本發(fā)明屬于基因編輯和檢測，具體涉及一種來源于單子葉植物水稻的argonaute蛋白質及其應用。

背景技術：

1、argonaute（ago）蛋白家族成員廣泛存在于生物體內，根據來源可分為真核argonaute（eago）和原核argonaute（pago）。eagos在生物體內rna干擾途徑中起重要作用，是rna誘導的沉默復合物risc的功能核心，在介導引導鏈和靶互補配對過程中發(fā)揮生物支架的作用，可通過eagos自身核酸酶的活性切割互補靶標或招募其他蛋白分子作用于靶標。eagos通過靶向裂解rna、抑制mrna翻譯、dna甲基化等方式調控基因的表達，參與dna修復以及減少轉座子的移動性來保持基因組的完整性等過程，在生長、發(fā)育、繁殖、抵御病原體、應對脅迫等領域發(fā)揮重要功能。

2、目前，pagos在體內的生理功能尚不如eagos清楚，并且真核生物中缺乏pagos活性的報道，可能是因為體內難以形成有效的pago-向導核酸復合物。eagos在體外大多數具有特異性切割rna的活性，但對dna的特異性切割活性少見報道。

3、eagos在遺傳進化的分類和酶學上有很大的多樣性。目前研究核酸酶切性質的eagos主要來源于單細胞的真核微生物，對于多細胞組成的動植物來源的eagos主要研究體內的生理功能，對于體外的生化性質比如與dna的相互作用沒有詳細的研究，目前并未有利用動植物eagos進行基因編輯、修飾和分子檢測等應用。因此，表征來源于多細胞生物的eagos，有望提供更多應用于動植物體內的核酸操縱工具。

技術實現思路

1、有鑒于此，本發(fā)明旨在從多細胞真核生物中挖掘一種能夠用于基因編輯、修飾和分子檢測等領域的eago，并明確其具體應用方案，為復雜條件下分子檢測和動植物基因編輯、修飾提供一種新的可選的分子工具。

2、本發(fā)明第一方面公開了一種植物來源的argonaute蛋白質及其與向導核酸形成的復合物在核酸編輯和檢測中的應用，其中argonaute蛋白質來源于單子葉模式生物水稻，具體為：

3、氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白質；或，

4、與seq?id?no.1所示氨基酸序列具有至少80%同源性序列，優(yōu)選具有至少90%同源性序列，更優(yōu)選具有至少95%同源性序列，且具有相應功能的蛋白質。

5、在上述應用中，argonaute蛋白質在向導核酸介導下特異性切割靶核酸，其中向導核酸為向導dna或/和向導rna，靶核酸為dna靶或/和rna靶，且靶核酸中含有與向導核酸互補配對的序列。其中，rna靶沒有高級結構，或有高級結構，或為雙鏈rna，或為體外轉錄的rna，或為病毒基因組rna，或為mrna，或細胞內的其他rna；dna靶為合成的單鏈dna，或為雙鏈dna，或為質粒dna；可以是細胞基因組dna，還可以是細胞內的其他dna。

6、可以理解的是，本發(fā)明所用的argonaute蛋白質可以是天然提取獲得，也可以通過異源表達獲得。而且，編碼本發(fā)明argonaute蛋白質的核酸分子的序列如seq?id?no.2所示或與seq?id?no.2所示序列具有至少80%的同源性。

7、優(yōu)選地，在上述應用中，向導dna的長度為10-40?nt；其中，本發(fā)明argonaute蛋白質在向導dna介導下切割dna靶時最佳長度為13?nt，在向導dna介導下切割rna靶時最佳長度為15?nt。

8、優(yōu)選地，在上述應用中，向導rna的長度為12-40?nt；其中，本發(fā)明argonaute蛋白質在向導rna介導下切割dna靶時最佳長度為19?nt，在向導rna介導下切割rna靶時最佳長度為18?nt。

9、優(yōu)選地，在上述應用中，向導核酸的5’端具有磷酸化修飾。

10、優(yōu)選地，在上述應用中，向導dna的5’端第一個核苷酸為胸腺嘧啶（t），向導rna的5’端第一個核苷酸為尿嘧啶（u）。

11、在上述應用中，argonaute蛋白質與向導核酸形成的復合物在25-60℃下具有切割靶核酸的活性。具體地，當靶核酸為dna靶時，切割位點在與dna靶互補配對的向導核酸的5’端到3’端的第10到11位堿基之間；當靶核酸為rna靶時，切割位點在與rna靶互補配對的向導核酸的5’端到3’端的第9到10位堿基之間。

12、優(yōu)選地，在上述應用中，argonaute蛋白質與向導核酸形成的復合物在41-60℃下切割靶核酸。試驗數據表明，在向導dna介導下，argonaute蛋白質可以在25-45℃有效切割dna靶，其中41℃最佳；在向導rna介導下，argonaute蛋白質可以在25-55℃有效切割dna靶，其中50℃最佳；切割rna靶時，向導dna或向導rna可以在25-60℃有效切割rna靶標，其中45℃最佳。

