本發(fā)明屬于海水魚類細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種豹紋鰓棘鱸皮膚組織離體培養(yǎng)獲得色素細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、體色是魚類重要的性狀之一，也是魚類在適應(yīng)環(huán)境過程中經(jīng)過長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果。魚類體色和斑紋等圖案是由皮膚中分布的色素細(xì)胞的種類、數(shù)目、色素細(xì)胞中包含的色素顆粒的狀態(tài)以及虹彩細(xì)胞中晶體反射小板的反光能力強(qiáng)弱共同形成的。目前在魚類中共發(fā)現(xiàn)6種類型的色素細(xì)胞，集中分布于皮膚組織真皮層，分別有黑色素細(xì)胞（melanincell）、紅色素細(xì)胞（erythrophore）、黃色素細(xì)胞（xanthophore）、白色素細(xì)胞（leucophore）、藍(lán)色素細(xì)胞（canophore）和虹彩細(xì)胞（iridocyte）。

2、豹紋鰓棘鱸（plectropomus?leopardus）又稱東星斑，是屬于鱸形目、鮨科、石斑魚亞科、鰓棘鱸屬、藍(lán)點(diǎn)鰓棘鱸種。分布在印度洋—太平洋的熱帶或者亞熱帶水域中，集中于南海、東海和西太平洋的珊瑚礁邊緣有著復(fù)雜的社會(huì)結(jié)構(gòu)和變換的體色如黑褐色、棕色和紅色。豹紋鰓棘鱸作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚種，在長(zhǎng)期自然選擇中為適應(yīng)生存環(huán)境和實(shí)現(xiàn)種群交流，形成了特有的體色：魚體呈現(xiàn)明亮的紅色，除腹側(cè)以外的皮膚組織分布著藍(lán)色斑點(diǎn)。體色是豹紋鰓棘鱸重要的經(jīng)濟(jì)性狀，紅色具有更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。東星斑體色主要與皮膚組織中分布的色素細(xì)胞的種類、數(shù)量和狀態(tài)有關(guān)。目前已知東星斑皮膚中存在紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、黑色素細(xì)胞以及虹彩細(xì)胞四種色素細(xì)胞，但是對(duì)于豹紋鰓棘鱸體色形成及調(diào)控機(jī)制尚不明確，其原因部分是由于色素細(xì)胞對(duì)體色的調(diào)控影響研究仍處于初步階段，東星斑繁殖周期長(zhǎng)，且胚胎顯微注射技術(shù)尚未突破，通過基因敲除及轉(zhuǎn)基因家系構(gòu)建等技術(shù)開展研究具有較大的困難。體色與豹紋鰓棘鱸市場(chǎng)價(jià)格的關(guān)聯(lián)度顯著，但豹紋鰓棘鱸體色調(diào)控機(jī)制的解析仍處于初級(jí)階段，色素細(xì)胞作為體色形成的重要單元。因?yàn)轸~類皮膚組織中的色素細(xì)胞是一種高度分化的細(xì)胞，增殖能力弱，且魚類皮膚組織致密度高，表皮及真皮層緊密結(jié)合，組織細(xì)胞構(gòu)成復(fù)雜，因此獲取高活性的原代色素細(xì)胞較為困難。

3、目前，有關(guān)原代色素細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法普遍存在所得細(xì)胞的收獲量和成活率低，操作技巧要求高，易發(fā)生污染，細(xì)胞易發(fā)生灌注再損傷而具有較低的生存能力等問題，僅在少量魚類物種的部分色素細(xì)胞類型中獲得成功。現(xiàn)有皮膚色素分離主要利用酶消化培養(yǎng)法，將剪碎的皮膚組織用胰蛋白酶和膠原酶消化直接得到色素胞，然后將混合物過濾，對(duì)得到的細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)。在現(xiàn)有的酶消化培養(yǎng)法中，由于消化酶主要對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)細(xì)胞形態(tài)的改變，可能是由于酶消化損傷細(xì)胞膜上部分蛋白受體，導(dǎo)致如色素的損傷和死亡，以及對(duì)于分離細(xì)胞的表型和功能造成的改變。

4、因此，有必要建立規(guī)范的豹紋鰓棘鱸色素細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，以期解決現(xiàn)有技術(shù)解離困難、細(xì)胞存活率低、細(xì)胞貼壁困難、易污染及培養(yǎng)等問題，從而獲得具有較高活性的色素細(xì)胞，為探究色素細(xì)胞自身功能、基因調(diào)控機(jī)制提供原料，并為進(jìn)一步探究色素細(xì)胞對(duì)體色的影響提供離體驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)前提條件。同時(shí)，也為豹紋鰓棘鱸的良種繁育奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了建立規(guī)范的豹紋鰓棘鱸皮膚組織色素細(xì)胞分離和培養(yǎng)的方法，為解決該技術(shù)問題：

2、本發(fā)明第一方面提供一種豹紋鰓棘鱸皮膚組織離體培養(yǎng)獲得色素細(xì)胞的方法，包括以下步驟：

3、步驟a：配置原代細(xì)胞培養(yǎng)液；

4、步驟b：對(duì)豹紋鰓棘鱸的皮膚組織進(jìn)行預(yù)處理，得到預(yù)處理魚皮組織；

5、步驟c-1：通過酶解法對(duì)預(yù)處理魚皮組織進(jìn)行消化反應(yīng)得到外植體；

6、步驟c-2：通過外植體法對(duì)外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)得到豹紋鰓棘鱸皮膚組織原代色素細(xì)胞。

