背景技術(shù)：

1、已顯示能夠互補(bǔ)性結(jié)合表達(dá)的mrna的雙鏈rna(dsrna)能夠通過已被稱為rna干擾(rnai)的機(jī)理來阻斷基因表達(dá)(fire等,1998,nature.1998年2月19日；391(6669):806-11以及elbashir等,2001,nature.2001年5月24日；411(6836):494-8)。短dsrna在包括脊椎動(dòng)物的許多生物體中引導(dǎo)基因特異性轉(zhuǎn)錄后沉默，并且已成為一種可用于研究基因功能的工具。rnai由rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(risc)介導(dǎo)，所述復(fù)合物是一種使與裝載至risc復(fù)合物中的沉默觸發(fā)物同源的信使rna降解的序列特異性多組分核酸酶。干擾rna(在本文中被稱為irna)諸如sirna、抗第二鏈rna和微小rna是通過基因沉默，即通過使mrna分子降解來抑制蛋白質(zhì)的基因翻譯以阻止形成蛋白質(zhì)的寡核苷酸。對(duì)于在醫(yī)學(xué)中的治療應(yīng)用來說，基因沉默劑正變得日益重要。

2、根據(jù)watts和corey,journal?of?pathology(2012；第226卷,第365-379頁)，存在可用于設(shè)計(jì)核酸沉默觸發(fā)物的算法，但所有這些算法都具有嚴(yán)重局限性?？赡芤捎酶鞣N實(shí)驗(yàn)方法來鑒定強(qiáng)力irna，因?yàn)樗惴ú豢紤]諸如靶標(biāo)mrna的三級(jí)結(jié)構(gòu)或rna結(jié)合蛋白牽連的因素。因此，發(fā)現(xiàn)具有最小脫靶效應(yīng)的強(qiáng)力核酸沉默觸發(fā)物是一個(gè)復(fù)雜過程。對(duì)于這些高度帶電荷分子的藥物開發(fā)來說，必要的是它們可被經(jīng)濟(jì)地合成，分配至靶標(biāo)組織中，進(jìn)入細(xì)胞，并且在可接受的毒性限度內(nèi)發(fā)揮功能。

3、lp(a)是一種主要在肝中表達(dá)的異質(zhì)低密度脂蛋白粒子(witztum和ginsberg,jlipid?res.2016年3月；57(3):336-9)。它由載脂蛋白(a)(apolipoprotein(a))(apo(a)由lpa基因編碼)通過apob多肽連接于ldl組成。遺傳限定的高lp(a)血清水平不受膳食和運(yùn)動(dòng)的影響，并且通過相關(guān)聯(lián)的動(dòng)脈粥樣硬化潛在性而與罹患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)聯(lián)(alonso等,journal?of?the?american?college?of?cardiology第63卷,第19期,2014)。根據(jù)診斷學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)，患者的lp(a)血清水平是冠心病和主動(dòng)脈瓣狹窄的一種高度普遍的獨(dú)立遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素(saeedi和frohlich?clinical?diabetes?and?endocrinology(2016)2:7)。除間接標(biāo)準(zhǔn)一般性ldl降低措施之外，不存在當(dāng)前被核準(zhǔn)的特定lp(a)降低療法。因此，當(dāng)前需要用于有效治療、預(yù)防諸如以下以及與以下相關(guān)的病癥以及降低罹患諸如以下以及與以下相關(guān)的病癥的風(fēng)險(xiǎn)的方法：中風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成和心血管疾病諸如冠心病、主動(dòng)脈瓣狹窄以及其他尚未鑒定的相關(guān)病癥、病理或綜合征。本發(fā)明解決這個(gè)未滿足的醫(yī)學(xué)需要：

4、本發(fā)明的第一方面涉及一種用于抑制細(xì)胞中l(wèi)pa的表達(dá)的核酸，所述核酸包含至少一個(gè)雙鏈體區(qū)域，所述雙鏈體區(qū)域包含第一鏈的至少一部分和至少部分地互補(bǔ)于所述第一鏈的第二鏈的至少一部分，其中所述第一鏈至少部分地互補(bǔ)于從lpa基因轉(zhuǎn)錄的rna的至少一部分，其中所述第一鏈包含選自以下序列的核苷酸序列：seq?id?no:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73。

5、在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸在第一鏈中包含具有參考序列seq?id?no:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73中的任一者的至少15個(gè)，優(yōu)選地，至少16個(gè)，更優(yōu)選地，至少17個(gè)，還更優(yōu)選地，至少18個(gè)，并且最優(yōu)選地，至少19個(gè)核苷酸的序列。

6、在一個(gè)實(shí)施方案中，相對(duì)于包含在第一鏈序列中的具有參考序列的部分，第一鏈序列中的單核苷酸錯(cuò)配的數(shù)目是至多三，優(yōu)選地是至多二，更優(yōu)選地是至多一，并且最優(yōu)選地是零。

