本發(fā)明屬于基因工程，涉及化合物生物技術(shù)生產(chǎn)，尤其是一種細胞培養(yǎng)用l-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、l-谷氨酰胺是谷氨酸的γ羧基酰胺化的一種中性氨基酸，是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)的20種基本氨基酸之一。l-谷氨酰胺在維持人體機能和生命活動方面具有重要作用，其在人體內(nèi)含量非常高，占人體游離氨基酸的61%。

2、l-谷氨酰胺參與細胞代謝中的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，l-谷氨酰胺等氨基酸是細胞生長和細胞營養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是細胞培養(yǎng)所必需的氨基酸，也是細胞培養(yǎng)基中種類最多和添加量最高的生物試劑?？贵w和病毒疫苗具有生物活性，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定（如糖基化），極少雜質(zhì)就可能導(dǎo)致臨床危害，因此細胞培養(yǎng)對氨基酸的純度、內(nèi)毒素、雜質(zhì)含量等質(zhì)量要求極高。發(fā)展高附加值的高端l-谷氨酰胺產(chǎn)品，可顯著降低細胞培養(yǎng)基生物醫(yī)藥產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，對促進我國生物醫(yī)藥行業(yè)的產(chǎn)業(yè)升級，打造獨立自主的產(chǎn)業(yè)鏈具有重要意義。

3、現(xiàn)有技術(shù)主要是利用微生物發(fā)酵，再從發(fā)酵液中分離純化制備l-谷氨酰胺。中國專利公開文獻cn111187178a提出了l-谷氨酰胺晶體制備方法，發(fā)酵液經(jīng)提取處理得到l-谷氨酰胺精制清液。精制清液調(diào)節(jié)ph值。精制液加入結(jié)晶助劑，啟動蒸發(fā)濃縮。濃縮后加入l-谷氨酰胺晶種。繼續(xù)蒸發(fā)結(jié)晶到某濃度結(jié)束蒸發(fā)。蒸發(fā)結(jié)晶得到的濃縮液經(jīng)過冷卻預(yù)晶、分離、烘干，得到谷氨酰胺成品和精母液。上述方法的l-谷氨酰胺收率為85%，純度為99.5%。

4、中國專利公開文獻cn108997159a提出一種l-谷氨酰胺的制備方法。取l-谷氨酰胺發(fā)酵液經(jīng)微濾、結(jié)晶、脫色，制得l-谷氨酰胺；不包括離子交換步驟。完全去除離子交換的步驟，使收率大幅度提高，另外節(jié)省了酸、堿、水，大幅度降低了廢水廢液，減少了污染，并且降低了能耗，節(jié)約了成本。副產(chǎn)截留液和粗母液去制造肥料，實現(xiàn)了谷氨酰胺提取工藝的零排放。上述方法的l-谷氨酰胺收率為68.3%，純度為98.6%。

5、中國專利公開文獻cn113684165a提出一種重組谷氨酸棒桿菌及其在生產(chǎn)l-谷氨酰胺中的應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。所述重組谷氨酸棒桿菌細胞內(nèi)γ-谷氨酸激酶、谷氨酸分泌機械通道蛋白及谷氨酰胺合成酶的腺苷?；富钚詥适В⑶疫\用質(zhì)粒pxmj19共表達了釀酒酵母來源的谷氨酰胺合成酶及大腸桿菌來源的多聚磷酸鹽激酶，將此重組谷氨酸棒桿菌接種至5?l發(fā)酵罐中發(fā)酵66?h，即可使發(fā)酵液中l(wèi)-谷氨酰胺的產(chǎn)量達73.5?g/l、糖胺轉(zhuǎn)化率達36.5%。但該技術(shù)依然需要使用玉米漿、尿素、多種無機鹽等復(fù)雜的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)細胞，影響產(chǎn)物的提取精制。

6、現(xiàn)有技術(shù)存在的主要問題是發(fā)酵培養(yǎng)基成分復(fù)雜，導(dǎo)致l-谷氨酰胺提取工藝復(fù)雜，產(chǎn)品收率低且內(nèi)毒素、金屬離子等雜質(zhì)超標，產(chǎn)品達不到細胞培養(yǎng)要求。為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種酶催化制備l-谷氨酰胺并從酶催化液中分離提純得到細胞培養(yǎng)用l-谷氨酰胺的方法。通過構(gòu)建重組大腸桿菌表達lactobacillus?bulgaricus來源的谷氨酰胺合酶和deinococcus?geothermalis來源的聚磷酸激酶，催化l-谷氨酸和極少量的atp高效合成l-谷氨酰胺，產(chǎn)量高于現(xiàn)有技術(shù)。由于反應(yīng)溫度較高，很大程度上抑制了副反應(yīng)的發(fā)生，經(jīng)簡單的分離純化步驟，即可使產(chǎn)品達到細胞培養(yǎng)級標準。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種細胞培養(yǎng)用l-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法和應(yīng)用。

