如下引物：

6、用于擴增snrpn-cgi1基因的2條特異性引物，包括：

7、引物1：5′-gagggagttgggatttttgta-3′（seq?id?no.1）；

8、引物2：5′-aaatcctaaaaacttaaaatatctaataaa-3′（seq?id?no.2）；

9、用于擴增snrpn-cgi2基因的2條特異性引物，包括：

10、引物1：5′-aattagattyggaatgtttagagg-3′（seq?id?no.3）；

11、引物2：5′-caataatcactattatacacctaccta-3′（seq?id?no.4）。

12、用于擴增snrpn-cgi3基因的2條特異性引物，包括：

13、引物1：5′-ttaaagtgttgtttgggaaagga-3′（seq?id?no.5）。

14、引物2：5′-aatacctaacctctaaccacattcc-3′（seq?id?no.6）。

15、本發(fā)明第二方面，提供第一方面所述的引物組在制備用于pws/as快速診斷的試劑盒中的應(yīng)用。

16、在一種實施方案中，所述用于pws/as快速診斷包括如下步驟：

17、（1）提供待檢測基因組dna；

18、（2）將步驟（1）的待檢測基因組dna進行甲基化轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化基因組dna；

19、（3）以步驟（2）的轉(zhuǎn)化基因組dna為模板，用根據(jù)第一方面所述的引物組、非甲基化區(qū)域質(zhì)控基因引物組和甲基化區(qū)域質(zhì)控基因引物組進行多重ms-pcr擴增；

20、（4）構(gòu)建ngs文庫；

21、（5）進行ngs文庫測序并分析15q11.2-q13區(qū)域的snrpn-cgi1，snrpn-cgi2，snrpn-cgi13的區(qū)域內(nèi)的平均甲基化比例，對結(jié)果進行判讀。

22、在一個實施方案中，多重ms-pcr擴增產(chǎn)物在進行下一步反應(yīng)前，可以進一步純化；所述純化采用dna純化磁珠進行純化。

23、在一種實施方案中，所述非甲基化區(qū)域質(zhì)控基因為klf4基因，所述甲基化區(qū)域質(zhì)控基因為rhog基因；

24、用于擴增klf4基因的2條特異性引物，包括：

25、引物1：5′-gagaataaagtttaggtttaggagat-3′（seq?id?no.7）。

26、引物2：5′-ataacaacaaaaaaccaccactaac-3′（seq?id?no.8）。

27、用于擴增rhog基因的2條特異性引物，包括：

28、引物1：5′-tatatttttggatgttatttgtgt-3′（seq?id?no.9）。

29、引物2：5′-taaacctaaacctataaaacactac-3′（seq?id?no.10）。

30、其中，以seq?id?no.7、8擴增的klf4基因區(qū)域的平均甲基化比例作為非甲基化內(nèi)參；以seq?id?no.9、10擴增的rhog基因區(qū)域的平均甲基化比例作為甲基化內(nèi)參。

31、本發(fā)明第三方面，提供用于pws/as快速診斷的試劑盒，包括上述第一方面所述的引物組；

32、所述試劑盒還包括第二方面中所述的非甲基化區(qū)域質(zhì)控基因引物組、甲基化區(qū)域質(zhì)控基因引物組、dna聚合酶、反應(yīng)緩沖液等。

33、本發(fā)明第四方面，提供用于pws/as快速診斷的裝置，其包括：上述第三方面所述的試劑盒；和，用于構(gòu)建ngs文庫的試劑盒。

34、在一種實施方案中，所述用于構(gòu)建ngs文庫的試劑盒包括末端修復(fù)酶、接頭、連接酶、dna純化磁珠、文庫pcr引物、文庫pcr反應(yīng)緩沖液。

35、本發(fā)明第五方面，提供用于pws/as快速診斷的方法，包括如下步驟：

36、1）提供待檢測基因組dna；

37、2）將步驟1）的待檢測基因組dna進行甲基化轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化基因組dna；

38、3）以步驟2）的轉(zhuǎn)化基因組dna為模板，用根據(jù)第一方面所述的引物組與第二方面中所述的非甲基化區(qū)域質(zhì)控基因引物組和甲基化區(qū)域質(zhì)控基因引物組進行多重ms-pcr擴增；

39、4）構(gòu)建ngs文庫；

40、5）進行ngs文庫測序并分析15q11.2-q13區(qū)域的snrpn-cgi1，snrpn-cgi2，snrpn-cgi13的區(qū)域內(nèi)的平均甲基化比例，對結(jié)果進行判讀。

41、在一種實施方案中，所述基因組dna為全血樣本的基因組dna，優(yōu)選可采用商業(yè)化的dna提取試劑盒。

42、在一種實施方案中，所述甲基化轉(zhuǎn)化為甲基化酶法轉(zhuǎn)化；優(yōu)選可采用商業(yè)化的酶轉(zhuǎn)化試劑盒。

43、在一個實施方案中，多重ms-pcr擴增產(chǎn)物在進行下一步反應(yīng)前，可以進一步純化；所述純化采用dna純化磁珠進行純化。

44、在一種實施方案中，ngs文庫的構(gòu)建可采用商業(yè)化的ngs文庫制備試劑盒進行構(gòu)建。

45、在一種實施方案中，所述ngs文庫測序為采用二代高通量測序儀進行ngs測序；根據(jù)ngs文庫類型可以適配不同測序平臺，每個樣本文庫的上機測序數(shù)據(jù)量為1.0g。進一步選自華大dnbseq-t7高通量測序。