7、第二鏈可包含seq?id?no:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。

8、第一鏈可包含seq?id?no:5和seq?id?no:9的核苷酸序列，和/或第二鏈可包含seqid?no:6和seq?id?no:10的核苷酸序列。

9、第一鏈和/或第二鏈的長(zhǎng)度可各自為17-35個(gè)核苷酸，并且至少一個(gè)雙鏈體區(qū)域的長(zhǎng)度可為10-25個(gè)核苷酸。雙鏈體可包含兩個(gè)單獨(dú)鏈，或它可包含含有第一鏈和第二鏈的單一鏈。

10、核酸可：a)在兩個(gè)末端均是鈍性末端；b)在一個(gè)末端具有突出部分，并且在另一末端具有鈍性末端；或c)在兩個(gè)末端均具有突出部分。

11、第一鏈和/或第二鏈上的一個(gè)或多個(gè)核苷酸可被修飾以形成經(jīng)修飾核苷酸。第一鏈的奇數(shù)編號(hào)核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)可被修飾。第一鏈的偶數(shù)編號(hào)核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)可由至少第二修飾加以修飾，其中所述至少第二修飾不同于一個(gè)或多個(gè)奇數(shù)核苷酸上的修飾。一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾偶數(shù)編號(hào)核苷酸中的至少一者可鄰近于一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾奇數(shù)編號(hào)核苷酸中的至少一者。

12、在本發(fā)明的核酸中，第一鏈中的多個(gè)奇數(shù)編號(hào)核苷酸可被修飾。第一鏈中的多個(gè)偶數(shù)編號(hào)核苷酸可由第二修飾加以修飾。第一鏈可包含由共同修飾加以修飾的鄰近核苷酸。第一鏈還可包含由第二不同修飾加以修飾的鄰近核苷酸。

13、第二鏈的奇數(shù)編號(hào)核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)可由不同于第一鏈上的奇數(shù)編號(hào)核苷酸的修飾的修飾加以修飾，和/或第二鏈的偶數(shù)編號(hào)核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)可由第一鏈的奇數(shù)編號(hào)核苷酸的相同修飾加以修飾。第二鏈的一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾偶數(shù)編號(hào)核苷酸中的至少一者可鄰近于一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾奇數(shù)編號(hào)核苷酸。第二鏈的多個(gè)奇數(shù)編號(hào)核苷酸可由共同修飾加以修飾，和/或多個(gè)偶數(shù)編號(hào)核苷酸可由存在于第一鏈奇數(shù)編號(hào)核苷酸上的相同修飾加以修飾。第二鏈上的多個(gè)奇數(shù)編號(hào)核苷酸可由第二修飾加以修飾，其中所述第二修飾不同于第一鏈奇數(shù)編號(hào)核苷酸的修飾。

14、第二鏈可包含由共同修飾加以修飾的鄰近核苷酸，所述共同修飾可為不同于第一鏈的奇數(shù)編號(hào)核苷酸的修飾的第二修飾。

15、在本發(fā)明的核酸中，第一鏈中的奇數(shù)編號(hào)核苷酸中的每一個(gè)和第二鏈中的偶數(shù)編號(hào)核苷酸中的每一個(gè)可用共同修飾加以修飾，并且第一鏈中的偶數(shù)編號(hào)核苷酸中的每一個(gè)可用第二修飾加以修飾，并且第二鏈中的奇數(shù)編號(hào)核苷酸中的每一個(gè)可用第二不同修飾加以修飾。

16、本發(fā)明的核酸可具有第一鏈的相對(duì)于第二鏈的未修飾或以不同方式修飾的核苷酸，移位至少一個(gè)核苷酸的經(jīng)修飾核苷酸。

17、一個(gè)或多個(gè)修飾可各自以及單獨(dú)地選自由以下組成的組：3'-末端脫氧胸腺嘧啶、2'-o-甲基、2'-脫氧修飾、2'-氨基修飾、2'-烷基修飾、嗎啉代基修飾、氨基磷酸酯修飾、5'-硫代磷酸酯基團(tuán)修飾、5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物修飾以及膽固醇基衍生物或十二烷酸雙癸酰胺基團(tuán)修飾，和/或經(jīng)修飾核苷酸可為鎖核苷酸、無堿基核苷酸或包含非天然堿基的核苷酸中的任一者。

