本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種識(shí)別胰島素原的單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、胰島素原(proinsulin)是胰島素(insulin)生物合成過(guò)程中的一個(gè)重要前體，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和臨床意義。胰島素的生物合成起始于細(xì)胞漿中的胰島素前體－前胰島素原(preproinsulin)，新合成的前胰島素原包含110個(gè)氨基酸，在其氨基端信號(hào)肽的引領(lǐng)下，經(jīng)跨膜轉(zhuǎn)位進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，隨后被信號(hào)肽酶剪切形成另一個(gè)胰島素的前體－由86個(gè)氨基酸組成的胰島素原。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，胰島素原迅速進(jìn)行氧化折疊，形成進(jìn)化高度保守的三對(duì)二硫鍵和其正常的空間構(gòu)象，正常折疊的胰島素原，被進(jìn)一步從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體，進(jìn)行進(jìn)一步的加工剪切，形成胰島素和c肽存儲(chǔ)在分泌顆粒中。

2、胰島素原由胰島素和c肽兩部分組成，具有雙重免疫活性。這意味著胰島素原既可以與胰島素抗體結(jié)合，又能夠與c肽抗體結(jié)合。雖然胰島素原與胰島素在分子結(jié)構(gòu)上有所相似，但其降糖活性僅為胰島素的5％-10％。生理情況下，只有極少量的胰島素原會(huì)被釋放到血液中。而在病理狀態(tài)下，如糖尿病、胰腺腫瘤、多囊卵巢綜合征或慢性腎功能不全等情況，機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗或者合成大量胰島素，血液中胰島素原的水平會(huì)升高。本發(fā)明研發(fā)團(tuán)隊(duì)的前期研究還發(fā)現(xiàn)，胰島素原分泌延遲可以作為評(píng)價(jià)胰島功能障礙更早期和敏感的臨床指標(biāo)。

3、現(xiàn)階段胰島素原檢測(cè)試劑可用于糖尿病、胰島素瘤及胰島素抵抗綜合癥等疾病的診斷，以及準(zhǔn)確判斷胰島β細(xì)胞的生理功能。但診斷胰島素原異常表達(dá)的手段還不夠完善，開(kāi)發(fā)一種新型能夠識(shí)別胰島素原特定表位的單克隆抗體及檢測(cè)試劑非常有必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明公開(kāi)一種識(shí)別胰島素原的單克隆抗體及其應(yīng)用，所述單克隆抗體具有親和力好、效價(jià)較高等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于識(shí)別生物樣本中的胰島素原具有較強(qiáng)的特異性。

2、為了實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，第一方面，本發(fā)明提出一種識(shí)別胰島素原的單克隆抗體，所述單克隆抗體的輕鏈cdr3的氨基酸序列如seq?id?no:7、seq?id?no:13或seq?id?no:19所示；所述單克隆抗體的重鏈cdr3的氨基酸序列如seq?id?no:10、seq?id?no:16或seqidno:22所示。

3、在本發(fā)明的進(jìn)一步示例中，所述單克隆抗體的輕鏈cdr1的氨基酸序列如seq?idno:8、seq?id?no:14或seq?id?no:20所示；和/或，所述單克隆抗體的輕鏈cdr2的氨基酸序列如seq?id?no:9、seq?id?no:15或seq?id?no:21所示。

4、在本發(fā)明的進(jìn)一步示例中，所述單克隆抗體的重鏈cdr1的氨基酸序列如seq?idno:11、seq?id?no:17或seq?id?no:23所示；和/或，所述單克隆抗體的重鏈cdr2的氨基酸序列如seq?id?no:12、seq?id?no:18或seq?id?no:24所示。

5、需注意，本發(fā)明所述單克隆抗體高變區(qū)引入的部分突變并不會(huì)影響抗體分子與抗原的結(jié)合。在本發(fā)明的進(jìn)一步示例中，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqid?no:1、seq?id?no:3或seq?id?no:5所示；或?qū)eq?id?no:1、seq?id?no:3或seq?id?no:5經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與seq?id?no:1、seq?id?no:3或seqid?no:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或與seq?id?no:1、seq?id?no:3或seq?idno:5具有至少90％的同源性(比如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等但不限于所例舉的數(shù)值)且與seq?id?no:1、seq?id?no:3或seq?id?no:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

