本發(fā)明屬于微生物基因改造，具體涉及一種酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白及其衍生產(chǎn)物在生產(chǎn)工業(yè)乙醇中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、在生物乙醇發(fā)酵過程中，常常會(huì)出現(xiàn)高乙醇濃度、高糖、高溫、低ph和有毒副產(chǎn)物等高脅迫環(huán)境，嚴(yán)重抑制會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵提前終止。因此，獲得對(duì)高脅迫環(huán)境耐受性提高的酵母菌種，可提高生產(chǎn)效率，節(jié)約成本。尤其是在超高濃度乙醇發(fā)酵過程和纖維素乙醇生產(chǎn)過程中更為重要，是現(xiàn)代乙醇工業(yè)生產(chǎn)中的一項(xiàng)核心工作。目前釀酒酵母菌株的選育主要有自然選育、適應(yīng)性馴化、誘變育種及基因工程等方法。酵母菌在發(fā)酵后期，乙醇成為主要的脅迫因素。隨著基因組，轉(zhuǎn)錄組等多組學(xué)的研究表明乙醇耐受性受多基因和網(wǎng)絡(luò)化的復(fù)雜調(diào)控，可能發(fā)生表達(dá)水平變化的基因數(shù)量可到上百或上千。乙醇耐性分子機(jī)制的復(fù)雜性意味著單基因或代謝途徑改造難以獲得高乙醇耐受性的表型。因此對(duì)細(xì)胞整體代謝網(wǎng)絡(luò)的改造的技術(shù)手段顯得尤為重要。

2、利用全局轉(zhuǎn)錄機(jī)制工程(global?transcription?machinery?engineering，gtme)技術(shù)改造全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的方法，利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行隨機(jī)突變和定向篩選、實(shí)現(xiàn)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄水平的精細(xì)調(diào)節(jié)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)的適度調(diào)控，使細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)平衡進(jìn)化，并使細(xì)胞在整體水平上提高酒精產(chǎn)率或提高耐逆性等性狀，是酵母菌代謝工程改造的研究方向。轉(zhuǎn)錄因子spt15是tata結(jié)合蛋白，tata結(jié)合蛋白作為第一個(gè)與dna結(jié)合的復(fù)合物蛋白，在預(yù)起始復(fù)合物的組裝與轉(zhuǎn)錄的過程中起著非常重要的作用。與rna聚合酶ⅱ及十幾種基本的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后，可以直接轉(zhuǎn)錄基因組中絕大多數(shù)相關(guān)基因mrna。然而通過定點(diǎn)突變轉(zhuǎn)錄因子spt15使得到的突變蛋白作用的基因結(jié)果并不明確，目前通過突變轉(zhuǎn)錄因子spt15獲得耐高濃度乙醇、耐高溫、耐高滲性、耐高乙酸含量突變蛋白的報(bào)道十分有限，這無疑阻礙了工業(yè)乙醇的生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白、所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白的編碼基因或包含所述編碼基因的基因改造產(chǎn)物在工業(yè)生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用，通過對(duì)起始轉(zhuǎn)錄因子編碼基因spt15進(jìn)行點(diǎn)突變改造，從而提高了酵母菌株對(duì)乙酸濃度、高滲透性、高溫和乙醇濃度耐受性，擴(kuò)增了工業(yè)生產(chǎn)乙醇的方法。

2、本發(fā)明提供了一種酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白、所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白的編碼基因或包含所述編碼基因的基因改造產(chǎn)物在工業(yè)生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用；

3、所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為酵母起始轉(zhuǎn)錄因子spt15的第127位賴氨酸突變?yōu)橐韵乱环N氨基酸殘基：甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、異亮氨酸和天冬氨酸。

4、優(yōu)選的，所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子spt15的氨基酸序列如seq?id?no:1所示；

5、優(yōu)選的，當(dāng)突變?yōu)楦拾彼釙r(shí)，酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-g，氨基酸序列如seq?id?no:2所示；

6、當(dāng)突變?yōu)楣劝滨０窌r(shí)，酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-q，氨基酸序列如seqid?no:3所示；

7、當(dāng)突變?yōu)榻z氨酸時(shí)，酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-s，氨基酸序列如seq?idno:4所示；

8、當(dāng)突變?yōu)楫惲涟彼釙r(shí)，酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-i，氨基酸序列如seqid?no:5所示；

9、當(dāng)突變?yōu)樘於彼釙r(shí)，酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-d，氨基酸序列如seqid?no:6所示。