18、至少一個(gè)修飾可為2'-o-甲基，和/或至少一個(gè)修飾可為2'-f。

19、作為第二方面，本發(fā)明還提供了一種用于抑制細(xì)胞中l(wèi)pa的表達(dá)的核酸，所述核酸包含至少一個(gè)雙鏈體區(qū)域，所述雙鏈體區(qū)域包含第一鏈的至少一部分和至少部分地互補(bǔ)于所述第一鏈的第二鏈的至少一部分，其中所述第一鏈至少部分地互補(bǔ)于從lpa基因轉(zhuǎn)錄的rna的至少一部分，其中所述第一鏈包含選自以下序列的核苷酸序列：seq?id?no:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73，其中第一鏈的核苷酸由在奇數(shù)編號(hào)核苷酸上的第一修飾加以修飾，并且由在偶數(shù)編號(hào)核苷酸上的第二修飾加以修飾，并且所述第二鏈的核苷酸由在偶數(shù)編號(hào)核苷酸上的第三修飾加以修飾，并且由在奇數(shù)編號(hào)核苷酸上的第四修飾加以修飾，其中至少所述第一修飾不同于所述第二修飾，并且所述第三修飾不同于所述第四修飾。第二鏈可包含seq?id?no:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、64、66、68、70、72或74的核苷酸序列。第三修飾和第一修飾可相同，和/或第二修飾和第四修飾可相同。

20、第一修飾可為2’ome，并且第二修飾可為2’f。

21、在第二方面的核酸中，第一鏈可包含seq?id?no:5和seq?id?no:9的核苷酸序列，并且第二鏈可包含seq?id?no:6和seq?id?no:10的核苷酸序列。

22、序列和修飾可如下表中所示；所述表格顯示基于如本文提供的表1的摘錄的優(yōu)選序列：

23、 seq?id?no:5 5’auaacucuguccauuacca?3’ 6162717181736152736 seq?id?no:6 5’ugguaauggacagaguuau?3’ 1845261846364645161 seq?id?no:9 5’auaacucuguccauuaccg?3’ 6162717181736152738 seq?id?no:10 5’cgguaauggacagaguuau?3’ 3845261846364645161

24、其中特定修飾由以下數(shù)字描繪

25、1＝2’f-du；

26、2＝2’f-da；

27、3＝2’f-dc；

28、4＝2’f-dg；

29、5＝2’-ome-ru；

30、6＝2’-ome-ra；

31、7＝2’-ome-rc；

32、8＝2’-ome-rg。

33、本發(fā)明的核酸可在第一鏈和/或第二鏈的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)末端3’核苷酸和/或一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)末端5’核苷酸之間包含硫代磷酸酯鍵。它可包含在第一鏈上的三個(gè)末端3’核苷酸中的每個(gè)核苷酸之間和在第一鏈上的三個(gè)末端5’核苷酸中的每個(gè)核苷酸之間的兩個(gè)硫代磷酸酯鍵，以及在第二鏈的3’末端的三個(gè)末端核苷酸之間的兩個(gè)硫代磷酸酯鍵。

34、這種核酸可綴合于配體。

35、作為第三方面，本發(fā)明還提供了一種用于抑制細(xì)胞中l(wèi)pa的表達(dá)的核酸，所述核酸包含至少一個(gè)雙鏈體區(qū)域，所述雙鏈體區(qū)域包含第一鏈的至少一部分和至少部分地互補(bǔ)于所述第一鏈的第二鏈的至少一部分，其中所述第一鏈至少部分地互補(bǔ)于從lpa基因轉(zhuǎn)錄的rna的至少一部分，其中所述第一鏈包含選自以下序列的核苷酸序列：seq?id?no:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、63、65、67、69、71或73，并且其中所述核酸綴合于配體。

36、配體可包含(i)一個(gè)或多個(gè)n-乙?；肴樘前?galnac)部分及其衍生物，和(ii)接頭，其中所述接頭使所述galnac部分綴合于如在任何先前方面所定義的序列。接頭可為二價(jià)或三價(jià)或四價(jià)分支結(jié)構(gòu)。核苷酸可如本文所定義加以修飾。

37、配體可包括式i：

38、[s-x1-p-x2]3-a-x3-(i)