13、優(yōu)選地，在上述應用中，靶核酸中含有與向導核酸互補配對的序列，具體為：

14、向導核酸具有與所述靶核酸完全互補的核苷酸序列；或，

15、向導核酸具有與靶核酸存在單堿基或雙堿基錯配的核苷酸序列，其中單堿基錯配不發(fā)生在向導核酸的5’端第一位核苷酸處。

16、另外，可以理解的是，本發(fā)明中argonaute蛋白質在向導核酸介導下特異性切割靶核酸包括以下情形：

17、argonaute蛋白質在體外切割靶核酸，其應用過程可為：將argonaute蛋白質與向導核酸孵育形成eago復合物，eago復合物與靶核酸接觸，且靶核酸存在與向導核酸序列互補配對的核苷酸序列，故argonaute蛋白質在特定位點切割靶標。

18、argonaute蛋白質在細胞內切割靶核酸時，其應用過程可為：將argonaute蛋白質與向導核酸孵育形成eago復合物，或將含有向導核酸和argonaute蛋白質基因的載體，通過轉化、轉染或轉導等方式導入植物細胞或動物細胞，進而通過靶向切割作用進行細胞表達調控。

19、本發(fā)明第二方面提供了一種核酸切割體系，其至少包括：

20、argonaute蛋白質，具體為氨基酸序列如seq?id?no.1所示的蛋白質，或為與seqid?no.1所示氨基酸序列具有至少80%同源性序列，優(yōu)選具有至少90%同源性序列，更優(yōu)選具有至少95%同源性序列，且具有相應功能的蛋白質；

21、向導核酸，5’端具有磷酸化修飾；

22、目標核酸，能夠被argonaute蛋白質在向導核酸介導下靶向裂解；

23、二價金屬陽離子。

24、在本發(fā)明的核酸切割體系，argonaute蛋白質與向導核酸結合形成eago復合物，該復合物與靶核酸接觸后，若靶核酸存在與向導核酸序列互補配對的核苷酸序列，則argonaute蛋白質在向導核酸識別引導下在特異性位點裂解靶核酸（即rna靶和/或dna靶）?；谠撉懈铙w系，argonaute蛋白質能夠用于實現核酸檢測和編輯。

25、優(yōu)選地，在上述核酸切割體系，二價金屬離子選自mg2+、mn2+、co2+、ca2+中的一種或多種；更為優(yōu)選地，二價金屬陽離子為mn2+、mg2+，且二價金屬陽離子濃度為0.5-60?mm。具體的，試驗數據表明：argonaute蛋白質切割dna靶時,在向導dna介導下，可以利用mn2+、co2+有效切割dna靶，其中在40mm?mn2+時最佳，在向導rna介導下，可以利用mn2+、mg2+有效切割dna靶，其中在0.5mm?mn2+時最佳；argonaute蛋白質切割rna靶時，在向導dna介導下，可以利用mn2+、mg2+有效切割rna靶，其中在60mm?mg2+時最佳，在向導dna介導下，可以利用mg2+、mn2+、ca2+有效切割dna靶，其中在60mm?mg2+時最佳。

26、優(yōu)選地，在上述核酸切割體系，核酸切割體系的ph為3-10.5。

27、基于本發(fā)明所用的argonaute蛋白質，本發(fā)明第三方面通過對seq?id?no.1所示序列的核酸酶活性位點進行突變，提供了一種沉默突變體，該突變體完全喪失了切割活性。其中，活性位點為seq?id?no.1所示序列的第833位、第874位、第906位和第1045位；相對于野生型，突變體將第一位和第三位上的天冬氨酸（d）突變?yōu)楸彼幔╝）。

28、本發(fā)明提供的突變體可以融合其它效應蛋白或結合被標記的向導核酸，進而拓展本發(fā)明argonaute蛋白質的應用方向。例如，將熒光標記的向導dna裝載到突變體中，突變體引導dna與其互補的靶標結合，由于dna具有熒光標記，整個過程可以實現可視化；此外，熒光標記的向導dna與rna靶結合的能力也可用于實現mirna的特異性可視化。

29、與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

30、本發(fā)明提供了能在核酸鏈引導下切割靶標核苷酸序列（即靶核酸）的一種argonaute蛋白質以及其與向導核酸形成的復合物，該argonaute蛋白質來自于植物水稻，有別于其他真核來源的argonaute，該argonaute蛋白質不僅具有切割rna靶的活性也具有切割dna靶的活性，表明了其在核酸編輯和檢測上具有應用潛力。

31、本發(fā)明提供的argonaute蛋白質對磷酸化的向導核酸（即單鏈dna（ssdna）或rna）具有結合活性，并且對rna靶或dna靶具有核酸酶活性，故當argonaute蛋白質與向導核酸和eago結合形成eago復合物后，其與靶核酸發(fā)生位點特異性切割反應，并且可通過選擇具有特定核苷酸序列的向導核酸來調節(jié)位點特異性。

32、本發(fā)明中的eago復合物能有效的使用13-15?nt的向導dna和/或18-19?nt的向導rna特異切割dna靶或rna靶，特別是以ssdna作為向導切割rna靶時具有很高的活性，而向導dna相較于向導rna價格便宜，合成時間短，可節(jié)約成本。

33、本發(fā)明所用argonaute蛋白質不存在crispr相關蛋白需依賴靶點附近的特殊核苷酸序列來識別和結合靶以及非特異性附帶切割的活性，且向導核酸設計更為方便，無需考慮位點限制。