本發(fā)明屬于中藥，涉及一種風(fēng)柜斗草均一多糖，具體涉及一種風(fēng)柜斗草均一多糖及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、免疫介導(dǎo)疾病(immune-mediated?diseases，imd)是一種以過度、不受控制的炎癥和血栓形成為特征的慢性疾病，易導(dǎo)致器官損傷、癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥等疾病的發(fā)生，甚至引起死亡。目前，已有多種治療藥物和方案被批準(zhǔn)用于imd的治療，包括糖皮質(zhì)激素和小分子化學(xué)藥物等廣譜免疫調(diào)節(jié)劑；以及高度特異性藥物，包括b淋巴細(xì)胞刺激劑、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等免疫刺激劑，人免疫球蛋白、干擾素等免疫調(diào)節(jié)劑，以及tnf、il、iak抑制劑等細(xì)胞因子抑制劑。然而，當(dāng)前的治療藥物對(duì)于imd病人的治療效果因人而異，只在30-40％的病人中取得了理想的治療效果，未能滿足臨床需求。因此，尋找和開發(fā)安全有效、價(jià)格低廉的免疫調(diào)節(jié)劑具有十分重要的理論、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。

2、隨著天然植物及其提取物或有效成分在調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤、抗炎等研究中不斷深入，因毒副作用低、療效確切、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，引起了廣泛的研究興趣。天然植物中的多糖成分是一類非常重要的生物活性大分子，可通過免疫激活和抑制的雙重調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的防控。近年來科研人員對(duì)免疫活性多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制的研究取得了很大進(jìn)展。多糖可通過激活巨噬細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)、刺激產(chǎn)生相關(guān)的細(xì)胞因子以活化t/b淋巴細(xì)胞、提高免疫系統(tǒng)對(duì)抗原的識(shí)別能力和免疫耐受能力等多種方式影響機(jī)體免疫調(diào)節(jié)。因此尋找有免疫調(diào)節(jié)活性的植物多糖是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

3、風(fēng)柜斗草為野牡丹科植物肉穗草屬楮頭紅(sarcopyramis?nepalensis?wall,s.nepalensis?wa1.)的干燥全草，是閩南地區(qū)廣泛應(yīng)用、極有價(jià)值的中草藥，具有清肺熱，去肝火之功效，主治風(fēng)濕痹痛，耳鳴耳聾及目霧羞明。已從風(fēng)柜斗草中分離和鑒定出的化學(xué)成分類型主要有黃酮、多糖、有機(jī)酸等。多糖作為風(fēng)柜斗草的主要活性成分之一，含量高達(dá)15.46-16.21％，在免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗腫瘤等多方面表現(xiàn)出明顯的生物活性，具有良好的開發(fā)前景。公開號(hào)為cn101664418a的發(fā)明專利公開了一種楮頭紅多糖在制備抗乙肝病毒的藥物中的應(yīng)用，所述楮頭紅多糖是由鼠李糖、葡萄糖和半乳糖3種單糖組成，分子量為84818da，具有抗氧化、保肝護(hù)肝和抗乙肝病毒等潛力。然而，針對(duì)同一種藥用植物多糖，通過分離純化的手段可以產(chǎn)生不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的多糖，其物理化學(xué)性質(zhì)與功效存在顯著差異；多糖的單糖組成、側(cè)鏈位置以及高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)藥理活性影響重大。