2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

3、一種細胞培養(yǎng)用l-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：

4、首先，敲除escherichia?coli?bl21?(accc11171)中的谷氨酰胺酶基因glsa和glsb，減少產(chǎn)物l谷氨酰胺的降解；其次，構(gòu)建重組菌株質(zhì)粒過表達lactobacillusbulgaricus來源的谷氨酰胺合酶基因glna和deinococcus?geothermalis來源的聚磷酸激酶基因ppk，谷氨酰胺合酶催化l-谷氨酸、atp和銨鹽形成l-谷氨酰胺，聚磷酸激酶催化atp的再生；然后，培養(yǎng)重組菌株誘導(dǎo)產(chǎn)酶，配置酶反應(yīng)體系催化l-谷氨酰胺的合成；最后，從酶反應(yīng)液中分離純化得到細胞培養(yǎng)級的l-谷氨酰胺。

5、進一步地，所述谷氨酰胺酶基因glsa的基因序列為seq?id?no.1，谷氨酰胺酶基因glsb的基因序列為seq?id?no.2，谷氨酰胺合酶基因glna的基因序列為seq?id?no.3，聚磷酸激酶基因ppk的基因序列為seq?id?no.4。

6、進一步地，具體步驟如下：

7、（1）敲除escherichia?coli?bl21?(accc11171)中的谷氨酰胺酶基因glsa和glsb，獲得重組菌株e.?coli?gln1；

8、（2）構(gòu)建含有l(wèi)actobacillus?bulgaricus來源的谷氨酰胺合酶基因glna和deinococcus?geothermalis來源的聚磷酸激酶基因ppk的重組質(zhì)粒petduet-glna-ppk，并將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)到e.?coli?gln1菌株中，獲得重組菌株e.?coli?gln2；

9、（3）培養(yǎng)重組菌株e.?coli?gln2，誘導(dǎo)產(chǎn)生谷氨酰胺合酶和聚磷酸激酶，獲得的具有谷氨酰胺合酶和聚磷酸激酶活性的重組菌株e.?coli?gln2；

10、（4）將步驟（3）中培養(yǎng)獲得的具有谷氨酰胺合酶和聚磷酸激酶活性的重組菌株e.coli?gln2進行細胞破碎，得到破碎菌體；

11、（5）將步驟（4）中的破碎菌體與l-谷氨酸、atp、六偏磷酸鈉和硫酸鎂混合，在ph7.0，45℃的反應(yīng)條件下進行反應(yīng)合成l-谷氨酰胺，得到酶反應(yīng)液；

12、（6）將步驟（5）中的酶反應(yīng)液先經(jīng)陶瓷膜過濾除去菌體碎片和大分子蛋白；然后經(jīng)超濾膜過濾除去小分子蛋白和色素；最后經(jīng)納濾膜過濾除去atp、adp、六偏磷酸鈉和色素，得到納濾清液；

13、（7）將步驟（6）中的納濾清液經(jīng)電滲析處理分離l-谷氨酸、硫酸鎂和l-谷氨酰胺，得到電滲析處理液；

14、（8）將步驟（7）中電滲析處理液濃縮，加入乙醇降溫結(jié)晶，離心，得到l-谷氨酰胺粗品濕晶；

15、（9）將步驟（8）中l(wèi)-谷氨酰胺粗品濕晶加入乙醇/水溶液漿洗，離心，得到純化后的l-谷氨酰胺。

16、進一步地，所述步驟（1）中谷氨酰胺酶基因glsa來源于escherichia?coli?bl21(accc11171)，核苷酸序列如序列表seq?id?no.1所示；谷氨酰胺酶基因glsb來源于escherichia?coli?bl21?(accc11171)，核苷酸序列如序列表seq?id?no.2所示；

17、或者，所述步驟（2）中谷氨酰胺合酶基因glna來源于lactobacillus?bulgaricus，核苷酸序列如序列表seq?id?no.3所示；聚磷酸激酶基因ppk來源于deinococcusgeothermalis，核苷酸序列如序列表seq?id?no.4所示；重組質(zhì)粒petduet為商品化質(zhì)粒，核苷酸序列如序列表seq?id?no.5所示。

18、進一步地，所述步驟（3）中培養(yǎng)重組菌株e.?coli?gln2的具體培養(yǎng)步驟為：

19、①試管斜面培養(yǎng)：用接種環(huán)從甘油保菌管中挑取3-4環(huán)重組菌株e.?coli?gln2劃線接種于帶有100?mg/l氨芐青霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基，于37?℃?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14?h，轉(zhuǎn)接1代；

