本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)，具體涉及一種體外擴(kuò)增誘導(dǎo)cd8+?t細(xì)胞為cd8+組織定居t細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1、cd8+組織定居記憶性t細(xì)胞(tissue?resident?memory?t?cells，trm)是一群獨(dú)特的、區(qū)別于循環(huán)記憶性cd8+?t細(xì)胞的記憶性淋巴細(xì)胞群體，主要定居于外周非淋巴組織中，包括皮膚、肺、胃腸道、唾液腺和生殖道等屏障組織和肝臟、腦、胰腺等非黏膜組織。不同組織中的cd8+?trm細(xì)胞具有共同的關(guān)鍵性表型特征，包括組織出口相關(guān)分子的下調(diào)和組織束縛分子的上調(diào)。cd69是一種膜結(jié)合的ⅱ型c-凝集素受體，是cd8+?trm細(xì)胞關(guān)鍵性的表型特征，通過抑制s1pr1的表達(dá)，促進(jìn)cd8+?trm細(xì)胞的駐留。cd8+?trm細(xì)胞另一個(gè)重要表征是cd103，由tgf-β誘導(dǎo)而來，可以通過與上皮細(xì)胞表達(dá)的鈣粘蛋白e結(jié)合而介導(dǎo)與上皮細(xì)胞的緊密黏附，從而促使cd8+?trm細(xì)胞的組織駐留。除了表面標(biāo)志之外，cd8+?trm細(xì)胞的分化、存活和功能需要多種轉(zhuǎn)錄因子共同協(xié)調(diào)作用，如blimp1、hobit、runx3和batf等。cd8+?trm細(xì)胞在局部組織抵御病原體感染和抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用，可以通過分泌細(xì)胞毒性分子(如顆粒酶b和穿孔素)直接殺傷靶細(xì)胞，也可以通過分泌細(xì)胞因子激活或招募其他免疫細(xì)胞，間接發(fā)揮保護(hù)作用。

2、近年來，trm細(xì)胞已成為免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，越來越多的研究將cd8+?trm細(xì)胞作為腫瘤、炎癥性疾病的治療靶點(diǎn)進(jìn)行探索。然而，由于cd8+?trm細(xì)胞比例較低，且從組織中分離困難，因此，建立體外有效的cd8+?trm細(xì)胞分化體系顯得尤為關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中體外擴(kuò)增誘導(dǎo)形成cd8+?trm細(xì)胞的技術(shù)缺陷，提供一種體外擴(kuò)增誘導(dǎo)cd8+?t細(xì)胞為cd8+組織定居t細(xì)胞的方法，本發(fā)明提供的方法以及利用il-25所產(chǎn)生的cd8+?trm細(xì)胞不僅數(shù)量充足，而且細(xì)胞功能強(qiáng)；所述方法簡單、易操作；本發(fā)明所產(chǎn)生的cd8+?trm細(xì)胞適用于原發(fā)性干燥綜合征(primarysyndrome，pss)、自身免疫性皮膚病、多發(fā)性硬化癥(multiple?sclerosis，ms)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid?arthritis，ra)等cd8+?trm細(xì)胞失調(diào)相關(guān)疾病的免疫學(xué)機(jī)制研究。

2、本發(fā)明所述的體外擴(kuò)增誘導(dǎo)cd8+?t細(xì)胞為組織定居t細(xì)胞的方法，其步驟如下：

3、(1)制備小鼠脾臟單個(gè)細(xì)胞懸液，使用磁珠分選出cd8+?t細(xì)胞，將所述cd8+?t細(xì)胞置于包被有anti-mouse?cd3抗體的24孔培養(yǎng)板中，然后往所述培養(yǎng)板中加入anti-mousecd28抗體和il-2培養(yǎng)48h，獲得a細(xì)胞群；

4、(2)收集步驟(1)中培養(yǎng)板中的所述a細(xì)胞群，置于新的培養(yǎng)液中，添加il-2、il-25和tgf-β，繼續(xù)培養(yǎng)48h，獲得b細(xì)胞群，從所述b細(xì)胞群中分離得到cd8+?trm細(xì)胞。

5、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述cd8+?t細(xì)胞的濃度為2×106個(gè)/ml，培養(yǎng)液體積為1ml。

6、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述步驟(1)的培養(yǎng)板和所述步驟(2)的培養(yǎng)板所采用的細(xì)胞培養(yǎng)液均為含10％fbs的rpmi-1640。

7、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述步驟(1)的所述anti-mouse?cd3抗體的包被濃度為1μg/ml。