10、優(yōu)選的，所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白spt15-g、spt15-q、spt15-s、spt15-i和spt15-d的編碼基因的核苷酸序列依次如seq?id?no:16～seq?id?no:20中至少一項(xiàng)所示。

11、優(yōu)選的，所述包含所述編碼基因的基因改造產(chǎn)物包括包含所述編碼基因的重組載體、包含所述編碼基因的重組酵母菌株或包含所述重組載體的重組酵母菌株。

12、優(yōu)選的，當(dāng)所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-g或spt15-q時(shí)，在所述重組酵母菌株生產(chǎn)工業(yè)乙醇過程中，發(fā)酵體系中乙酸濃度為5～6g/l。

13、優(yōu)選的，當(dāng)所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-g或spt15-s時(shí)，在所述重組酵母菌株生產(chǎn)工業(yè)乙醇過程中，發(fā)酵體系中氯化鈉的質(zhì)量百分比為7％～9％。

14、優(yōu)選的，當(dāng)所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-i或spt15-s時(shí)，在所述重組酵母菌株生產(chǎn)工業(yè)乙醇過程中，發(fā)酵溫度為41～43℃。

15、優(yōu)選的，當(dāng)所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-g、spt15-s或spt15-d時(shí)，在所述重組酵母菌株生產(chǎn)工業(yè)乙醇過程中，發(fā)酵體系中乙醇的體積百分比為14％～19％。

16、本發(fā)明提供了一種酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白、所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白的編碼基因或包含所述編碼基因的重組載體在提高酵母對(duì)發(fā)酵環(huán)境耐受性中的應(yīng)用，所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為所述應(yīng)用中的酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白。

17、優(yōu)選的，當(dāng)所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-g或spt15-q時(shí)，所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白、所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白的編碼基因或所述重組載體在提高酵母對(duì)乙酸耐受性中的應(yīng)用；

18、當(dāng)所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-g或spt15-s時(shí)，所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白、酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白的編碼基因或所述重組載體在提高酵母對(duì)氯化鈉耐受性中的應(yīng)用；

19、當(dāng)所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-i或spt15-s時(shí)，所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白、酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白的編碼基因或所述重組載體在提高酵母對(duì)發(fā)酵溫度耐受性中的應(yīng)用；

20、當(dāng)所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為spt15-g、spt15-s或spt15-d時(shí)，所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白、酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白的編碼基因或所述重組載體在提高酵母對(duì)乙醇耐受性中的應(yīng)用。

21、本發(fā)明提供了一種酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白、所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白的編碼基因或包含所述編碼基因的基因改造產(chǎn)物在工業(yè)生產(chǎn)乙醇中的應(yīng)用；所述酵母起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白為酵母起始轉(zhuǎn)錄因子spt15的第127位賴氨酸突變?yōu)橐韵乱环N氨基酸殘基：甘氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、異亮氨酸和天冬氨酸。本發(fā)明通過對(duì)酵母spt15基因進(jìn)行單點(diǎn)突變，篩選得到具有多種耐受性的突變基因。實(shí)驗(yàn)表明將所述酵母spt15突變基因通過重組載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化入酵母中表達(dá)起始轉(zhuǎn)錄因子突變蛋白，經(jīng)過耐性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明，invsc1-spt15-g和invsc1-spt15-q對(duì)6g/l的乙酸具有良好的耐受性，其耐受性分別是invsc1-neo對(duì)照菌株的3.64倍和4.79倍；invsc1-spt15-g、invsc1-spt15-s對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)9％的氯化鈉高滲透壓具有良好的耐受性，其耐受性分別是invsc1-neo對(duì)照菌株的1.16倍和1.75倍；重組菌株invsc1-spt15-i對(duì)42℃高溫具有良好的耐受性，其耐受性分別是對(duì)照菌株invsc1-neo的1.58倍和1.45倍。invsc1-spt15-g、invsc1-spt15-s、invsc1-spt15-d對(duì)體積分?jǐn)?shù)為16％的乙醇溶液具有良好的耐受性，其耐受性分別是invsc1-neo對(duì)照組的2.76倍、4.17倍和3.08倍。可見，本發(fā)明所述酵母spt15突變基因能夠提高酵母對(duì)乙酸、高滲透性、高溫和乙醇中至少一種因素具有良好的耐受性，為基因工程構(gòu)建耐受酵母提供了基礎(chǔ)。