本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種抗小反芻獸疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白v的單克隆抗體。

背景技術(shù)：

1、小反芻獸疫病毒(peste?des?petits?ruminants?virus，pprv)是引起小反芻獸疫(peste?des?petits?ruminants，ppr)的病原，該病毒主要感染山羊、綿羊、小鹿瞪羚及長角羚等反芻動物，致使動物表現(xiàn)發(fā)熱、腹瀉、腸炎、肺炎等臨床癥狀。ppr是一種重大跨境動物傳染病，被oie列為法定必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。2015年fao和oie組織全球部長級會議，通過并啟動《全球小反芻獸疫控制與根除策略》。

2、pprv基因組編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白，v蛋白是p基因在rna編輯時第751位插入一個堿基g，導(dǎo)致密碼子發(fā)生移位而產(chǎn)生的非結(jié)構(gòu)蛋白。麻疹病毒屬中v蛋白的長度不同：pprv為298aa、cdv和rpv為299aa、mv和dmv分別為300和303aa。理論推測v蛋白分子量為32.28kda，但實際大小在40kd左右，所含ser大多(60％)能被磷酸化可能是造成分子量變大的主要因素。麻疹病毒屬的編輯位點(-5’-ttaaaagggcacag-3’)是保守的，在pprv中該位點位于p基因的751bp位，即v基因與p基因含有相同的n端；但由于插入堿基g后發(fā)生密碼子移位，形成的v蛋白具有富含半胱氨酸(cys)的c端。his和7個cys通過與兩個zn2+結(jié)合形成鋅指結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在拮抗先天性免疫中發(fā)揮重要作用。

3、非結(jié)構(gòu)蛋白不僅在麻疹病毒屬中保守，在副粘病毒科中也保守，這說明它們在各自種屬中對于病毒的增殖和致病性非常關(guān)鍵。副粘病毒科v蛋白能夠與n蛋白和l蛋白結(jié)合參與rna合成的調(diào)節(jié)，還通過參與轉(zhuǎn)錄過程促進病毒的復(fù)制，但其具體機理還有待闡釋。副粘病毒科v蛋白在病毒逃避先天性免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮著非常重要的拮抗作用，拮抗形式主要分為兩類：(1)v蛋白抑制ifn產(chǎn)生的上游通路，根據(jù)pamps的不同主要分為抑制rig-i樣受體通路或rlrs樣受體通路；(2)v蛋白抑制ifn誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。研究表明，副粘病毒科病毒v蛋白通過含有鋅指結(jié)構(gòu)的c端與mda5結(jié)合，阻止dsrna與mda5的結(jié)合及mda5多聚化，進而抑制ifn的產(chǎn)生。不同病毒v蛋白結(jié)合mda5的精確位點具有特異性，如piv5、niv病毒v蛋白含有保守的cys的大loop，該結(jié)構(gòu)在結(jié)合mda5的過程中是非必需的，但在mev以及muv等病毒v蛋白結(jié)合mda5的過程中，cys形成的鋅指結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。除牛瘟病毒的v蛋白外，副粘病毒科不同種屬病毒，如piv5、hpiv2、muv、mev、hev、niv、sev等的v蛋白都能與mda5第701-816位氨基酸區(qū)(helicase區(qū))結(jié)合，阻礙dsrna-mda5的結(jié)合空間位阻。晶體結(jié)構(gòu)顯示，v蛋白結(jié)合mda5后，其atpase區(qū)由折疊變得舒展，破壞了該區(qū)域的疏水位點。這說明副粘病毒科病毒v蛋白能利用其c端結(jié)合mda5，但結(jié)合的分子機制具有病毒特異性。新近研究發(fā)現(xiàn)，pprv?v蛋白能結(jié)合lgp2進而促進其對rig-i的負調(diào)控作用，這解釋了v蛋白對rig-i依賴性ifn產(chǎn)生的抑制機理；v蛋白第110位酪氨酸(y110)是與stat1相互作用的特定氨基酸殘基，它們的結(jié)合可改變stat1的亞細胞分布；v蛋白利用其c端cys殘基和trp殘基結(jié)合stat2，改變stat2的細胞定位而抑制jak-stat途徑的信號傳導(dǎo)并抑制ifn反應(yīng)。此外，缺失v蛋白或v蛋白cys富集區(qū)的重組病毒體外增殖能力變?nèi)?。由此可見，副粘病毒科病毒v蛋白在病毒生活周期和病毒誘導(dǎo)的先天性免疫中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。

