本發(fā)明屬于中藥及其應用，具體涉及一種生半夏外泌體及其在制備巨噬細胞免疫激活劑中的應用。

背景技術：

1、外泌體是由細胞內(nèi)多泡體與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質(zhì)中的膜性囊泡。幾乎所有類型的細胞，都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。被分泌出的外泌體作用于外界其他細胞或組織，觸發(fā)各種信號通路，從而對受體細胞的表型和功能產(chǎn)生重大影響。植物來源的外泌體通過介導與外界的細胞信號傳導和通訊，參與到免疫應答、凋亡、血管生成等重要的生物過程中。例如，最近有報道稱，人參等植物中的納米囊泡可能抑制癌癥生長并提高免疫治療效果。

2、巨噬細胞是先天免疫反應中維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要組成部分，并在炎癥、感染或代謝紊亂中發(fā)揮積極作用。巨噬細胞具有可塑性，在不同環(huán)境和細胞因子的影響下可分化為不同的類型。巨噬細胞有兩種常見的類型：（1）m1樣巨噬細胞是典型的激活的巨噬細胞，可以產(chǎn)生大量的促炎因子，如tnf-α、il-6和il-1β。m1樣巨噬細胞具有較強的抗原呈遞能力，可促進免疫活性，抵抗病原體感染、吞噬細胞腫瘤，抑制腫瘤增殖。他們還表達了可以激活nk細胞和t細胞來殺死腫瘤的因子。（2）m2樣巨噬細胞是選擇性激活的巨噬細胞，可以產(chǎn)生大量的抗炎因子，如tgf-β、il-4和il-10，以及更高的m2樣巨噬細胞標記物，如arg-1、ym-1、fizz-1和ccl18。m2樣巨噬細胞可以抑制炎癥反應，促進血管生成。兩種功能性拮抗表型可在各種刺激下相互轉化。天然植物藥物對巨噬細胞功能的影響正受到人們越來越多的關注，人們寄希望從中開發(fā)出具有抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)免疫等功效的高效低毒免疫調(diào)節(jié)作用的新成分。

3、從古至今，半夏均需經(jīng)過炮制后才能入藥，生半夏其毒性主要表現(xiàn)為強烈的黏膜刺激性毒性、肝腎毒性、妊娠毒性，若炮制不當或服用生品少量會對所接觸的嘴唇、咽喉、口腔、聲帶、胃腸道黏膜產(chǎn)生強烈的刺激性，導致針刺樣的刺痛感和口舌腫脹、咽喉刺痛甚或失音、嘔吐、腹瀉等，多量則咽喉燒痛腫脹、不能發(fā)聲、流涎、嘔吐、全身麻木、呼吸遲緩、痙攣、呼吸困難等。藥用半夏通常要經(jīng)過白礬、石灰、生姜等進行炮制,如姜半夏、法半夏、清半夏等，其目的一方面是為了利于保存，另一方面可以去除其毒性成分。然而經(jīng)過炮制后的半夏，其有效生物活性成分也會發(fā)生一定的改變?；谏胂牡募毎饽遗菔欠衲軌蛲ㄟ^其所包含的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、rna等成分影響巨噬細胞功能，調(diào)節(jié)機體免疫，從而在疾病的預防和治療中發(fā)揮作用還未有報道。

技術實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術中生半夏毒性高、開發(fā)利用程度低的問題，本發(fā)明提供了一種生半夏外泌體及其在制備巨噬細胞免疫激活劑中的應用，制備得到的生半夏外泌體具有刺激巨噬細胞免疫激活的作用。

2、本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)：

3、一種生半夏外泌體，所述的生半夏外泌體于生半夏中分離得到。

4、進一步地，所述的生半夏外泌體通過以下方法制備得到：

5、（1）生半夏去皮，加水打漿得混懸液，混懸液在8000~12000×g的速度下進行，2~3次離心，去除沉淀；

6、（2）步驟（1）去除沉淀后的上清液進行超速離心，收集沉淀；

7、（3）步驟（2）沉淀用pbs?溶液重懸，繼續(xù)進行超速離心，收集沉淀，即為生半夏外泌體。

8、進一步地，步驟（1）中生半夏與水的質(zhì)量比為1:2。

9、進一步地，步驟（1）中離心時間為10~30min。

10、進一步地，步驟（2）和步驟（3）中超速離心條件為120000?×?g，50~90min。

11、本發(fā)明中，所述的生半夏外泌體在制備巨噬細胞免疫激活劑中的應用。

12、進一步地，所述的生半夏外泌體使m1型巨噬細胞免疫相關基因表達增高、m2型巨噬細胞免疫相關基因表達降低；所述的m1型巨噬細胞免疫相關基因為cd86,inos和il-1β；所述的m2型巨噬細胞免疫相關基因為cd206,arg-1和il-10。

13、有益效果

14、本發(fā)明通過從生半夏中分離獲得生半夏外泌體，生半夏外泌體作用m0型巨噬細胞24小時，m1型巨噬細胞免疫相關基因cd86,inos和il-1β表達明顯增高，m2型巨噬細胞免疫相關基因cd206,arg-1和il-10表達明顯降低，表明生半夏具有刺激巨噬細胞免疫激活的作用，應用于制備巨噬細胞免疫激活劑；且體內(nèi)實驗顯示從生半夏中分離獲得生半夏外泌體未對小鼠內(nèi)臟器官產(chǎn)生損傷作用，具有廣泛的應用前景。

技術特征：

1.一種生半夏外泌體，其特征在于，所述的生半夏外泌體于生半夏中分離得到。

2.根據(jù)權利要求1所述的生半夏外泌體，其特征在于，生半夏外泌體通過以下方法制備得到：

3.根據(jù)權利要求2所述的生半夏外泌體，其特征在于，步驟（1）中生半夏與水的質(zhì)量比為1:2。

4.根據(jù)權利要求2所述的生半夏外泌體，其特征在于，步驟（1）中離心時間為10~30min。

5.根據(jù)權利要求2所述的生半夏外泌體，其特征在于，步驟（2）和步驟（3）中超速離心條件為120000?×?g，50~90min。

6.一種權利要求1~5任一項所述的生半夏外泌體在制備巨噬細胞免疫激活劑中的應用。

7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于，所述的生半夏外泌體使m1型巨噬細胞免疫相關基因表達增高、m2型巨噬細胞免疫相關基因表達降低；

技術總結
本發(fā)明公開了一種生半夏外泌體及其在制備巨噬細胞免疫激活劑中的應用，屬于中藥及其應用技術領域。生半夏外泌體于生半夏中分離得到，生半夏去皮，加水打漿得混懸液，在8000~12000×g的速度下進行，2~3次離心，去除沉淀；上清液進行超速離心，收集沉淀；沉淀用PBS溶液重懸，繼續(xù)進行超速離心，收集沉淀，即為生半夏外泌體。本發(fā)明生半夏外泌體作用M0型巨噬細胞，M1型巨噬細胞免疫相關基因CD86,iNOS和IL?1β表達明顯增高，M2型巨噬細胞免疫相關基因CD206,Arg?1和IL?10表達明顯降低，表明生半夏外泌體具有刺激巨噬細胞免疫激活的作用，應用于制備巨噬細胞免疫激活劑，具有廣泛的應用前景。

技術研發(fā)人員：宋寶,付加雷
受保護的技術使用者：山東第一醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院（山東省腫瘤防治研究院、山東省腫瘤醫(yī)院）
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19