本發(fā)明涉及基因工程，更具體的說是涉及一種優(yōu)化海藻糖酶催化體系提高海藻糖轉(zhuǎn)化率的方法。

背景技術(shù)：

1、海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子通過α，α-1，1糖苷鍵連接在一起形成的非還原性二糖，廣泛分布于植物、藻類、真菌、細(xì)菌、昆蟲和其它無脊椎動(dòng)物中。海藻糖是自然界中發(fā)現(xiàn)的主要滲透保護(hù)劑之一，在生物應(yīng)對(duì)滲透脅迫和極端溫度的適應(yīng)性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。海藻糖的甜度只有蔗糖的45％，由于其味道溫和，口感清爽適合應(yīng)用于食品調(diào)味料中；在醫(yī)藥工業(yè)可用作試劑藥和診斷藥的穩(wěn)定劑；由于海藻糖具有極強(qiáng)的保濕作用及防曬、防紫外線等多方面的生理功效，可以作為保濕劑、保護(hù)劑加入化妝品中。

2、現(xiàn)如今，海藻糖的生產(chǎn)方法分為生物提取法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法。生物提取法是以酵母、霉菌為提取源，通過干燥等處理使其積累海藻糖，然后使用有機(jī)溶劑抽提得到。微生物發(fā)酵法是通過誘變或者基因改造的方法選育海藻糖高產(chǎn)菌株，然后培養(yǎng)，發(fā)酵，提取獲得海藻糖。酶轉(zhuǎn)化法以葡萄糖、淀粉或者麥芽糊精為底物，體外酶催化底物轉(zhuǎn)化為海藻糖。

3、生物提取法利用微生物自身的抗逆性產(chǎn)生海藻糖，在逆境中需要更豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高了成本，且該方法的海藻糖產(chǎn)量低、耗時(shí)長(zhǎng)還伴隨著極大的不穩(wěn)定性，不適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)工藝復(fù)雜，在微生物生長(zhǎng)的過程中會(huì)產(chǎn)生諸多副產(chǎn)物，導(dǎo)致產(chǎn)物純化精制階段雜質(zhì)多、成本高，耗時(shí)相對(duì)于生物提取法有減少但仍不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。酶轉(zhuǎn)化法中的單酶法生產(chǎn)海藻糖的反應(yīng)是可逆的，導(dǎo)致海藻糖的轉(zhuǎn)化率被限制在較低水平，且單酶法使用的底物麥芽糖成本較高。

4、因此，提供一種優(yōu)化海藻糖酶催化體系提高海藻糖轉(zhuǎn)化率的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種優(yōu)化海藻糖酶催化體系提高海藻糖轉(zhuǎn)化率的方法。

2、本發(fā)明通過酶轉(zhuǎn)化法中的雙酶法生產(chǎn)海藻糖，工藝流程簡(jiǎn)單，使用的底物麥芽糊精成本低，酶法催化的專一性強(qiáng)，這減少了副產(chǎn)物種類，有利于產(chǎn)物海藻糖的后續(xù)純化和精制處理；酶法催化的效率高，大大縮短了生產(chǎn)的時(shí)間；而且酶法反應(yīng)穩(wěn)定性強(qiáng)，海藻糖的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率基本維持在較高的水平，適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

3、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

4、一種優(yōu)化海藻糖酶催化體系提高海藻糖轉(zhuǎn)化率的方法，具體步驟如下：

5、(1)將麥芽寡糖基海藻糖水解酶mtsase、麥芽寡糖基海藻糖合酶mthase和4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶4αgt基因序列進(jìn)行優(yōu)化；優(yōu)化后獲得seq?id?no.4-6所示的序列mtsase-op、mthase-op和4αgt-op；

6、(2)分別構(gòu)建pbad-mtsase-op、pbad-mthase-op和pbad-4αgt-op菌株，對(duì)應(yīng)制備mtsase-op、mthase-op和4αgt-op粗酶液；

7、(3)將mtsase-op、mthase-op和4αgt-op粗酶液按照1：1：1的比例與麥芽糊精進(jìn)行反應(yīng)。

8、進(jìn)一步，所述的方法在生產(chǎn)海藻糖中的應(yīng)用。

9、進(jìn)一步，所述的方法在提高海藻糖轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。

10、進(jìn)一步，seq?id?no.4-6所示的序列mtsase-op、mthase-op和4αgt-op在提高海藻糖轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。

11、進(jìn)一步，pbad-mtsase-op、pbad-mthase-op和pbad-4αgt-op菌株在提高海藻糖轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。

12、進(jìn)一步，mtsase-op、mthase-op和4αgt-op粗酶液在提高海藻糖轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。

13、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開提供了一種優(yōu)化海藻糖酶催化體系提高海藻糖轉(zhuǎn)化率的方法，能提高利用大腸桿菌雙酶法生產(chǎn)海藻糖產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率；通過適當(dāng)?shù)男蛄袃?yōu)化，提高了酶的表達(dá)水平和反應(yīng)體系中海藻糖的含量，使轉(zhuǎn)化率達(dá)到了83.3％，為海藻糖的進(jìn)一步大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種優(yōu)化海藻糖酶催化體系提高海藻糖轉(zhuǎn)化率的方法，其特征在于，具體步驟如下：

2.權(quán)利要求1所述的方法在生產(chǎn)海藻糖中的應(yīng)用。

3.權(quán)利要求1所述的方法在提高海藻糖轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。

4.seq?id?no.4-6所示的序列mtsase-op、mthase-op和4αgt-op在提高海藻糖轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。

5.pbad-mtsase-op、pbad-mthase-op和pbad-4αgt-op菌株在提高海藻糖轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。

6.mtsase-op、mthase-op和4αgt-op粗酶液在提高海藻糖轉(zhuǎn)化率中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種優(yōu)化海藻糖酶催化體系提高海藻糖轉(zhuǎn)化率的方法，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開的一種優(yōu)化海藻糖酶催化體系提高海藻糖轉(zhuǎn)化率的方法，通過對(duì)麥芽寡糖基海藻糖水解酶、麥芽寡糖基海藻糖合酶和4?α?葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列進(jìn)行優(yōu)化，提高了酶的表達(dá)水平和反應(yīng)體系中海藻糖的含量，使轉(zhuǎn)化率達(dá)到了83.3％，為海藻糖的進(jìn)一步大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)研發(fā)人員：劉龍,陳堅(jiān),呂雪芹,張雷達(dá),趙偉,李陽(yáng)陽(yáng),劉琦,趙鈺涵
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26