6、進(jìn)一步地，所述所述單克隆抗體的輕鏈氨基酸序列包括輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)seqid?no:35。

7、在本發(fā)明的進(jìn)一步示例中，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?idno:2、seq?id?no:4或seq?id?no:6所示；或?qū)eq?id?no:2、seq?id?no:4或seq?id?no:6經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且與seq?id?no:2、seq?id?no:4或seq?idno:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或與seq?id?no:2、seq?id?no:4或seq?idno:6具有至少90％的同源性(比如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％等但不限于所例舉的數(shù)值)且與seq?id?no:2、seq?id?no:4或seq?id?no:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。

8、進(jìn)一步地，所述所述單克隆抗體的重鏈氨基酸序列包括重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)seqid?no:36。

9、在本發(fā)明的進(jìn)一步示例中，所述單克隆抗體為全抗體或全抗體的抗原結(jié)合部分；進(jìn)一步地，所述全抗體為igg1型；進(jìn)一步地，所述抗原結(jié)合部分為fab片段、f(ab')2片段、單鏈抗體或全長(zhǎng)抗體。在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選示例中，所述單克隆抗體為全長(zhǎng)抗體。

10、在本發(fā)明的進(jìn)一步示例中，所述單克隆抗體所識(shí)別胰島素原的氨基酸序列如seqid?no:25、seq?id?no:26或seq?id?no:27所示。

11、本發(fā)明的再進(jìn)一步示例中，提供了3個(gè)所述單克隆抗體，分別為單克隆抗體1、單克隆抗體2和單克隆抗體3，其中，單克隆抗體1的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為seq?id?no:1、seq?id?no:2，單克隆抗體2的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為seq?id?no:3、seq?id?no:4，單克隆抗體3的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為seq?id?no:5、seq?id?no:6。

12、第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼權(quán)利上述的識(shí)別胰島素原的單克隆抗體。

13、進(jìn)一步地，編碼單克隆抗體1的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:28所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:29所示；編碼單克隆抗體2的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:30所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:31所示；編碼單克隆抗體3的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:32所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:33所示。

14、第三方面，本發(fā)明提出了上述識(shí)別胰島素原的單克隆抗體在檢測(cè)生物樣本中胰島素原中的用途。

15、本發(fā)明對(duì)所述生物樣本的具體種類(lèi)不是限制的，比如人源組織、細(xì)胞、上清、血清、血漿等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要采用本發(fā)明識(shí)別胰島素原的單克隆抗體用于檢測(cè)包含抗原的生物樣品，并不由此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

16、第四個(gè)方面，本發(fā)明提出了上述識(shí)別胰島素原的單克隆抗體在制備胰島素體外免疫檢測(cè)試劑、試劑盒或藥物組合物中的應(yīng)用；可通過(guò)特定將上述識(shí)別胰島素原的單克隆抗體應(yīng)用于特定試劑盒中，從而可實(shí)現(xiàn)的對(duì)生物樣本中胰島素原含量的測(cè)定。

17、進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括酶標(biāo)板、包被緩沖液、底物、底物顯色液或反應(yīng)終止液中的任意一種或至少兩種的組合。

18、進(jìn)一步地，所述藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑。

19、此外，本發(fā)明對(duì)于生產(chǎn)上述單克隆抗體的雜交瘤母細(xì)胞的制備方法不是限制的，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可根據(jù)選擇。進(jìn)一步的，生產(chǎn)上述單克隆抗體的雜交瘤母細(xì)胞的制備方法可選包括以下步驟：

20、(1)多肽合成：使用化學(xué)合成的方法合成氨基酸序列如seq?id?no:25、seq?id?no:26或seq?id?no:27所示的多肽，hplc純化。

21、(2)抗原制備：使用專(zhuān)利ief(免疫原性增強(qiáng)因子，immunogenicity?enhancementfactors)，將vlp(病毒類(lèi)似顆粒，virus-like?particles)與傳統(tǒng)klh載體蛋白結(jié)合。

22、(3)免前檢測(cè)：選取8-12周齡雌性balb/c小鼠5只，眼眶采血并分離血清，使用elisa的方法檢測(cè)血清效價(jià)，包被抗原為多肽與bsa偶聯(lián)物。