8、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述步驟(1)中的所述anti-mouse?cd28抗體的濃度為1μg/ml，所述步驟(1)中的所述il-2的濃度為10ng/ml。

9、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述步驟(1)中的所述anti-mouse?cd28抗體的濃度為1μg/ml，所述步驟(1)中的所述il-2的濃度為10ng/ml。

10、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述步驟(2)中的所述il-2的濃度為20ng/ml。

11、作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，對所述步驟(2)獲得的cd8+?trm細(xì)胞進(jìn)行檢測，包括檢測所述cd8+?trm細(xì)胞在所述b細(xì)胞群中所占的比例，以及檢測所述cd8+trm細(xì)胞的表面標(biāo)志物和分泌的細(xì)胞因子；

12、其中，所述表面標(biāo)志物包括cd8、cd69和cd103；

13、所述分泌的細(xì)胞因子包括ifn-γ和顆粒酶b。

14、對于本發(fā)明的技術(shù)方案，添加物tgf-β能夠通過smad3直接誘導(dǎo)cd103的表達(dá)，也可以通過對抗t-bet、eomes和tcf1介導(dǎo)的cd103表達(dá)抑制間接上調(diào)cd103的表達(dá)，從而支持cd103+cd8+?trm細(xì)胞的發(fā)育和維持；同時(shí)，il-2的存在有利于cd8+?t細(xì)胞的存活。

15、其中，白介素-25(interleukin-25，il-25)于2001年首次被發(fā)現(xiàn)，是il-17細(xì)胞因子家族的成員，又被稱為il-17e。然而，il-25與il-17家族其他成員氨基酸序列同源性較低，因此其生物學(xué)效應(yīng)與家族內(nèi)其他成員不同，是il-17家族中獨(dú)特的細(xì)胞因子。il-25最初被定義為th2細(xì)胞來源的細(xì)胞因子，后來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、cd8+?t細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dentritic?cell，dc)、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞和2型固有淋巴細(xì)胞(group2innate?lymphoid?cell，ilc2)均可產(chǎn)生il-25。il-25的靶細(xì)胞有t細(xì)胞、ilc2、髓系細(xì)胞、恒定自然殺傷性t細(xì)胞(invariant?natural?killer?t?cell，inkt)以及部分非造血細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，il-25與受體復(fù)合物結(jié)合后，通過多種信號傳導(dǎo)，可以刺激細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡以及誘導(dǎo)多種趨化因子和黏附分子的表達(dá)。

16、(1)本發(fā)明創(chuàng)新性地加入il-25作為體外擴(kuò)增誘導(dǎo)cd8+組織定居t細(xì)胞的誘導(dǎo)劑一方面能夠穩(wěn)定快速地誘導(dǎo)cd8+?t細(xì)胞分化為cd8+?trm細(xì)胞，有效提高cd8+?trm細(xì)胞的形成比例和殺傷性分子ifn-γ和顆粒酶b的表達(dá)，其誘導(dǎo)效果優(yōu)于單獨(dú)使用tgf-β或聯(lián)合應(yīng)用tgf-β和il-15。

17、(2)通過本發(fā)明提供的方法所得到的cd8+?trm細(xì)胞在研究免疫學(xué)機(jī)制和/或檢測與cd8+?trm細(xì)胞失調(diào)相關(guān)疾病或病癥治療藥物的生物學(xué)功能中，其中，cd8+?trm細(xì)胞失調(diào)相關(guān)疾病包括但不限于自身免疫性疾病(原發(fā)性干燥綜合征、自身免疫性皮膚病、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)以及其他特異性和慢性炎癥性疾病，為其相關(guān)生物學(xué)功能研究及相關(guān)疾病的免疫學(xué)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

18、(3)本發(fā)明誘導(dǎo)產(chǎn)生的cd8+?trm細(xì)胞，其轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果能夠顯示cd8+?trm細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的變化(s1pr1、runx3、sell等)。

19、(4)本發(fā)明的方法操作簡單、成本較低，便于推廣應(yīng)用。

20、應(yīng)當(dāng)理解，前述構(gòu)思以及在下面更加詳細(xì)地描述的額外構(gòu)思的所有組合只要在這樣的構(gòu)思不相互矛盾的情況下都可以被視為本公開的發(fā)明主題的一部分。

21、結(jié)合附圖從下面的描述中可以更加全面地理解本發(fā)明教導(dǎo)的前述和其他方面、實(shí)施例和特征。本發(fā)明的其他附加方面例如示例性實(shí)施方式的特征和/或有益效果將在下面的描述中顯見，或通過根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)的具體實(shí)施方式的實(shí)踐中得知。