本發(fā)明涉及分子生物學和寄生蟲學領域，特別是涉及用于片形吸蟲的arms-pcr引物組、試劑盒及方法。

背景技術：

1、片形吸蟲病(fascioliasis)是由片形科(fasciolidae)片形屬(fasciolalinnaeus，1758)吸蟲寄生于牛、羊等反芻動物和人體肝膽管，導致宿主肝、膽病理損傷的食源性人獸共患寄生蟲病。片形吸蟲病對畜牧業(yè)造成重大的經濟損失，同時也是重要的公共衛(wèi)生問題，目前全球至少有240萬人感染片形吸蟲，9100萬人面臨被感染的風險。片形屬有肝片吸蟲(f.hepatica)、大片吸蟲(f.gigantica)、f.jacksoni和f.nyanzae四個種。肝片吸蟲和大片吸蟲在我國廣泛流行且對動物和人危害最為嚴重，其中，肝片吸蟲主要流行于我國的北方地區(qū)，是溫帶地區(qū)的優(yōu)勢種，而大片吸蟲主要流行于我國的南方地區(qū)，是熱帶、亞熱帶地區(qū)的優(yōu)勢種。由于肝片吸蟲和大片吸蟲在形態(tài)上很相似，且近些年亞洲和非洲許多地區(qū)甚至出現了兩個種雜合的片形吸蟲，這對片形吸蟲傳統(tǒng)形態(tài)學為主的分類鑒定提出了挑戰(zhàn)，同時也增加了片形吸蟲種類鑒定的難度。由于不同種片形吸蟲在蟲體抗原性、免疫原性、治病性和藥物敏感性等方存在差異，因此，正確鑒定片形吸蟲種類和準確掌握其表型及分子特征有助于準確識別疾病病因，做到有效預防和控制，并為疫苗研制提供參考。

2、長期以來片形吸蟲的檢測、分類鑒定主要依據成蟲形態(tài)、生活史和流行病學等特征來進行，但由于片形吸蟲種內個體差異較大，相同蟲種因宿主種類、宿主反應的不同而異，導致同一蟲種不同個體形態(tài)不規(guī)則。近年來，分子生物學技術的發(fā)展為片形吸蟲的鑒定提供了新的途徑。例如，rflp(限制性片段長度多態(tài)性)分析方法可以應用于點突變的檢測和鑒定。然而，此方法通常步驟復雜，操作繁瑣，需要特定的條件，局限性強，限制了其在實際中的廣泛應用。

技術實現思路

1、針對上述問題，本發(fā)明提供一種用于片形吸蟲的arms-pcr引物組，該arms-pcr引物組能夠解決現有片形吸蟲檢測、分型鑒定方法的不足，利用該引物組不僅能夠操作簡單、快速、準確性高地對待測人員是否感染片形吸蟲做出判斷，還能對感染片形吸蟲的類型進行鑒定，從而為后續(xù)治療或用藥提供良好的基礎。

