本發(fā)明涉及一種新型crispr-cas12i系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

1、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)和crispr相關(guān)(cas)基因，統(tǒng)稱(chēng)為crispr-cas或crispr/cas系統(tǒng)，目前已被理解為對(duì)細(xì)菌和古細(xì)菌提供抗噬菌體感染的免疫。原核生物適應(yīng)性免疫的crispr-cas系統(tǒng)是一組極其多樣的效應(yīng)子、非編碼元件以及基因座結(jié)構(gòu)，其可被工程化并用于基因編輯、靶標(biāo)檢測(cè)和疾病治療等應(yīng)用。張鋒等發(fā)現(xiàn)了cas12a蛋白(過(guò)去稱(chēng)為cpf1蛋白)，可用于基因編輯和基因診斷。后來(lái)又發(fā)現(xiàn)了更多的cas12蛋白，包括cas12b(c2c1)、cas12c(c2c3)、cas12d(casy)、cas12e(casx)、cas12f(c2c10/cas14)、cas12k(c2c5)，但其性能各有優(yōu)劣。

2、盡管有現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域仍然需要新的cas蛋白和crispr-cas系統(tǒng)以滿(mǎn)足多樣化的應(yīng)用需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明通過(guò)提供新的cas12i蛋白以及crispr-cas系統(tǒng)滿(mǎn)足了上述需求。

2、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種cas12i蛋白，其包含與seq?id?no:1-10(優(yōu)選地，seq?id?no:1-3和6，更優(yōu)選地，seq?id?no:1)中任一項(xiàng)所示的氨基酸序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或100％同一性的氨基酸序列。

3、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述cas12i蛋白實(shí)質(zhì)性缺乏(例如，保留小于50％、40％、35％、30％、27.5％、25％、22.5％、20％、17.5％、15％、12.5％、10％、7.5％、5％、4％、3％、2.5％、2％、1％或更低的)對(duì)應(yīng)的野生型cas12i蛋白的針對(duì)與指導(dǎo)序列互補(bǔ)的靶dna的靶序列的間隔序列(spacer)特異性核酸內(nèi)切酶切割活性。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述cas12i蛋白連接至一個(gè)或多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域。

4、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種編碼所述cas12i蛋白的多核苷酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種載體，其包含所述的多核苷酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種遞送系統(tǒng)，其包含(1)遞送介質(zhì)；和(2)所述cas12i蛋白、多核苷酸或載體。

5、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種工程化的、非天然存在的crispr-cas系統(tǒng)，其包含：

6、(1)所述的cas12i蛋白或編碼所述cas12i蛋白的多核苷酸；和

7、(2)crispr?rna(crrna)或編碼所述crrna的多核苷酸，所述crrna包含：

8、(i)能夠與靶dna的靶序列雜交的間隔(spacer)序列，和

9、(ii)連接至所述間隔序列的能夠引導(dǎo)所述cas12i蛋白結(jié)合至所述crrna以形成靶向所述靶序列的crispr-cas復(fù)合物的直接重復(fù)(direct?repeat，dr)序列。

10、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種crispr-cas系統(tǒng)，其包括一個(gè)或多個(gè)載體，所述一個(gè)或多個(gè)載體包含：

11、(1)第一調(diào)控元件，所述第一調(diào)控元件可操作地連接至編碼所述的cas12i蛋白的核苷酸序列；和

12、(2)第二調(diào)控元件，所述第二調(diào)控元件可操作地連接至編碼crispr?rna(crrna)的多核苷酸，所述crrna包含：

13、(i)能夠與靶dna的靶序列雜交的間隔(spacer)序列，和

14、(ii)連接至所述間隔序列的能夠引導(dǎo)所述cas12i蛋白結(jié)合至所述crrna以形成靶向所述靶序列的crispr-cas復(fù)合物的直接重復(fù)(direct?repeat，dr)序列；