23、(4)小鼠免疫：使用多肽與klh偶聯(lián)物作為免疫原進(jìn)行免疫，并在最后一次注射免疫后，小鼠取血開(kāi)始血清效價(jià)檢測(cè)，檢測(cè)方法同免前檢測(cè)。只有抗血清效價(jià)大于10k的小鼠才能進(jìn)入分選階段，否則加免一次。

24、(5)抗體發(fā)現(xiàn)：使用常規(guī)雜交瘤制備流程獲取雜交瘤細(xì)胞株，使用免前檢測(cè)方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞株上清，使用上清純化抗體進(jìn)行復(fù)檢。選出一株elisa效價(jià)最高的細(xì)胞株，即可得到所述的雜交瘤母細(xì)胞。

25、此外，本發(fā)明對(duì)于生產(chǎn)上述單克隆抗體的方法不是限制的，本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可根據(jù)選擇。進(jìn)一步地，所述單克隆抗體的制備方法可選為：(1)雜交瘤生產(chǎn)：使用無(wú)血清培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)流程進(jìn)行細(xì)胞生產(chǎn)，使用protein?a/g親和柱層析方法分離純化抗體；(2)腹水生產(chǎn)：使用腹水標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)流程生產(chǎn)抗體，使用protein?a/g親和柱層析方法分離純化抗體；(3)重組生產(chǎn)：通過(guò)分子生物學(xué)操作獲取雜交瘤細(xì)胞株的輕重鏈核酸，瓊脂糖凝膠驗(yàn)證，通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶和t4連接酶構(gòu)建至表達(dá)載體中，并使用原核表達(dá)系統(tǒng)擴(kuò)增質(zhì)粒。使用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的方法進(jìn)行細(xì)胞生產(chǎn)，使用protein?a/g親和柱層析方法分離純化抗體。

26、本發(fā)明涉及的氨基酸序列包括：

27、(1)單克隆抗體1

28、seq?id?no:1(輕鏈可變區(qū))：

29、divltqsplslpvslgdqasiscrssqnivhsngktylewylqkpgqspklliyniynrf?sgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycfqgshvpytfgggtkleik

30、seq?id?no:7(輕鏈cdr3)：

31、fqgshvpyt

32、seq?id?no:8(輕鏈cdr1)：

33、rssqnivhsngktyle

34、seq?id?no:9(輕鏈cdr2)：

35、niynrfs

36、seq?id?no:2(重鏈可變區(qū))：

37、qvqlqqsgaevvkpgasvkmsckasgysftsynmhwikqtpgqglewiggiypgng?essynqkfkgkatmtadkssntaymqfssltsedsavyycargdgfdywgqgttltvss

38、seq?id?no:10(重鏈cdr3)：

39、gdgfdy

40、seq?id?no:11(重鏈cdr1)：

41、synmh

42、seq?id?no:12(重鏈cdr2)：

43、giypgngessynqkfkg

44、(2)單克隆抗體2

45、seq?id?no:3(輕鏈可變區(qū))：

46、divltqspaslavslgqratisckasqsvdyngdsymnwyqqkpgqpptlliyvaskle?sgiparfsgsgsgtdftlnihpveeedvatyycqqtneepltfgagtklelk

47、seq?id?no:13(輕鏈cdr3)：

48、qqtneeplt

49、seq?id?no:14(輕鏈cdr1)：

50、kasqsvdyngdsymn

51、seq?id?no:15(輕鏈cdr2)：

52、vaskles

53、seq?id?no:4(重鏈可變區(qū))：

54、qvqleqsgpelvkpgasvrisckasgytftsyyvhwvrqrpgqglewigwihpgnins?kynekfkdkatltadkssttaymqlssltsedsavyfcsrsvdywgqgttltvss

55、seq?id?no:16(重鏈cdr3)：

56、svdy

57、seq?id?no:17(重鏈cdr1)：

58、syyvh

59、seq?id?no:18(重鏈cdr2)：

60、wihpgninskynekfkd

61、(3)單克隆抗體3

62、seq?id?no:5(輕鏈可變區(qū))：

63、divltqstalmaaspgekvtitcsvsssisssylhwyqqksetspkpwiygtsnlasgvp?vrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwsnypltfgagtklelk

64、seq?id?no:19(輕鏈cdr3)：

65、qqwsnyplt

66、seq?id?no:20(輕鏈cdr1)：

67、svsssisssylh

68、seq?id?no:21(輕鏈cdr2)：

69、gtsnlas

70、seq?id?no:6(重鏈可變區(qū))：

71、qvqleqsggglvqpkgslklscaasgfnfntngmnwvrqapgkglewvarirsksnnyatyyadsvkdrftisrddsqsmlylqmnnlktedtamyycvrdggygawfaywgqgslvtvsa

72、seq?id?no:22(重鏈cdr3)：

73、dggygawfay

74、seq?id?no:23(重鏈cdr1)：

75、tngmn

76、seq?id?no:24(重鏈cdr2)：

77、rirsksnnyatyyadsvkd

78、此外，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為seq?id?no:34(輕鏈恒定區(qū))：

79、radaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtd?qdskdstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec

80、重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為seq?id?no:35(重鏈恒定區(qū))：

81、asttppsvyplapgsansmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivvprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimntngsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk

82、另外，本發(fā)明中seq?id?no:25、seq?id?no:26或seq?id?no:27的氨基酸序列分別為：

83、seq?id?no:25：

84、plalegslqkrgiv

85、seq?id?no:26：

86、pktrreaedlqvgq

87、seq?id?no:27：

88、ksrrevedpqveqlec

89、本發(fā)明涉及的核酸分子序列包括：

90、編碼單克隆抗體1的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:28所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:29所示；

91、seq?id?no:28：

92、gacattgtgctcacccaatctccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagaacattgtacatagtaatggaaagacctatttagagtggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaatatttacaaccggttttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgttttcaaggttcacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaa

93、seq?id?no:29：

94、caggtccagctgcagcagtcaggggctgaggtggtgaagcctggggcctcagtgaagatgtcctgcaaggcttctggctactcatttaccagttacaatatgcactggataaagcagacacctggacagggcctggaatggattggaggtatttatccaggaaatggtgaaagttcctacaatcagaagttcaaaggcaaggccacaatgactgcagacaaatcctccaacacagcctacatgcagttcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtgcaagaggggacggttttgactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca

95、編碼單克隆抗體2的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:30所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:31所示：

96、seq?id?no:30：

97、gacattgtgctcacccagtctccagcctctttggctgtgtctctagggcagagggccaccatctcctgcaaggccagccaaagtgttgattataatggtgatagttatatgaactggtaccaacagaaaccgggacagccacccacactcctcatctatgttgcatccaagctagaatctgggatcccagccaggtttagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatgttgcaacctattactgtcagcaaactaatgaggaaccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa

98、seq?id?no:31：

99、caagttcagctggagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcttcagtgaggatatcctgcaaggcttctggctacaccttcacaagctactatgttcactgggtgaggcagaggcctggacagggacttgagtggattggatggattcatcctggaaatattaattctaaatacaatgagaaattcaaggacaaggccacactgactgcagacaaatcctccaccacagcctacatgcagctcagcagcctgacctctgaggactctgcggtctatttctgttcaagatcggttgactactggggccaagggaccactctcacagtctcctca

100、編碼單克隆抗體3的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:32所示、重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no:33所示：

101、seq?id?no:32：

102、gatattgtgctgacccagtctacagcactcatggctgcatctccaggggagaaggtcaccatcacctgcagtgtcagctcaagtataagttccagctacttgcactggtaccagcagaagtcagaaacctcccccaaaccctggatttatggcacatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtggatctgggacctcttattctctcacaatcagcagcatggaggctgaagatgctgccacttattactgtcaacagtggagtaattacccactcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa

103、seq?id?no:33：

104、caagttcagctggagcagtctggtggaggattggtgcagcctaaagggtcattgaaactctcatgtgcagcctctggatttaacttcaataccaatggcatgaactgggtccgccaggccccaggaaagggtttggagtgggttgctcgcataagaagtaaaagtaataattatgcaacatattatgccgattcagtgaaagacaggttcaccatctccagagatgattcacaaagcatgctctatctgcaaatgaacaacttgaaaactgaggacacagccatgtattactgtgtgagagacgggggttacggggcctggtttgcttactggggccaagggtctctggtcactgtctctgca

105、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明識(shí)別胰島素原的單克隆抗體能特異性識(shí)別人/小鼠胰島素原中的特定抗原表位，識(shí)別特異性強(qiáng)、親和力好、效價(jià)較高，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。