4、單克隆抗體是由高度一致的免疫細胞制成的抗體，這些免疫細胞來源于單一親本細胞。單克隆抗體識別某一個特定的抗原表位，具有單價親和力，其與特定抗原的結(jié)合能力取決于每對輕/重鏈對的可變區(qū)，且主要由互補決定區(qū)(cdr)確定。因此，單克隆抗體可用來檢測或純化含有特異抗原表位的物質(zhì)，現(xiàn)已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要工具。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明利用重組pprv?v蛋白免疫動物，獲得了穩(wěn)定分泌抗pprv?v蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，測序得到了該單克隆抗體的互補決定區(qū)及可變區(qū)序列，可用于小反芻獸疫病毒體外檢測或小反芻獸疫病毒v蛋白功能研究。具體包括以下內(nèi)容：

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種抗小反芻獸疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白v的單克隆抗體，所述單克隆抗體包括抗體重鏈和抗體輕鏈；

3、所述抗體重鏈的可變區(qū)cdr包括氨基酸序列如seq?id?no.1所示的cdr1、氨基酸序列如seq?id?no.2所示的cdr2和氨基酸序列如seq?id?no.3所示的cdr3；

4、所述抗體輕鏈的可變區(qū)cdr包括氨基酸序列如seq?id?no.4所示的cdr1、氨基酸序列如seq?id?no.5所示的cdr2和氨基酸序列如seq?id?no.6所示的cdr3。

5、優(yōu)選地，所述抗體重鏈的可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.7所示，所述抗體輕鏈的可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no.8所示。

6、第二方面，本發(fā)明提供了一種核酸，所述核酸編碼上述第一方面所述單克隆抗體的抗體重鏈和抗體輕鏈。

7、優(yōu)選地，編碼所述抗體重鏈的可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.9所示，編碼所述抗體輕鏈的可變區(qū)的核苷酸序列如seq?id?no.10所示。

8、第三方面，本發(fā)明提供了上述第一方面所述的單克隆抗體在制備檢測小反芻獸疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白抗體的試劑中的應(yīng)用。

9、優(yōu)選地，所述試劑為阻斷elisa試劑盒。

10、第四方面，本發(fā)明提供了一種酶結(jié)合物，所述酶結(jié)合物包括：

11、(i)上述第一方面所述的單克隆抗體；

12、(ii)和與(i)中單克隆抗體偶聯(lián)的辣根過氧化物酶。

13、第五方面，本發(fā)明提供了一種小反芻獸疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白v抗體檢測elisa試劑盒，所述試劑盒包括上述第四方面所述的酶結(jié)合物。

14、優(yōu)選地，所述試劑盒包括小反芻獸疫病毒抗原包被的酶標板、對照血清、封閉液、稀釋液、上述第四方面所述的酶結(jié)合物、洗滌液、顯色劑、終止液。

15、優(yōu)選地，所述包被抗原為小反芻獸疫病毒v蛋白。

16、第六方面，本發(fā)明提供了上述第一方面所述的單克隆抗體，或上述第四方面所述的酶結(jié)合物，或上述第五方面所述的elisa試劑盒在以非疾病診斷為目的的小反芻獸疫病毒自然感染性檢測或在小反芻獸疫病毒v蛋白功能研究中的應(yīng)用。

17、第七方面，本發(fā)明提供了一種檢測小反芻獸疫病毒的阻斷elisa方法，其，所述方法包括以下步驟：

18、(1)用包被液(0.05mol/l碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，ph9.6)稀釋純化的重組pprv?v蛋白至1μg/ml，50μl/孔，封板膜封板，4℃包被過夜；

19、(2)1×pbst洗滌3次，加入1％bsa封閉液，100μl/孔，封板膜封板，37℃孵育1h；

20、(3)1×pbst洗滌3次，分別加入陽性、陰性血清和待檢血清，50μl/孔，封板膜封板，37℃孵育45min；

21、(4)1×pbst洗滌3次，加入pbst稀釋的hrp-3e10(1︰8×103)，50μl/孔，封板膜封板，37℃孵育30min；

22、(5)加入底物tmb，50μl/孔，封板膜封板，37℃反應(yīng)15min；

23、(6)加入終止液(1m硫酸)，50μl/孔；

24、(7)用酶標檢測儀檢測各孔od450值；

25、(8)結(jié)果判定：根據(jù)公式計算各樣品抑制率(s/nc％)值，s/nc％＝(od450待檢樣品/od450陰性對照)×100％，結(jié)果判斷標準為：s/nc％＞50％，抗體陰性；s/nc％≤50％，抗體陽性。

26、本發(fā)明的有益效果是：①本發(fā)明提供了一種抗小反芻獸疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白v的單克隆抗體；②所述單克隆抗體與小反芻獸疫病毒具有高親和力和良好的反應(yīng)原性；可用于診斷自然感染性小反芻獸疫為目的的檢測以及v蛋白功能研究。