本發(fā)明屬于微生物檢測，具體涉及一種基于高通量測序檢測支原體的組合物及定性定量檢測方法。

背景技術(shù)：

1、支原體屬于柔膜菌綱，大小介于細(xì)菌和病毒之間；可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小原核細(xì)胞型微生物，沒有細(xì)胞壁，大小約0.1-0.8μm，是細(xì)胞培養(yǎng)中的常見污染物。支原體容易通過標(biāo)準(zhǔn)滅菌過濾器，較難清除。支原體含有多個(gè)質(zhì)粒，質(zhì)粒與轉(zhuǎn)座子共同編碼產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致其容易對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性。支原體污染具有隱蔽性，培養(yǎng)基一般不渾濁，常規(guī)光學(xué)顯微鏡下無法觀察到。實(shí)際上此時(shí)細(xì)胞生長已受到抑制，并能導(dǎo)致染色體畸變等。由于對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果影響巨大，因此在生物制藥企業(yè)或科研機(jī)構(gòu)的研發(fā)過程中，凡涉及細(xì)胞培養(yǎng)的過程都需要進(jìn)行支原體的檢測，以確保放行產(chǎn)品和科研用細(xì)胞都不含支原體。

2、支原體檢測的方法包括培養(yǎng)法、指示細(xì)胞培養(yǎng)法和熒光定量pcr法。培養(yǎng)法需要7-14天、指示細(xì)胞培養(yǎng)法需要28天，耗時(shí)較長。熒光探針法qpcr是針對(duì)已知序列設(shè)計(jì)引物和探針對(duì)支原體進(jìn)行快速檢測，但不能夠檢測未知的支原體，無法對(duì)支原體進(jìn)行定性定量檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)支原體檢測方法耗時(shí)長檢測效率低，無法實(shí)現(xiàn)定性定量檢測的問題，本發(fā)明提供了一種基于高通量測序檢測支原體的組合物及定性定量檢測方法，快速、高效的實(shí)現(xiàn)支原體的定性定量檢測。

2、本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種基于高通量測序檢測支原體的組合物，包括分子標(biāo)記磁珠和引物2、引物3和引物4，分子標(biāo)記磁珠包括磁珠和耦聯(lián)的分子標(biāo)記序列；

4、所述的分子標(biāo)記序列如seq?id?no.?1所示，其中，n表示a、t、c、g中的任一種，為隨機(jī)合成；

5、所述的引物2的序列如seq?id?no.?2所示；

6、所述的引物3的序列如seq?id?no.3所示；

7、所述的引物4的序列如seq?id?no.?4所示；

8、所述的磁珠含有熒光基團(tuán)修飾。

9、進(jìn)一步地，所述的熒光基團(tuán)為cy5。

10、進(jìn)一步地，所述的分子標(biāo)記序列5’端核苷酸的c6位上使用胺基取代羥基；所述的磁珠表面修飾有羧基。

11、本發(fā)明中，所述的基于高通量測序檢測支原體的組合物在定性定量檢測支原體中的應(yīng)用。

12、進(jìn)一步地，所述的基于高通量測序檢測支原體的組合物定性定量檢測支原體的方法包括以下步驟：

13、（1）將磁珠和耦聯(lián)的分子標(biāo)記序列制備成分子標(biāo)記磁珠；

14、（2）通過微流控技術(shù)將分子標(biāo)記磁珠分配至液滴空間中，每個(gè)液滴空間中包含一個(gè)分子標(biāo)記磁珠，構(gòu)成含有sybr?green熒光染料的pcr反應(yīng)體系；

15、（3）檢測625nm激發(fā)波長，660nm檢測波長cy5熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)，記錄含有信號(hào)的液滴數(shù)，計(jì)為有效液滴數(shù)；

16、（4）進(jìn)行第一輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)，檢測470nm激發(fā)波長，510nm檢測波長sybr?green熒光染料熒光信號(hào)，如有液滴出現(xiàn)熒光信號(hào)，破乳收集磁珠、合并多個(gè)樣品，加入引物3和引物4進(jìn)行第二輪pcr擴(kuò)增獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行高通量測序；

17、（5）根據(jù)樣品標(biāo)簽序列將測序結(jié)果歸屬于對(duì)應(yīng)樣品；根據(jù)16s序列將樣品測序結(jié)果進(jìn)行分類，進(jìn)行支原體的種屬鑒定；根據(jù)16s序列對(duì)應(yīng)的液滴標(biāo)簽序列，對(duì)16s序列進(jìn)行定量分析。

18、進(jìn)一步地，步驟（1）中分子標(biāo)記磁珠的制備方法為：將分子標(biāo)記序列5’端的引物與磁珠耦聯(lián)，然后通過dna連接酶將剩余dna從5’端到3’?端串接分子標(biāo)記序列的特異性片段，制備得分子標(biāo)記磁珠。

19、進(jìn)一步地，步驟（2）中每個(gè)液滴空間構(gòu)成的pcr體系中包括一個(gè)分子標(biāo)記磁珠、包含熒光染料的10xpcr反應(yīng)緩沖液2.5μl，?80μmol/l引物2溶液2.5μl，待檢樣品dna溶液1μl，加標(biāo)記磁珠使終濃度為1標(biāo)記磁珠/液滴，加水至體積25μl，使用naicar公司的數(shù)字pcr系統(tǒng)及芯片，制備微液滴。

