本發(fā)明屬于心血管疾病藥物，涉及心肌保護(hù)藥物及其應(yīng)用，具體地說，涉及重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑制備及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、心肌梗死是一種高發(fā)病率的心血管疾病，主要由于急性持續(xù)性冠狀動脈缺血缺氧引起的心肌壞死，到目前為止，還沒有一種特定的藥物能有效治療心肌梗死后的心肌損傷。另外，在心肌梗死的治療中，對急性心肌梗死的再灌注治療會引起缺血再灌注損傷等不良反應(yīng)，其中線粒體在這些損傷中起重要作用。由1200多種蛋白質(zhì)組成的線粒體對許多細(xì)胞過程都很重要，它的功能障礙會導(dǎo)致數(shù)百種代謝疾病，線粒體相關(guān)蛋白的任何紊亂都會對細(xì)胞產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。然而，其中一些蛋白質(zhì)的作用仍然未知。一個新的蛋白-含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白(oxidoreductase?like?domain?containing?1，oxld1)因其與線粒體的相關(guān)性而引起了人們的關(guān)注，oxld1位于17q25.3的末端區(qū)。一些研究發(fā)現(xiàn)，位于17q25.3末端區(qū)域的基因被認(rèn)為是一個復(fù)雜的i組裝因子，參與多種線粒體過程，包括呼吸鏈工作。17q25.3的末端區(qū)域被認(rèn)為是一個新的心臟易感位點(diǎn)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)oxld1與關(guān)鍵的線粒體調(diào)節(jié)蛋白c7orf55之間可能存在關(guān)聯(lián)。這些證據(jù)為研究oxld1提供了依據(jù)。17q25.3末端區(qū)被認(rèn)為是一種新的心功能障礙易感位點(diǎn)。

2、心臟是血液循環(huán)和氧氣輸送到全身所必需的，同時，心臟有內(nèi)在的氧氣需求來保持有效的收縮力。為了探討oxld1與心功能障礙的相關(guān)性，我們檢測了oxld1與線粒體能量代謝之間的關(guān)系，總atp是通過線粒體氧化磷酸化和糖酵解產(chǎn)生的，這是哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生atp的兩種主要代謝途徑。oxld1表達(dá)對atp生成速率的影響是由于氧化磷酸化還是糖酵解?為了解決這個問題，我們測量了oxphos和糖酵解。我們的實(shí)驗數(shù)據(jù)表明，oxld1通過oxphos而不是糖酵解來改善心肌細(xì)胞呼吸功能，oxphos系統(tǒng)負(fù)責(zé)細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換，它的缺乏可能導(dǎo)致線粒體疾病，線粒體是有氧呼吸的中心，事實(shí)上，超過90%的atp是由線粒體中的oxphos產(chǎn)生的。在評估oxld1對線粒體復(fù)合物酶活性的影響時，我們發(fā)現(xiàn)復(fù)合物i和ⅴ表現(xiàn)出明顯的變化，復(fù)合體i是線粒體呼吸功能調(diào)節(jié)機(jī)器，是ros產(chǎn)生的主要位點(diǎn)，參與細(xì)胞凋亡。先前的研究表明，17q25.3基因作為一個復(fù)雜的i組裝因子參與線粒體過程，包括多重呼吸鏈功能。

3、到目前為止，尚無oxld1蛋白在心肌保護(hù)或相關(guān)疾病治療中應(yīng)用的報道，以及以oxld1為主要成分的心肌保護(hù)藥物，本發(fā)明旨在驗證oxld1的心肌保護(hù)以及對心肌梗死的預(yù)防和治療作用，從而提供一種新的心肌保護(hù)藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供oxld1蛋白作為保護(hù)心肌細(xì)胞、預(yù)防心肌梗死、增加心功能方面藥物的制備及應(yīng)用，本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)oxld1促進(jìn)了etc配合物i和ⅴ的活性，從而提高了電子接受受體的活性，同時，oxphos過程產(chǎn)生的atp增加。另外我們發(fā)現(xiàn)缺氧下oxld1的水平被抑制；抑制oxld1可使線粒體膜電位(mmp)降低，活性氧(ros)生成增加，從而加重常氧和缺氧條件下的線粒體損傷。我們的研究結(jié)果表明，oxld1通過維持線粒體功能作為心肌缺氧損傷的保護(hù)因子，其在保護(hù)心肌、預(yù)防和治療心肌梗死中具有很好的應(yīng)用前景。

2、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用技術(shù)方案的基本構(gòu)思是：

3、重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑制備，包括以下步驟：根據(jù)oxld1基因序列設(shè)計選擇1個特異性區(qū)段制備重組質(zhì)粒，構(gòu)建pet-b2m亞克隆表達(dá)載體。通過大腸桿菌原核表達(dá)重組蛋白；重組蛋白預(yù)計表達(dá)大小16?kda；取保存于-20?℃的菌種?100?μl?接種于?100?ml?lb?液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；取?100?ml?菌液接種于?2000?ml?lb?液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至od600?約?0.6，降低培養(yǎng)溫度到?30℃；加入?iptg?誘導(dǎo)劑至終濃度?0.5?mm，30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)?3-4?h；8000?rpm?離心?3?min收集菌體，重懸于?50?ml?預(yù)冷?nta-0?緩沖液中，冰浴?30?min；超聲破碎菌體，參數(shù)設(shè)置為功率?200?w、工作?3?s、暫停?4?s、時間?25-30?min；16000?rpm?4℃離心?50?min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀進(jìn)行?sds-page?檢測，剩余上清及沉淀至于?4?℃?zhèn)溆?，即得到重組蛋白-oxld1藥物。

