本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程，尤其涉及dek618蛋白及其相關(guān)生物材料在調(diào)控植物籽粒發(fā)育中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、玉米是我國三大糧食作物之一，也是重要的飼料及工業(yè)原料。籽粒是產(chǎn)量的重要影響因素，主要由胚、胚乳和種皮三部分構(gòu)成，籽粒大小也受這三方面共同影響。成熟籽粒中，胚乳約占籽粒重量的83%，富含淀粉和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，是主要的營養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)存場所。玉米籽粒的發(fā)育對玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)都有較大影響。

2、籽粒發(fā)育受到復(fù)雜的遺傳網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，以突變體為研究對象，能夠發(fā)掘大量影響籽粒發(fā)育的基因。籽粒突變體是研究玉米種子發(fā)育的重要材料。不同類型的玉米籽粒突變體，如小籽粒(smallkernel，smk)、胚缺陷(embryo?defective，emb)、胚乳缺陷?(defectivekernel，dek)等突變類型被廣泛應(yīng)用于籽粒發(fā)育調(diào)控基因的克隆和功能解析研究。dek?突變體是較為常見的胚與胚乳均發(fā)育缺陷的突變體，表型明顯，大部分在授粉后11天能夠顯示出表型。這時(shí)期的突變體籽粒小于正常籽粒，種皮為偏白色，胚乳中淀粉不飽和，胚和胚乳的發(fā)育多滯留在早期突變體階段。突變基因的類型也較多，如dek1基因編碼一個(gè)鈣蛋白酶，影響糊粉層細(xì)胞的分化，突變體籽粒中胚乳無糊粉層，胚乳質(zhì)地柔軟呈粉質(zhì)（lid?etal.,?2002）。dek45編碼一個(gè)e+型ppr蛋白，定位于線粒體，參與線粒體基因轉(zhuǎn)錄后c→u的編輯，影響線粒體的正常功能，進(jìn)而導(dǎo)致突變體籽粒胚和胚乳的發(fā)育缺陷（ren?et?al.,2019）。?dek44?編碼一個(gè)定位于線粒體的50s?核糖體蛋白l9，該基因參與線粒體與和基因組中與呼吸鏈相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響籽粒發(fā)育（qi?et?al.,?2019）。

3、植物細(xì)胞器葉綠體和線粒體中存在廣泛的轉(zhuǎn)錄后rna?c→u的編輯，這些轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過編輯后才能翻譯成正常的蛋白發(fā)揮功能。rna?編輯需要多種編輯因子組成的?rna?編輯體復(fù)合物參與，但其具體的分子調(diào)控機(jī)理仍不清楚。對?smk和dek類型的突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)ppr(pentatricopetide?repeat)蛋白家族作為反式作用因子，廣泛參與了葉綠體和線粒體的rna編輯，對開花植物種子的基部轉(zhuǎn)移層細(xì)胞分化以及胚和胚乳的早期發(fā)育具有重要作用?？寺pr基因并進(jìn)行功能機(jī)制的分析對編輯體的研究有重要意義。這些ppr蛋白的突變造成線粒體功能受損，能量代謝受阻，嚴(yán)重影響胚和胚乳的發(fā)育。以上研究結(jié)果表明，胚與胚乳的發(fā)育是非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，對玉米籽粒形態(tài)建成具有重大影響。

4、因此，進(jìn)一步發(fā)掘影響籽粒發(fā)育的關(guān)鍵基因，對全面揭示玉米籽粒發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、第一方面，本發(fā)明提供了dek618蛋白或dek618蛋白的融合蛋白、或其編碼基因、或含有其編碼基因的生物材料在調(diào)控植物籽粒發(fā)育中的應(yīng)用；所述dek618蛋白的氨基酸序列為如下至少一種：

2、（a）seq?id?no.1所示序列；

3、（b）將seq?id?no.1所示序列經(jīng)過一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸殘基的取代、和/或缺失、和/或添加且具有調(diào)控植物籽粒發(fā)育功能的序列。

4、dek618蛋白是一種植物線粒體、葉綠體及細(xì)胞核普遍存在的ppr類型蛋白，其在線粒體中特異性表達(dá)，并特異性識(shí)別線粒體基因嘧啶(c)到尿嘧啶(u)的編輯。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，dek618蛋白能夠直接參與種子線粒體蛋白組裝，對籽粒胚乳發(fā)育、線粒體電子呼吸鏈有正調(diào)控作用，該基因的表達(dá)被抑制后，線粒體電子傳遞鏈亞基ccmc第184位、ccmb第428位、ccmfc第1219位和cob第298位共4個(gè)位點(diǎn)的堿基編輯完全缺失，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生改變，線粒體復(fù)合物iii和超級復(fù)合物i+iii2的組裝和活性受到影響，因此導(dǎo)致籽粒發(fā)育缺陷，變小，從而影響植物籽粒發(fā)育。

5、在一些實(shí)施方案中，所述融合蛋白是在seq?id?no.1所示氨基酸序列的n端和/或c端連接標(biāo)簽、酶切位點(diǎn)和/或連接肽序列得到的氨基酸序列。

6、在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能；在c端和/或n端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。

7、更為具體地，本發(fā)明提供了所述dek618蛋白或dek618蛋白的融合蛋白、或其編碼基因、或含有其編碼基因的生物材料在以下至少一方面的應(yīng)用：