20、進(jìn)一步地，步驟（4）中第一輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)轭A(yù)變性94℃、10min，循環(huán)反應(yīng)95℃、10s，60℃、30s，50個(gè)循環(huán)；步驟（4）中第二輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)轭A(yù)變性94℃、10min，循環(huán)反應(yīng)95℃、10s，60℃、30s，25個(gè)循環(huán)。

21、進(jìn)一步地，?步驟（4）中第二輪pcr擴(kuò)增體系為：10xpcr反應(yīng)緩沖液2.5μl，?10μmol/l引物3和引物4溶液各2.5μl，第一輪pcr反應(yīng)所得磁珠，加水至體積25μl。

22、進(jìn)一步地，步驟（5）定量分析計(jì)算公式為：樣品dna濃度copies/μl=-ln[（有效液滴數(shù)-液滴標(biāo)簽數(shù)）/有效液滴數(shù)]*?有效液滴數(shù)*(液滴總體積-磁珠總體積)/pcr反應(yīng)液體積/加入樣品溶液體積。

23、有益效果

24、（1）本發(fā)明基于高通量測序?qū)悠分械闹гw進(jìn)行定性定量分析，因此能檢測到的未知支原體，覆蓋度高于現(xiàn)有方法。

25、（2）本發(fā)明方法檢測周期為1-3天，快于培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法，可以實(shí)現(xiàn)支原體的快速檢測；

26、（3）本發(fā)明將樣品溶液分割至微液滴，檢測限為5cfu，支原體檢測的靈敏度高。

技術(shù)特征：

1.一種基于高通量測序檢測支原體的組合物，其特征在于，包括分子標(biāo)記磁珠和引物2、引物3和引物4，分子標(biāo)記磁珠包括磁珠和耦聯(lián)的分子標(biāo)記序列；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于高通量測序檢測支原體的組合物，其特征在于，所述的熒光基團(tuán)為cy5。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于高通量測序檢測支原體的組合物，其特征在于，所述的分子標(biāo)記序列5’端核苷酸的c6位上使用胺基取代羥基；所述的磁珠表面修飾有羧基。

4.一種權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的基于高通量測序檢測支原體的組合物在定性定量檢測支原體中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的基于高通量測序檢測支原體的組合物定性定量檢測支原體的方法包括以下步驟：

6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（1）中分子標(biāo)記磁珠的制備方法為：將分子標(biāo)記序列5’端的引物與磁珠耦聯(lián)，然后通過dna連接酶將剩余dna從5’端到3’?端串接分子標(biāo)記序列的特異性片段，制備得分子標(biāo)記磁珠。

7.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（2）中每個(gè)液滴空間構(gòu)成的pcr體系中包括一個(gè)分子標(biāo)記磁珠、包含熒光染料的10xpcr反應(yīng)緩沖液2.5μl，?80μmol/l引物2溶液2.5μl，待檢樣品dna溶液1μl，加水至體積25μl，使用naicar公司的數(shù)字pcr系統(tǒng)及芯片，制備微液滴。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（4）中第一輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)轭A(yù)變性94℃、10min，循環(huán)反應(yīng)95℃、10s，60℃、30s，50個(gè)循環(huán)；步驟（4）中第二輪pcr擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)轭A(yù)變性94℃、10min，循環(huán)反應(yīng)95℃、10s，60℃、30s，25個(gè)循環(huán)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（4）中第二輪pcr擴(kuò)增體系為：10xpcr反應(yīng)緩沖液2.5μl，10μmol/l引物3和引物4溶液各2.5μl，第一輪pcr反應(yīng)所得磁珠，加水至體積25μl。

10.?根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟（5）定量分析計(jì)算公式為：樣品dna濃度copies/μl=-ln[（有效液滴數(shù)-液滴標(biāo)簽數(shù)）/有效液滴數(shù)]*?有效液滴數(shù)*(液滴總體積-磁珠總體積)/pcr反應(yīng)液體積/加入樣品溶液體積。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種基于高通量測序檢測支原體的組合物及定性定量檢測方法，屬于微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。高通量測序檢測支原體的組合物包括分子標(biāo)記磁珠和引物2、引物3和引物4，分子標(biāo)記磁珠包括磁珠和耦聯(lián)的分子標(biāo)記序列；分子標(biāo)記序列如SEQ?ID?NO.1所示，其中，N表示A、T、C、G中的任一種，為隨機(jī)合成，引物2的序列如SEQ?ID?NO.2所示，引物3的序列如SEQ?ID?NO.3所示，引物4的序列如SEQ?ID?NO.4所示，磁珠含有熒光基團(tuán)修飾。本發(fā)明基于高通量測序?qū)悠分械闹гw進(jìn)行定性定量分析，能檢測到的未知支原體，覆蓋度高于現(xiàn)有方法；檢測周期為1?3天，可以實(shí)現(xiàn)支原體的快速檢測，且支原體檢測的靈敏度高。

技術(shù)研發(fā)人員：杭寶建,梁超超,由鵬飛,咸瑞卿,鞏麗萍,石峰
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19