4、本發(fā)明中，oxld1亞細(xì)胞在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中。

5、本發(fā)明中，在缺氧條件下，心肌細(xì)胞會受到損害，保護(hù)性蛋白o(hù)xld1表達(dá)受到抑制。

6、本發(fā)明中，oxld1可以緩解缺氧引起的mmp下降導(dǎo)致的線粒體損害，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞能量代謝。

7、本發(fā)明中，oxld1蛋白的表達(dá)抑制了缺氧誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞的線粒體損傷。

8、本發(fā)明中，oxld1蛋白與線粒體共定位。

9、本發(fā)明中，oxld1可以通過影響h9c2心肌細(xì)胞的呼吸來幫助保護(hù)損傷的細(xì)胞。

10、本發(fā)明中，oxld1對線粒體呼吸功能的增加是通過線粒體復(fù)合體i和ⅴ實(shí)現(xiàn)的。

11、采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果。

12、oxld1蛋白表達(dá)增加的心肌細(xì)胞，可以減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的損傷作用，減少心肌細(xì)胞線粒體損害，提高心肌細(xì)胞的存活率，并且oxld1本身在能起到有益效果的情況下，對細(xì)胞無毒性，不會影響細(xì)胞狀態(tài)；oxld1通過抑制缺氧誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞的線粒體損傷，以及通過影響h9c2心肌細(xì)胞能量代謝來保護(hù)心肌細(xì)胞；此外，我們的數(shù)據(jù)顯示，oxld1促進(jìn)了etc配合物i和ⅴ的活性，從而提高了電子接受受體的活性。同時，oxphos過程產(chǎn)生的atp增加。另外我們發(fā)現(xiàn)缺氧下oxld1的水平被抑制；抑制oxld1可使線粒體膜電位(mmp)降低，活性氧(ros)生成增加，從而加重常氧和缺氧條件下的線粒體損傷。我們的研究結(jié)果表明，oxld1通過維持線粒體功能作為缺氧損傷的保護(hù)因子，其在保護(hù)心肌、預(yù)防和治療心肌梗死中具有很好的應(yīng)用前景。

13、下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。

技術(shù)特征：

1.重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑制備，其特征在于，包括以下步驟：根據(jù)oxld1基因序列設(shè)計選擇1個特異性區(qū)段制備重組質(zhì)粒，構(gòu)建pet-b2m亞克隆表達(dá)載體。通過大腸桿菌原核表達(dá)重組蛋白；重組蛋白預(yù)計表達(dá)大小16kda；取保存于-20?℃的菌種?100?μl?接種于?100?ml?lb?液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜；取100?ml?菌液接種于?2000?ml?lb?液體培養(yǎng)基中，37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至od600?約?0.6，降低培養(yǎng)溫度到?30?℃；加入?iptg?誘導(dǎo)劑至終濃度?0.5?mm，30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)?3-4?h；8000?rpm離心?3?min?收集菌體，重懸于?50?ml?預(yù)冷?nta-0?緩沖液中，冰浴?30?min；超聲破碎菌體，參數(shù)設(shè)置為功率?200?w、工作?3?s、暫停?4?s、時間?25-30?min；16000?rpm?4℃離心?50min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀進(jìn)行?sds-page?檢測，剩余上清及沉淀至于?4℃?zhèn)溆?，即得到重組蛋白-oxld1藥物。

2.重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑應(yīng)用，其特征在于：oxld1亞細(xì)胞在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中。

3.重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑應(yīng)用，其特征在于：在缺氧條件下，心肌細(xì)胞會受到損害，保護(hù)性蛋白o(hù)xld1表達(dá)受到抑制。

4.重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑應(yīng)用，其特征在于：oxld1可以緩解缺氧引起的mmp下降導(dǎo)致的線粒體損害，進(jìn)而保護(hù)心肌細(xì)胞能量代謝。

5.重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑應(yīng)用，其特征在于：oxld1蛋白的表達(dá)抑制了缺氧誘導(dǎo)的h9c2心肌細(xì)胞的線粒體損傷。

6.重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑應(yīng)用，其特征在于：oxld1蛋白與線粒體共定位。

7.重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑應(yīng)用，其特征在于：oxld1可以通過影響h9c2心肌細(xì)胞的呼吸來幫助保護(hù)損傷的細(xì)胞。

8.重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白-oxld1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑應(yīng)用，其特征在于：oxld1對線粒體呼吸功能的增加是通過線粒體復(fù)合體i和ⅴ實(shí)現(xiàn)的。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了重組含有氧化還原酶樣結(jié)構(gòu)域1蛋白?OXLD1蛋白藥物對心肌細(xì)胞保護(hù)制劑制備及其應(yīng)用，OXLD1蛋白表達(dá)增加的心肌細(xì)胞，可以減少缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞的損傷作用，減少心肌細(xì)胞線粒體損害，提高心肌細(xì)胞的存活率，并且OXLD1本身在能起到有益效果的情況下，對細(xì)胞無毒性，不會影響細(xì)胞狀態(tài)；OXLD1通過抑制缺氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的線粒體損傷；OXLD1促進(jìn)了ETC配合物I和Ⅴ的活性，提高了電子接受受體的活性，同時OXPHOS過程產(chǎn)生的ATP增加。缺氧下OXLD1的水平被抑制，抑制OXLD1可使線粒體膜電位(MMP)降低，活性氧(ROS)生成增加，加重常氧和缺氧條件下的線粒體損傷，OXLD1通過維持線粒體功能作為缺氧損傷的保護(hù)因子，其在保護(hù)心肌、預(yù)防和治療心肌梗死中具有很好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：閆妍,姚詠明,趙曉靜,崔賽嘉,陳卉寧
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國人民解放軍總醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26