7、進(jìn)一步的，原代細(xì)胞培養(yǎng)液包括：dmem、fbs、三抗、tpa溶液或bfgf溶液。

8、進(jìn)一步的，fbs為所述原代細(xì)胞培養(yǎng)液體積的15%；三抗的終濃度為3×三抗；tpa溶液的終濃度為9.5-9.8?ng/ml、9.8-10.0?ng/ml或10.0-10.2?ng/ml；bfgf溶液的終濃度為19.5-19.8?ng/ml、19.8-20.0?ng/ml或20.0-20.2?ng/ml。

9、進(jìn)一步的，步驟b包括：步驟b-1：從豹紋鰓棘鱸中取下皮膚組織；步驟b-2：將皮膚組織利用不同抗生素濃度的dpbs緩沖液漂洗，得到預(yù)處理魚皮組織。

10、進(jìn)一步的，步驟b-1具體為：將10月齡、11月齡或12月齡的豹紋鰓棘鱸進(jìn)行麻醉，用消毒劑對(duì)豹紋鰓棘鱸的魚體表面進(jìn)行消毒，在無(wú)菌條件下解剖取下并除去魚體外層膜得到皮膚組織；步驟b-2具體為：將皮膚組織置于含有5×三抗的dpbs緩沖液中漂洗兩次，每次漂洗時(shí)間為17-19?min、19-21?min、或21-23?min；利用含有3×三抗的dpbs緩沖液漂洗一次，漂洗13-14?min、14-15?min或15-16?min后放入培養(yǎng)皿中，將皮膚組織剪碎至2?mm2大小的塊，加入含有3×三抗的dpbs緩沖液反復(fù)漂洗剪碎的皮膚組織三至四次，每次漂洗18-20min或20-22?min，得到預(yù)處理魚皮組織。

11、進(jìn)一步的，含有5×三抗的dpbs緩沖液包括：500?iu/ml青霉素、500?μg/ml鏈霉素和1.25?μg/ml兩性霉素b；含有3×三抗的dpbs緩沖液包括：300?iu/ml青霉素、300?μg/ml鏈霉素和750?ng/ml兩性霉素b。

12、進(jìn)一步的，步驟c-1具體為：通過酶解法將預(yù)處理魚皮組織利用第一消化液進(jìn)行第一消化反應(yīng)后得到第一沉淀；利用dpbs緩沖液重復(fù)清洗第一沉淀3遍后得到第四沉淀；利用第二消化液消化第四沉淀即為第二消化反應(yīng)，得到第二消化反應(yīng)懸液；將第二消化反應(yīng)懸液置于細(xì)胞過濾篩中過濾并離心得到外植體和第五沉淀；步驟c-2具體為：通過外植體法將外植體置于pdl涂布的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行倒置貼壁培養(yǎng)；向倒置貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加入1.4-1.5?ml、1.5-1.6?ml或1.6-1.8?ml原代細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行正置貼壁培養(yǎng)得到豹紋鰓棘鱸皮膚組織原代色素細(xì)胞。

13、進(jìn)一步的，第一消化液包括：終濃度為2.0-2.2?mg/ml、2.2-2.4mg/ml或2.4-2.6mg/ml的胰蛋白酶、終濃度為0.7-0.9?mm/l、0.9-1.0?mm/l或1.0-1.2mm/l的edta；第一消化反應(yīng)的溫度為：25-26℃、26-27℃或27-28℃；第一消化反應(yīng)的時(shí)間為：18-19?min、19-20min或20-21?min。

14、進(jìn)一步的，第二消化液包括：終濃度為0.08-0.09?mg/ml、0.09-0.11?mg/ml或0.11-0.13?mg/ml膠原蛋白酶ⅰ、終濃度為11.5-12.0?μg/ml、12.0-12.5?μg/ml或12.5-13.0μg/ml的dnase???；第二消化反應(yīng)的溫度為：25-26℃、26-27℃或27-28℃；第二消化反應(yīng)的時(shí)間為：4.5-5.0?h、5.0-5.5?h或5.5-6.2?h。

15、進(jìn)一步的，倒置貼壁培養(yǎng)的溫度為27.5-27.8℃、27.8-28.2℃或28.2-28.5℃；倒置貼壁培養(yǎng)的時(shí)間為4.5-4.8?h、4.8-5.2?h或5.2-5.5?h。

16、本發(fā)明第二方面提供一種由上述方法培養(yǎng)的色素細(xì)胞組，色素細(xì)胞組包括黑色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞和/或新色素細(xì)胞。

17、進(jìn)一步的，黑色素細(xì)胞、紅色素細(xì)胞、黃色素細(xì)胞、虹彩細(xì)胞和新色素細(xì)胞能夠共存培養(yǎng)。

18、本發(fā)明通過利用豹紋鰓棘鱸皮膚組織通過優(yōu)化的細(xì)胞解離方法，即酶解法和外植體法聯(lián)合進(jìn)行離體培養(yǎng)，成功分離出豹紋鰓棘鱸原代色素細(xì)胞組并實(shí)現(xiàn)了共存培養(yǎng)。本發(fā)明優(yōu)化原代色素細(xì)胞培養(yǎng)方法實(shí)現(xiàn)了豹紋鰓棘鱸色素細(xì)胞的培養(yǎng)，即將獲得的色素細(xì)胞置于優(yōu)化的原代培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)增殖，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量到達(dá)目標(biāo)值時(shí)，通過胰酶消化至細(xì)胞變圓，后加入培養(yǎng)基中止消化并通過離心獲得外植體，從而實(shí)現(xiàn)了豹紋鰓棘鱸原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。同時(shí)本發(fā)明還檢測(cè)出一種尚未見報(bào)道的未知色素細(xì)胞，在本發(fā)明中將其定義為新色素細(xì)胞。