15、其中所述第一調(diào)控元件和所述第二調(diào)控元件位于所述crispr-cas載體系統(tǒng)的相同或不同載體上。

16、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種工程化的、非天然存在的crispr-cas復(fù)合物，其包含：

17、(1)所述的cas12i蛋白；和

18、(2)crispr?rna(crrna)，所述crrna包含：

19、(i)能夠與靶dna的靶序列雜交的間隔(spacer)序列，和

20、(ii)連接至所述間隔序列的的直接重復(fù)(direct?repeat，dr)序列；所述dr序列引導(dǎo)所述cas12i蛋白結(jié)合至所述crrna。

21、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種修飾靶dna的方法，其包括使所述靶dna與所述的crispr-cas系統(tǒng)或復(fù)合物接觸，所述接觸導(dǎo)致cas12i蛋白對(duì)所述靶dna的修飾。

22、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞或其后代，其包含所述的cas12i蛋白、多核苷酸、載體、遞送系統(tǒng)、crispr-cas系統(tǒng)或復(fù)合物，優(yōu)選地，所述細(xì)胞選自原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、脊椎動(dòng)物細(xì)胞、無(wú)脊椎動(dòng)物細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、和人細(xì)胞。

23、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種非人多細(xì)胞生物體，其包含所述的細(xì)胞或其后代；優(yōu)選地，所述非人多細(xì)胞生物體是用于人類(lèi)基因相關(guān)疾病的動(dòng)物(例如，嚙齒類(lèi)或非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物)模型。

24、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種修飾靶dna的方法，其包括使所述靶dna與所述的crispr-cas系統(tǒng)或復(fù)合物接觸，所述接觸導(dǎo)致cas12i蛋白對(duì)所述靶dna的修飾。

25、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種來(lái)自所述的方法的細(xì)胞或其后代，其包含在未經(jīng)受所述方法的細(xì)胞中不存在的所述修飾。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種來(lái)自所述的細(xì)胞或其后代的細(xì)胞產(chǎn)物，其中所述產(chǎn)物是以相對(duì)于來(lái)自未經(jīng)受所述方法的細(xì)胞的細(xì)胞產(chǎn)物的性質(zhì)或量來(lái)修飾的。

26、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種非特異性切割非靶dna的方法，所述方法包括使所述靶dna與所述的crispr-cas系統(tǒng)或復(fù)合物接觸，由此所述間隔序列與所述靶dna的靶序列雜交和所述cas12i蛋白對(duì)所述靶序列的切割導(dǎo)致所述cas12i蛋白通過(guò)間隔序列非特異性核酸內(nèi)切酶旁切活性來(lái)切割所述非靶dna。

27、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中的靶dna的方法，所述方法包括：

28、(1)使所述樣品與所述的crispr-cas系統(tǒng)或復(fù)合物與被切割后可釋放可檢測(cè)信號(hào)的報(bào)告核酸接觸，由此所述間隔序列與所述靶dna的靶序列的雜交和所述cas12i蛋白對(duì)所述靶序列的切割導(dǎo)致所述cas12i蛋白通過(guò)間隔序列非特異性核酸內(nèi)切酶旁切活性來(lái)切割所述報(bào)告核酸；和

29、(2)測(cè)量由所述報(bào)告核酸的切割產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)，由此檢測(cè)所述靶dna在所述樣品中的存在。

30、在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種治療有需要的受試者的病癥或疾病的方法，所述方法包括向所述受試者施用所述的crispr-cas系統(tǒng)。

31、在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含所述的crispr-cas系統(tǒng)；優(yōu)選所述系統(tǒng)的組分在同一個(gè)容器中或者在單獨(dú)的容器中。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種無(wú)菌容器，其包含所述的crispr-cas系統(tǒng)；優(yōu)選所述無(wú)菌容器是注射器。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種可植入裝置，其包含所述的crispr-cas系統(tǒng)；優(yōu)選所述crispr-cas系統(tǒng)存儲(chǔ)在儲(chǔ)庫(kù)中。