4、目前存在如下問題：風(fēng)柜斗草多糖的提取率較低，在分離純化中難度高，因此大部分藥理學(xué)研究均采用粗多糖；風(fēng)柜斗草多糖的結(jié)構(gòu)研究側(cè)重于單糖組成、側(cè)鏈位置等，對(duì)于高級(jí)結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系等研究較少，而多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)藥理活性影響重大；不同提取方法所得的多糖組成及分子量分布有很大差異，需進(jìn)一步明確其化學(xué)結(jié)構(gòu)，以探究風(fēng)柜斗草多糖結(jié)構(gòu)與功能的作用機(jī)制，近年來，風(fēng)柜斗草的化學(xué)成分及其藥理活性已被廣泛研究，但目前對(duì)風(fēng)柜斗草多糖的結(jié)構(gòu)解析及免疫調(diào)節(jié)活性未做深入研究。因此，需要提高風(fēng)柜斗草多糖的提取率，加強(qiáng)風(fēng)柜斗草多糖的分離純化、構(gòu)效關(guān)系的研究，為風(fēng)柜斗草多糖在功能性食品和藥品的產(chǎn)品開發(fā)提供理論指導(dǎo)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供了一種風(fēng)柜斗草均一多糖及其制備方法和應(yīng)用。所述風(fēng)柜斗草均一多糖通過水提醇沉、除雜、離子交換柱純化和凝膠過濾層析純化得到，風(fēng)柜斗草均一多糖由半乳糖和葡萄糖組成，結(jié)構(gòu)新穎，具有更加優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)功能，可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞raw264.7的增殖、吞噬、產(chǎn)生no的能力，顯著增加巨噬細(xì)胞raw264.7細(xì)胞因子(促炎因子tnf-α、il-6)產(chǎn)生，顯著減少巨噬細(xì)胞raw264.7抑炎因子(il-10)產(chǎn)生。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種風(fēng)柜斗草均一多糖的制備方法，包括以下步驟：

4、1)通過水提醇沉法制備得到風(fēng)柜斗草粗多糖；

5、2)將步驟1)得到的風(fēng)柜斗草粗多糖進(jìn)行除雜；

6、3)將步驟2)得到的除雜后的風(fēng)柜斗草粗多糖依次進(jìn)行離子交換柱純化、凝膠過濾層析純化，得到風(fēng)柜斗草均一多糖；所述風(fēng)柜斗草均一多糖由半乳糖和葡萄糖組成。

7、具體地，所述步驟1)的水提醇沉法具體為：將風(fēng)柜斗草和水按照料液比1kg：8-10l進(jìn)行回流提取，提取次數(shù)為2-3次，每次提取時(shí)間為1-2h，濃縮提取液，采用75-85％的乙醇水溶液進(jìn)行醇沉；優(yōu)選地，所述將醇沉得到的沉淀進(jìn)行洗滌，優(yōu)選采用90-99％體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液洗滌。在一個(gè)實(shí)施例中，將風(fēng)柜斗草和水按料液比1kg：8l混合，回流提取2次，每次2h；合并提取液，濃縮，采用80％體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液，放置過夜取沉淀，去掉上清液，沉淀物用95％體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液洗滌，揮至無醇味，干燥，即得風(fēng)柜斗草粗多糖。

8、所述步驟2)中，除雜包括：除蛋白、樹脂吸附和透析。優(yōu)選地，所述除雜具體為：

9、s1)除蛋白：將風(fēng)柜斗草粗多糖溶解于水中，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，得酶解液；采用sevage法除蛋白，收集水相；

10、s2)樹脂吸附：向水相中加入大孔樹脂x-5進(jìn)行吸附；

11、s3)透析：收集液體，經(jīng)透析、干燥，即得除雜后的風(fēng)柜斗草粗多糖樣品。

12、在一個(gè)實(shí)施例中，所述除雜具體為：

13、s1)除蛋白：將風(fēng)柜斗草粗多糖溶解于水中，加入木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解，得酶解液；依次向酶解液中加入同等體積的sevage試劑和石油醚進(jìn)行萃取，所述sevage試劑為體積比為4:1的氯仿-正丁醇混合液，收集水相；

14、s2)樹脂吸附：向水相中加入大孔樹脂x-5，充分混勻，過夜吸附；

15、s3)透析：收集液體，用透析袋(3000da)透析48h，除去小分子組分，冷凍干燥，即得除雜后的風(fēng)柜斗草粗多糖樣品。

16、所述步驟3)中，離子交換柱純化具體為：將步驟2)得到的除雜后的風(fēng)柜斗草粗多糖溶于水中，過離子交換柱deae?seplife?ff26/300純化，依次采用純水、0.1-0.3m?nacl溶液進(jìn)行梯度洗脫，優(yōu)選依次采用純水、0.1m、0.2m、0.3m?nacl溶液進(jìn)行梯度洗脫，更優(yōu)選為采用0.1m?nacl溶液為洗脫液時(shí)洗脫得到的風(fēng)柜斗草粗多糖。在一個(gè)實(shí)施例中，將除雜后的風(fēng)柜斗草粗多糖溶于水，得到風(fēng)柜斗草粗多糖母液；經(jīng)deae?seplife?ff26/300離子交換柱分離，依次采用純水、0.1m、0.2m、0.3m?nacl溶液進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，繪制離子純化洗脫曲線并合并同一洗脫峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，經(jīng)濃縮、除鹽、干燥，得到經(jīng)離子交換柱純化的風(fēng)柜斗草粗多糖。

