本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種用于單細胞測序的微孔陣列芯片、制備方法及應用方法。

背景技術：

1、單細胞測序(single-cell?sequencing)技術是近年來生物醫(yī)學研究中一項革命性的方法，它能夠在單細胞水平上對基因組、轉錄組或表觀基因組進行高通量測序。傳統(tǒng)的群體測序技術通常測量數(shù)千到數(shù)百萬個細胞的平均信號，這掩蓋了個體細胞之間的異質性。而單細胞測序技術則能夠揭示個體細胞的基因表達和基因組特征，提供了更細致的分辨率和更深入的生物學理解。

2、單細胞測序技術主要包括單細胞基因組測序(single-cell?genome?sequencing,scdna-seq)、單細胞轉錄組測序(single-cell?rnasequencing,scrna-seq)和單細胞表觀基因組測(single-cell?epigenome?sequencing,scatac-seq)等。每種方法都針對特定的分子特征進行分析。例如，scrna-seq通過測量單個細胞的mrna含量，揭示其基因表達譜，已廣泛應用于研究細胞異質性、發(fā)育過程和疾病機制。

3、單細胞測序技術在多個研究領域展現(xiàn)了其強大的應用潛力。在腫瘤研究中，scrna-seq技術被用來分析腫瘤微環(huán)境，識別不同的細胞亞群及其相互作用，揭示腫瘤的異質性和演化過程。在免疫學研究中，通過單細胞分析，科學家可以詳細了解不同免疫細胞類型的基因表達譜及其在免疫反應中的作用，探索免疫系統(tǒng)在健康和疾病狀態(tài)下的動態(tài)變化。此外，單細胞測序在神經科學研究中也被廣泛應用，用于研究神經元和膠質細胞的基因表達，揭示神經系統(tǒng)的復雜性和發(fā)育機制。

4、單細胞rna測序為科學家們提供了深入了解單個細胞基因表達的能力，已廣泛應用在腫瘤學、神經科學、免疫學、藥物發(fā)現(xiàn)、傳染病等領域。

5、傳統(tǒng)的單細胞分離的方法僅能針對少量的目標細胞進行檢測，耗時耗力且成本高昂(使用微吸管分類或者激光捕獲顯微切割進行單細胞獲取，再與通量較低的單細胞測序技術配合)。目前有基于液滴共包裹的方法(10x?genomics公司采用的方法)和通過重力將單細胞捕獲到微孔的方法(bd公司采用的方法)來進行單細胞分離而進行高通量的單細胞測序。通過液滴共包裹方法的缺點主要是會導致細胞損失，在目標細胞為5000個時，需要過量投入到8280個細胞。在某些臨床需求中，如罕見疾病或小型腫瘤，通常只能獲取少量細胞，所以目前的測序方法對稀有細胞樣本是不可接受的，這類樣本需要高效的中低通量測序方法，而現(xiàn)有的高通量技術并不適用于這種情況。

6、因此，現(xiàn)有技術中的單細胞測序方法存在無法對單細胞進行高效捕獲以實現(xiàn)高通量測序的問題。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明實施例提供了一種用于單細胞測序的微孔陣列芯片、制備方法及應用方法，旨在解決現(xiàn)有技術方法中的單細胞測序方法所存在的無法對單細胞進行高效捕獲以實現(xiàn)高通量測序的問題。

2、第一方面，本發(fā)明實施例提供了一種用于單細胞測序的微孔陣列芯片的應用方法，其中，所述應用方法包括：

3、通過第一液滴生成芯片制備得到大液滴；

4、通過第二液滴生成芯片制備得到小液滴；

5、在微孔陣列芯片的入口及出口處分別連接漏斗形連接頭，在所述微孔陣列芯片的入口添加氟化油并置于真空環(huán)境內以排空芯片內空氣；

6、在所述微孔陣列芯片的入口添加所述大液滴后傾斜所述微孔陣列芯片以使大液滴通過浮力漂流進入所述微孔陣列芯片中的大微孔中；

7、在所述微孔陣列芯片的入口再次添加氟化油以去除多余大液滴；

8、將所述微孔陣列芯片傾斜并置于冰面上，將液滴分選儀的陽性液滴輸出口接入所述微孔陣列芯片的入口，以通過所述液滴分選儀將細胞液滴分選并添加至所述微孔陣列芯片的大微孔一側的小微孔中，以使細胞液滴與大液滴一一配對；