20、②茄形瓶斜面培養(yǎng)：用接種環(huán)從試管斜面中挑取全部菌體劃線接種于帶有100mg/l氨芐青霉素抗性的lb固體培養(yǎng)基，于37?℃?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14?h，轉(zhuǎn)接2代；

21、③發(fā)酵罐培養(yǎng)：將茄形瓶斜面中的菌全部接種至帶有100?mg/l氨芐青霉素抗性的lb液體培養(yǎng)基中；發(fā)酵罐裝填系數(shù)為60%，通氣量2?l/min，溶氧控制在20%～40%（溶氧0%?定義為添加了少量硫酸銅的飽和亞硫酸鈉溶液中的溶氧，溶氧100%?定義為靜止空氣中的溶氧），通過自動流加氨水控制ph在7.0，培養(yǎng)溫度37?℃；培養(yǎng)至od600?=12-14時，添加終濃度為0.1?mm的iptg（異丙基-β-d-硫代半乳糖苷）誘導(dǎo)表達目的蛋白，誘導(dǎo)溫度為25?℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)8?h，8000?r/min離心15?min收集菌體。

22、進一步地，所述步驟（4）中細胞破碎的方法為超聲破碎、凍融破碎、液氮研磨破碎或者高壓勻漿破碎，本發(fā)明優(yōu)選高壓勻漿破碎，破碎條件為：4?℃，800-1000?bar。

23、或者，所述步驟（5）中l(wèi)-谷氨酸的濃度為640-655?mm，atp的濃度為32-35?mm、六偏磷酸鈉的濃度為65-70?mm、硫酸鎂的濃度為65-70?mm，粗酶液即破碎菌體的添加量為40-60g/l。

24、進一步地，所述步驟（6）中陶瓷膜的截留分子量為50?kd、超濾膜截留分子量為3000?d-6000?d、納濾膜截留分子量為300?d-500?d，材質(zhì)均為聚醚砜、溫度控制不超過35℃，工作壓力為0.5-1.0?mpa；

25、或者，所述步驟（7）中電滲析為雙極膜電滲析，pitc柱前衍生法檢測l-谷氨酸和l-谷氨酰胺，待濃縮池中l(wèi)-谷氨酸的含量降至0.5?g/l以下時，結(jié)束電滲析處理。

26、進一步地，所述步驟（8）中乙醇的結(jié)晶條件為：將電滲析液濃縮至110-120?g/l，加入濃縮液體積1-2倍的95%乙醇，降溫至5-10?℃。

27、或者，所述步驟（9）中乙醇/水溶液的漿洗條件為：乙醇水溶液體積濃度為75-90%，乙醇水溶液加入量為l-谷氨酰胺粗品重量的2-3倍。

28、如上所述的生產(chǎn)方法在細胞培養(yǎng)用l-谷氨酰胺生產(chǎn)中的應(yīng)用。

29、本發(fā)明取得的優(yōu)點和積極效果為：

30、1、本發(fā)明方法中篩選的lactobacillus?bulgaricus來源的谷氨酰胺合酶可以高效的催化l-谷氨酸向l-谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化，l-谷氨酰胺的最高產(chǎn)量可以達到590?mm（86?g/l），摩爾轉(zhuǎn)化率為90%。

31、2、本發(fā)明方法中篩選的deinococcus?geothermalis來源的聚磷酸激酶，在ph7.0，45℃的反應(yīng)條件下具有較高酶活，可以有效與谷氨酰胺合酶進行偶聯(lián)，實現(xiàn)?atp?的循環(huán)再生，反應(yīng)中?atp?的用量節(jié)省了95%，有效的降低了催化成本。

32、3、本發(fā)明方法中通過敲除宿主菌株的谷氨酰胺酶，減少了催化反應(yīng)中l(wèi)-谷氨酰胺的降解，提升了酶催化效率。此外，由于反應(yīng)溫度較高，很大程度上抑制了副反應(yīng)的發(fā)生，經(jīng)簡單的分離純化步驟，即可使產(chǎn)品達到細胞培養(yǎng)級標準。

33、4、本發(fā)明方法中開發(fā)的l-谷氨酰胺的分離純化工藝，工藝簡單，無需使用離子交換樹脂、活性炭等傳統(tǒng)分離方法，避免了酸堿的使用，提取一次收率達到87.4%，純度達到99.50%，內(nèi)毒素水平＜1eu/ml，通過細胞培養(yǎng)試驗驗證，對比文件產(chǎn)品為食品級或工業(yè)級產(chǎn)品，沒有體現(xiàn)達到細胞培養(yǎng)基級，本發(fā)明產(chǎn)品指標可以對標sigma的細胞培養(yǎng)用l-谷氨酰胺產(chǎn)品。