17、風(fēng)柜斗草粗多糖進(jìn)行離子交換柱純化后，進(jìn)行凝膠過濾層析純化，所述凝膠純化具體為：過凝膠層析柱hipreptm?26/60sephacryltm分離純化，采用水進(jìn)行洗脫。在一個(gè)實(shí)施例中，采用0.1m?nacl溶液為洗脫液時(shí)洗脫得到的風(fēng)柜斗草粗多糖，進(jìn)行凝膠過濾層析純化，凝膠層析柱為hipreptm?26/60sephacryltm，洗脫液為水，得到風(fēng)柜斗草均一多糖。在一個(gè)實(shí)施例中，將經(jīng)離子交換柱純化的風(fēng)柜斗草粗多糖溶于水得到風(fēng)柜斗草粗多糖母液，經(jīng)hipreptm?26/60sephacryltm分離純化，采用水進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量并繪制洗脫曲線，并合并同一洗脫峰對(duì)應(yīng)的洗脫液，經(jīng)濃縮、干燥，即得風(fēng)柜斗草均一多糖。

18、第二方面，本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案所述制備方法制備得到的風(fēng)柜斗草均一多糖，所述的風(fēng)柜斗草均一多糖由摩爾比為42.03:54.14的半乳糖和葡萄糖組成。

19、所述風(fēng)柜斗草均一多糖的純度為92.7％，重均分子量為10-20kda，優(yōu)選為19.320kda，結(jié)構(gòu)如下所示：

20、

21、其中，m為8，n為7。

22、第三方面，本發(fā)明還提供了一種上述技術(shù)方案所述制備方法制備得到的風(fēng)柜斗草均一多糖或上述技術(shù)方案所述風(fēng)柜斗草均一多糖在免疫調(diào)節(jié)劑中的應(yīng)用。

23、優(yōu)選地，所述免疫調(diào)節(jié)劑為調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的藥物，所述調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞包括促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活力、促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放no、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子中的一種或多種。所述細(xì)胞因子包括促炎因子和抑炎因子中的一種或多種，所述促炎因子包括tnf-α和il-6中的一種以上，所述抑炎因子包括il-10。

24、第四方面，本發(fā)明還提供了一種免疫調(diào)節(jié)劑，包括上述技術(shù)方案所述制備方法制備得到的風(fēng)柜斗草均一多糖或上述技術(shù)方案所述風(fēng)柜斗草均一多糖。

25、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明將風(fēng)柜斗草進(jìn)行水提醇沉、除雜以及deae離子交換純化和凝膠過濾層析純化，制備得到風(fēng)柜斗草均一多糖，本發(fā)明得到風(fēng)柜斗草均一多糖純度高，為92.7％，重均分子量mw為19.320kda，由半乳糖和葡萄糖按摩爾比42.03：54.14組成的一種多糖。結(jié)合甲基化和核磁分析，解析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，確定風(fēng)柜斗草均一多糖(hls-d1n1)結(jié)構(gòu)新穎。多糖的單糖組成、側(cè)鏈位置以及高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)藥理活性均具有顯著性影響，本發(fā)明得到的風(fēng)柜斗草均一多糖具有更加優(yōu)異的免疫調(diào)節(jié)功能，在6.25-100μg/ml濃度范圍內(nèi)，可顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞raw264.7的增殖、吞噬、產(chǎn)生no的能力，顯著增加巨噬細(xì)胞raw264.7產(chǎn)生細(xì)胞因子(促炎因子tnf-α、il-6)，顯著減少巨噬細(xì)胞raw264.7產(chǎn)生抑炎因子(il-10)，可用于制備免疫調(diào)節(jié)藥物，為風(fēng)柜斗草均一多糖在功能性食品、保健品和藥品等產(chǎn)品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。