46、在一種實施方案中，對結(jié)果進行判讀，根據(jù)15q11.2-q13區(qū)域的snrpn-cgi1，snrpn-cgi2，snrpn-cgi13的區(qū)域內(nèi)的平均甲基化比例的結(jié)果綜合判定結(jié)果：

47、判讀標準：

48、陰性樣本：甲基化水平為50%±20%。

49、pws陽性：甲基化水平大于90%。

50、as陽性：甲基化水平約小于10%。

51、本發(fā)明第六方面，提供用于pws/as快速診斷的系統(tǒng)，包括以下模塊：

52、（a）采集模塊，其用于提供待檢測基因組dna；

53、（b）甲基化轉(zhuǎn)化模塊，其用于將步驟（a）的待檢測基因組dna進行甲基化轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化基因組dna；

54、（c）擴增模塊，其用于以步驟（b）的轉(zhuǎn)化基因組dna為模板，用根據(jù)第一方面所述的引物組與第二方面中所述的非甲基化區(qū)域質(zhì)控基因引物組和甲基化區(qū)域質(zhì)控基因引物組進行多重ms-pcr擴增；

55、（d）文庫構(gòu)建模塊，其用于構(gòu)建ngs文庫；

56、（e）測序分子模塊，其用于ngs文庫測序并分析15q11.2-q13區(qū)域的snrpn-cgi1，snrpn-cgi2，snrpn-cgi13的區(qū)域內(nèi)的平均甲基化比例，對結(jié)果進行判讀。

57、在一種實施方案中，所述采集模塊，基因組dna為全血樣本的基因組dna，優(yōu)選可采用商業(yè)化的dna提取試劑盒。

58、在一種實施方案中，所述甲基化轉(zhuǎn)化模塊，甲基化轉(zhuǎn)化為甲基化酶法轉(zhuǎn)化；優(yōu)選可采用商業(yè)化的酶轉(zhuǎn)化試劑盒。

59、在一種實施方案中，所述擴增模塊包括根據(jù)第三方面所述的試劑盒。

60、在一個實施方案中，所述擴增模塊，多重ms-pcr擴增的反應(yīng)體系為50μl反應(yīng)體系：10×la?pcr?buffer?ii（mg2+?plus）5.0μl，dntp?mixture?8.0μl，takara?la?taq?0.5μl，primer?mix?5.0μl，模板dna?5.0μl，用滅菌去離子水補齊到50.0μl；

61、其中，10×la?pcr?buffer?ii?(mg2+?plus)中mg2+濃度為25mm；dntp?mixture中，每種dntp濃度為2.5mm；takara?la?taq中酶的濃度為5u/μl，保存液包括如下組分：20mmtris-hcl（ph8.0），100mm氯化鉀，0.1mm?edta，1mm?dtt，0.5%?tween-20，0.5%?np-40，50%甘油；primer?mix包括seq?id?no.1-seq?id?no.10，各引物濃度為2.5pmol/μl。

62、在一個實施方案中，所述擴增模塊，多重ms-pcr擴增的反應(yīng)程序為：95℃?3min，95℃?30sec，55℃?30sec（-0.5℃/cycle），72℃?1min，10cycles；95℃?30sec，55℃?30sec，72℃?1min，25?cycles；72℃?5?min，4℃?hold。

63、在一個實施方案中，所述擴增模塊，多重ms-pcr擴增產(chǎn)物在進行下一步反應(yīng)前，可以進一步純化；所述純化采用dna純化磁珠進行純化。

64、在一種實施方案中，所述文庫構(gòu)建模塊包括用于構(gòu)建ngs文庫的試劑，所述用于構(gòu)建ngs文庫的試劑包括接頭、連接酶、dna純化磁珠、文庫pcr引物、文庫pcr反應(yīng)緩沖液。

65、在一種實施方案中，所述ngs文庫測序為采用二代高通量測序儀進行ngs測序；根據(jù)ngs文庫類型可以適配不同測序平臺，每個樣本文庫的上機測序數(shù)據(jù)量為1.0g。進一步選自華大dnbseq-t7高通量測序。

66、在一種實施方案中，通過測序分析模塊進行ngs文庫測序并分析15q11.2-q13區(qū)域的snrpn-cgi1，snrpn-cgi2，snrpn-cgi13的區(qū)域內(nèi)的平均甲基化比例后，對結(jié)果進行判讀：

67、判讀標準：

68、陰性樣本：甲基化水平為50%±20%。

69、pws陽性：甲基化水平大于90%。

70、as陽性：甲基化水平約小于10%。

71、本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

72、本發(fā)明使用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（ms-pcr）并結(jié)合ngs測序技術(shù)，對15號染色體15q11.2-q13區(qū)域的snrpn基因甲基化水平進行檢測，該檢測方法可用于prader-willi綜合征（pws）和angelman綜合征（as）表觀遺傳快速分子診斷，方法操作便捷，檢測成本低，檢測結(jié)果準確性好、檢測靈敏度、特異性高，檢測通量高，適于臨床推廣應(yīng)用。該方法檢測結(jié)果可準確區(qū)分染色體區(qū)域15q11.2-q13的甲基化水平異常，可用于pws綜合征、as綜合征的快速輔助診斷。