9、在所述微孔陣列芯片的入口再次添加氟化油以去除多余的細胞液滴；

10、使用電暈機在所述微孔陣列芯片上方施加2-4秒鐘的電暈處理，以誘導互相接觸的大液滴和細胞液滴進行融合；

11、將所述微孔陣列芯片置于常溫下20-30分鐘以使蛋白酶k充分的裂解細胞、釋放細胞的mrna，之后置于68-75℃的水浴鍋中8-12分鐘進行蛋白酶k的滅活，之后將微孔陣列芯片置于冰面上；

12、通過所述微孔陣列芯片的入口輸入小液滴，使其通過浮力漂流進入所述微孔陣列芯片中的大微孔一側的小微孔中完成小液滴與大微孔中的液滴間的一一配對，而后通過添加氟化油去除多余的小液滴，使用電暈機在所述微孔陣列芯片上方施加2-4秒鐘的電暈處理以使小液滴與大微孔中的液滴進行配對融合；

13、將所述微孔陣列芯片的入口及出口進行密封后，將芯片置于40-45℃水浴鍋中進行3小時的反轉錄反應；

14、通過注射器連接微孔陣列芯片的入口，通過恒流注射泵推動注射器以特定流速推動水溶性緩沖溶液進入所述微孔陣列芯片以排出氟化油，吸取空氣及水溶性緩沖溶液再次輸入至所述微孔陣列芯片的入口，使用電暈機在所述微孔陣列芯片上方施加2-4秒鐘的電暈處理以誘導液滴破乳，靜止12-18分鐘后，通過所述微孔陣列芯片的出口收集包含cdna的水溶性緩沖溶液進行測序分析。

15、第二方面，本發(fā)明實施例還提供了一種微孔陣列芯片，其中，該微孔陣列芯片應用于如上述第一方面所述的應用方法中，所述微孔陣列芯片由頂層的玻璃-聚二甲基硅氧烷微孔芯片、流體通道層以及底層玻片進行層疊組合得到。

16、第三方面，本發(fā)明實施例還提供了一種微孔陣列芯片的制備方法，其中，該制備方法用于制備如第二方面所述的微孔陣列芯片，所述制備方法包括：

17、在載玻片上開設兩個通孔并在通孔內填充聚二甲基硅氧烷，得到玻璃基底；

18、對硅片模具進行氧氣-等離子體處理，在充滿硅烷蒸氣的真空室中處理10小時以上，將去除氣泡的聚二甲基硅氧烷預聚物倒入所述硅片模具上進行剝離，得到具有聚二甲基硅氧烷微孔陣列的凹型模具并置于充滿硅烷蒸氣的真空室中處理10小時以上，再次翻模得到聚二甲基硅氧烷微孔陣列的凸型模具；

19、在具有微孔陣列的凸型模具上倒入聚二甲基硅氧烷預聚物并進行抽真空處理以去除氣泡；

20、將玻璃基底進行氧氣-等離子體處理后，置于具有微孔陣列的凸型模具上進行貼合，進行加熱固化后剝離得到聚二甲基硅氧烷微孔陣列-玻片基底復合物；

21、在硅片上重復旋涂聚二甲基硅氧烷得到平整聚二甲基硅氧烷薄膜，對所述聚二甲基硅氧烷薄膜進行切割得到流體通道層；

22、將所述流體通道層與所述底層玻片進行鍵合處理后進行等離子處理，將聚二甲基硅氧烷微孔陣列-玻片基底復合物鍵合于所述流體通道層的上層，置于110℃加熱10分鐘得到微孔陣列芯片；

23、將疏水試劑注入所述微孔陣列芯片，并將所述微孔陣列芯片置于真空環(huán)境中；30秒后通過注射器進行抽取以將所述疏水試劑排出，再將所述微孔陣列芯片置于110℃烘干去除剩余疏水試劑。

24、本發(fā)明實施例提供了一種微孔陣列芯片、制備方法及應用方法，應用方法包括分別制備得到大液滴及小液滴，在微孔陣列芯片的入口添加氟化油，將大液滴添加至微孔陣列芯片的入口并傾斜以捕獲大液滴，排掉多余液滴后置于冰面上，通過液滴分選儀將細胞液滴分選并添加至所述微孔陣列芯片的大微孔中以使細胞液滴與大液滴一一配對，進行電暈處理后加熱并再次置于冰面上，將小液滴添加至微孔陣列芯片的入口后再次電暈，對微孔陣列芯片進行密封并水浴加熱，注入水溶性緩沖溶液后再次電暈以使液滴破乳，收集包含cdna的溶液進行測序分析。上述應用方法，通過大液滴與細胞液滴及小液滴進行配對融合，從而實現(xiàn)對細胞液滴進行單細胞測序；通過分步加樣從而優(yōu)化單細胞測序的試劑體系，通過提高單細胞的mrna捕獲效率，從而提高單細胞測序的效率。