39、其中：

40、s代表糖，其中所述糖是n-乙酰基半乳糖胺；

41、x1代表c3-c6亞烷基或(-ch2-ch2-o)m(-ch2)2-，其中m是1、2或3；

42、p是磷酸酯或經(jīng)修飾的磷酸酯(優(yōu)選地是硫代磷酸酯)；

43、x2是亞烷基或式(-ch2)n-o-ch2-亞烷基醚，其中n＝1-6；

44、a是分支單元；

45、x3代表橋接單元；

46、其中本發(fā)明的核酸通過磷酸酯或經(jīng)修飾的磷酸酯(優(yōu)選地通過硫代磷酸酯)綴合于x3。

47、因此，本發(fā)明另外提供了一種具有以下結(jié)構(gòu)中的一者的綴合核酸

48、

49、

50、

51、

52、

53、其中z代表如本文在之前定義的核酸。

54、或者，本發(fā)明的核酸可綴合于具有以下結(jié)構(gòu)的配體

55、

56、本發(fā)明還涉及一種用于抑制細(xì)胞中l(wèi)pa基因的表達(dá)的綴合物，所述綴合物包含含有本發(fā)明的任何方面的核酸的核酸部分和配體部分，所述核酸部分包含至少一個(gè)雙鏈體區(qū)域，所述雙鏈體區(qū)域包含第一rna鏈的至少一部分和至少部分地互補(bǔ)于所述第一鏈的第二rna鏈的至少一部分，其中所述第一鏈至少部分地互補(bǔ)于從所述lpa基因轉(zhuǎn)錄的rna的至少一部分，所述配體部分包含接頭部分，優(yōu)選地包含絲氨醇衍生接頭部分，以及用于在體內(nèi)靶向細(xì)胞，并且只綴合于一個(gè)或兩個(gè)rna鏈的3’和/或5’末端的靶向性配體，其中所述第一rna鏈的5’末端未被綴合，其中：

57、(i)所述第二rna鏈在5’末端綴合于所述靶向性配體，并且其中(a)所述第二rna鏈還在3’末端綴合于所述靶向性配體，并且所述第一rna鏈的3’末端未被綴合；或(b)所述第一rna鏈在3’末端綴合于所述靶向性配體，并且所述第二rna鏈的3’末端未被綴合；或(c)所述第二rna鏈與所述第一rna鏈兩者均還在3’末端綴合于所述靶向性配體；或

58、(ii)所述第二rna鏈與所述第一rna鏈兩者均在3’末端綴合于所述靶向性配體，并且所述第二rna鏈的5’末端未被綴合，或

59、本發(fā)明涉及一種用于抑制細(xì)胞中l(wèi)pa基因的表達(dá)的綴合物，所述綴合物包含核酸部分和配體部分，所述核酸部分包含至少一個(gè)雙鏈體區(qū)域，所述雙鏈體區(qū)域包含第一rna鏈的至少一部分和至少部分地互補(bǔ)于所述第一鏈的第二rna鏈的至少一部分，其中所述第一鏈至少部分地互補(bǔ)于從所述lpa基因轉(zhuǎn)錄的rna的至少一部分，所述配體部分包含接頭部分以及用于在體內(nèi)靶向細(xì)胞，并且只綴合于一個(gè)或兩個(gè)rna鏈的3’和/或5’末端的靶向性配體，其中所述第一rna鏈的5’末端未被綴合，其中：

60、(i)所述第二rna鏈在5’末端綴合于所述靶向性配體，并且其中(a)所述第二rna鏈還在3’末端綴合于所述靶向性配體，并且所述第一rna鏈的3’末端未被綴合；或(b)所述第一rna鏈在3’末端綴合于所述靶向性配體，并且所述第二rna鏈的3’末端未被綴合；或(c)所述第二rna鏈與所述第一rna鏈兩者均還在3’末端綴合于所述靶向性配體；或

61、(ii)所述第二rna鏈與所述第一rna鏈兩者均在3’末端綴合于所述靶向性配體，并且所述第二rna鏈的5’末端未被綴合。

62、接頭部分可以例如是絲氨醇衍生接頭部分，或本文所述的其他接頭類型中的一者。

63、本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明的任何方面的核酸或綴合核酸以及生理上可接受的賦形劑的組合物。

64、還提供了一種用于治療疾病、病癥或綜合征和/或制造用于治療疾病、病癥或綜合征的藥劑的根據(jù)本發(fā)明的任何方面的核酸或綴合核酸。

65、本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防疾病、病癥或綜合征的方法，所述方法包括向需要治療的個(gè)體施用包含根據(jù)本發(fā)明的任何方面的核酸或綴合核酸的組合物。核酸或綴合核酸可以皮下方式、靜脈內(nèi)方式或使用任何其他施加途徑諸如口服、經(jīng)直腸或腹膜內(nèi)施加途徑向受試者施用。

66、在皮下施加之后，本發(fā)明物可以組織特異性方式遞送至肝(肝細(xì)胞)，并且特異性靶向lpa，以降低非所要副作用以及實(shí)現(xiàn)達(dá)到所需作用所必需的較低治療劑量。

67、本發(fā)明物或包含本發(fā)明的核酸或綴合核酸的藥物組合物可用于治療疾病、病癥或綜合征。治療可以是為了預(yù)防中風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成或心血管疾病諸如冠心病或主動(dòng)脈瓣狹窄以及與含lp(a)粒子水平升高相關(guān)的任何其他疾病或病理，以及降低罹患中風(fēng)、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成或心血管疾病諸如冠心病或主動(dòng)脈瓣狹窄以及與含lp(a)粒子水平升高相關(guān)的任何其他疾病或病理的風(fēng)險(xiǎn)。

68、還包括了一種制備本發(fā)明的核酸或綴合核酸的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路