2、為了達到上述目的，本發(fā)明提供一種用于片形吸蟲的arms-pcr引物組，包括外引物、內引物；

3、所述外引物包括：

4、outer-f:5’-ttgcgctgattacgtccctg-3’(seq?no.9)；

5、outer-r:5’-ttggctgcgctcttcatcgac-3’(seq?no.10)；

6、所述內引物包括：

7、inner-f:5’-cgccctatgaactgtttcattactagat-3’(seq?no.11)；

8、inner-r:5’-gccattcagtaccactttaacagtgttat-3’(seq?no.12)。

9、傳統(tǒng)的片形吸蟲感染檢測主要依賴于血檢和病原學檢查，而片形吸蟲的形態(tài)學鑒定方法則主要依賴于肉眼觀察。然而傳統(tǒng)的感染檢測方法，在寄生蟲數量較少時易發(fā)生漏診，且由于肝片形吸蟲卵與姜片蟲卵、巨片形蟲卵及棘口吸蟲卵等相似易發(fā)生誤診。若直接外科剖腹探查或膽管手術發(fā)現蟲體雖可確診，但這種方式對待測人員/動物會造成較大的創(chuàng)傷，存在明顯的局限性。而傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法，則由于片形吸蟲不同種類的片形吸蟲在形態(tài)上非常相似，尤其是在幼蟲階段，肉眼觀察難以準確區(qū)分這些微小的形態(tài)差異。形態(tài)學鑒定需要操作者具備豐富的經驗和高超的技能，才能在形態(tài)特征上作出正確判斷，這對鑒定結果的準確性產生了高度的依賴性和主觀性。在面對形態(tài)特征模糊或不典型的樣本時，也可能會出現誤判，導致鑒定結果不可靠，誤判的風險較高，難以準確區(qū)分形態(tài)相似的片形吸蟲種類及其雜合子。

10、rflp方法的局限性體現在其對突變位點附近存在特定限制性內切酶位點的依賴。這意味著只有在突變位點周圍存在適合的限制性內切酶位點時，rflp技術才能有效應用。如果目標序列中缺乏適合的限制性內切酶位點，rflp方法將無法實現有效的基因突變檢測。故rflp方法的應用范圍受到很大限制，無法滿足所有基因檢測需求。

11、而arms-pcr是一種專門用于檢測單核苷酸多態(tài)性(snp)的高特異性pcr技術。由于taqdna聚合酶缺少3’-5’外切酶活性，pcr引物3’末端的錯配會導致擴增產物的減少，因此可以針對已知snp位點設計合適的引物來對感染情況、基因分型進行檢測。

12、本發(fā)明還提供了一種用于片形吸蟲的arms-pcr反應體系，包括所述arms-pcr引物組。

13、在其中一個實施例中，所述內引物的工作濃度為體積百分比10-14％，所述外引物的工作濃度為體積百分比4-8％。

14、所述工作濃度為上述內引物、外引物在使用時能夠達到預期效果的濃度，可以理解的，本領域技術人員在配制上述arms-pcr反應體系時，可以配制濃度更高的母液或者儲備液，待使用時再稀釋，所述母液或者儲備液及其濃度均在本發(fā)明的保護范圍之內。

15、在其中一個實施例中，所述arms-pcr反應體系的反應條件包括：95℃預變性3min；進行20個循環(huán)的95℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min；72℃終延伸10min。

16、本發(fā)明還提供了一種用于片形吸蟲的試劑盒，包括所述arms-pcr引物組或所述arms-pcr反應體系。

17、本發(fā)明還提供了一種片形吸蟲的鑒別方法，包括以下步驟：提取待測樣本的dna，采用所述試劑盒進行檢測，得到擴增產物，對擴增產物進行電泳，根據電泳結果對待測樣本的片形吸蟲進行類型鑒別。

18、在其中一個實施例中，所述類型鑒別包括：當所述電泳結果包括680bp條帶和509bp條帶，則所述片形吸蟲為大片吸蟲；

19、當所述電泳結果包括680bp條帶和227bp條帶，則所述片形吸蟲為肝片吸蟲；

20、當所述電泳結果包括680bp、509bp和227bp條帶，則所述片形吸蟲為肝片吸蟲和大片吸蟲的雜合子。

21、本發(fā)明還提供了一種非診斷目的的片形吸蟲的檢測方法，包括以下步驟：提取待測樣本的dna，采用所述試劑盒進行檢測，得到擴增產物，對擴增產物進行電泳，根據電泳結果對待測樣本是否具有片形吸蟲進行判斷。

22、在其中一個實施例中，所述判斷包括：所述電泳結果包括680bp條帶、509bp或227bp條帶中的至少1項，則所述待測樣本感染片形吸蟲。

23、本發(fā)明還提供了所述arms-pcr引物組在制備用于鑒別片形吸蟲類型和/或檢測片形吸蟲產品中的應用。

24、與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

25、本發(fā)明的用于片形吸蟲的arms-pcr引物組、試劑盒及方法，該arms-pcr引物組能夠解決現有片形吸蟲檢測、分型鑒定方法的不足，利用該引物組不僅能夠操作簡單、快速、準確性高地對待測人員/動物是否感染片形吸蟲做出判斷，還能對感染片形吸蟲的類型進行鑒定，從而為后續(xù)治療或用藥提供良好的基礎。