8、（1）調(diào)控植物籽粒重量或大小；

9、（2）調(diào)控植物胚乳發(fā)育；

10、（3）調(diào)控植物植株高度；

11、（4）調(diào)控植物產(chǎn)量；

12、（5）調(diào)控植物籽粒的淀粉或蛋白含量；

13、（6）調(diào)控線粒體的rna編輯。

14、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述dek618蛋白或dek618蛋白的融合蛋白、或其編碼基因、或含有其編碼基因的生物材料在植物品種改良中的應(yīng)用。

15、在一些實(shí)施方案中，所述改良包括植物籽粒重量或大小改良、植物胚乳發(fā)育改良、植株高度改良、產(chǎn)量提高、品質(zhì)提高等。

16、優(yōu)選地，所述dek618蛋白的編碼基因?yàn)槿缦轮辽僖环N：

17、（1）seq?id?no.2所示序列；

18、（2）在seq?id?no.2基礎(chǔ)上經(jīng)過一至數(shù)個(gè)堿基替換和/或一至數(shù)個(gè)堿基的插入和/或缺失或大片段的核苷酸序列插入/缺失/移位/倒位所形成的能影響種子籽粒發(fā)育的dna分子；

19、（3）在0.1×sspe（或0.1×ssc）、0.1%（w/v）sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜，能夠與seq?id?no.2所示序列雜交且編碼植物籽粒發(fā)育相關(guān)蛋白的dna分子；

20、（4）與seq?id?no.2所示序列具有85%以上（例如86%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%）的同源性且編碼植物籽粒發(fā)育相關(guān)蛋白的dna分子。

21、seq?id?no.2所示序列由2409個(gè)核苷酸組成，自5’末端第101位核苷酸為外顯子，沒有內(nèi)含子。

22、優(yōu)選地，通過調(diào)節(jié)dek618蛋白或基因的表達(dá)量或活性調(diào)節(jié)植物籽粒的發(fā)育、或調(diào)節(jié)植物的籽粒重量、或調(diào)節(jié)籽粒長度或?qū)挾?、或調(diào)節(jié)產(chǎn)量、或調(diào)節(jié)植物籽粒的淀粉或蛋白含量、或調(diào)控線粒體的rna編輯。

23、優(yōu)選地，通過雜交技術(shù)或轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因編輯技術(shù)調(diào)節(jié)dek618蛋白或基因的表達(dá)量或活性。

24、優(yōu)選地，所述生物材料為重組dna、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒載體、病毒載體、工程菌或非可再生的植物細(xì)胞或組織。

25、優(yōu)選地，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；優(yōu)選地，所述植物為禾本科植物；更優(yōu)選地，所述植物為玉蜀黍?qū)僦参?；最?yōu)選地，所述植物為玉米。

26、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因植物的制備方法，包括：向植物中導(dǎo)入所述的dek618蛋白或dek618蛋白的融合蛋白、或其編碼基因、或含有其編碼基因的生物材料。

27、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)品的應(yīng)用，所述產(chǎn)品為農(nóng)藥、肥料或肥料添加劑；所述產(chǎn)品中含有所述的dek618蛋白或dek618蛋白的融合蛋白、或其編碼基因、或含有其編碼基因的生物材料；所述應(yīng)用為以下至少一種：

28、（1）調(diào)控植物籽粒發(fā)育；

29、（2）調(diào)控植物籽粒重量或大?。?/p>

30、（3）調(diào)控植物胚乳發(fā)育；

31、（4）調(diào)控植物植株高度；

32、（5）調(diào)控植物產(chǎn)量；

33、（6）調(diào)控植物籽粒的淀粉或蛋白含量；

34、（7）植物品種改良；

35、（8）調(diào)控線粒體的rna編輯。

36、在本發(fā)明中，當(dāng)dek618蛋白或基因的表達(dá)量或活性被抑制時(shí)，植物籽粒的發(fā)育停滯、籽粒重量減少、籽粒長度或?qū)挾茸冃?、植物籽粒的淀粉或蛋白含量減少、產(chǎn)量降低、植物高度降低、線粒體功能缺失。

37、在本發(fā)明中，核苷酸全長序列或其片段通常可以用pcr擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于pcr擴(kuò)增法，可根據(jù)本實(shí)施例公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cdna文庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cdna文庫作為模板，擴(kuò)增到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，通常需要兩次或者多次的巢式pcr擴(kuò)增，然后將各次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物按正確的順序拼接在一起。一旦獲得了有關(guān)序列，可以用重組法來大批量的獲得有關(guān)序列。通常是將其克隆入載體，然后通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化等常規(guī)方法從增殖的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入實(shí)施例蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，實(shí)施例蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成多肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用人工或者自動(dòng)進(jìn)行，可以分別化學(xué)合成實(shí)施例蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接，以產(chǎn)生全長的蛋白質(zhì)分子。

38、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

39、本發(fā)明發(fā)現(xiàn)dek618蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物籽粒發(fā)育中具有重要的作用，其相關(guān)生物材料可用于調(diào)控植物籽粒產(chǎn)量、籽粒胚發(fā)育、籽粒中淀粉、蛋白含量，在高等植物如玉米的遺傳資源種質(zhì)改良等方面具有重大的推廣應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)為解析籽粒形成的發(fā)育機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。