本發(fā)明屬于生物，特別關(guān)注于海洋軟體動物細胞培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、長牡蠣(crassostrea?gigas)，屬于動物界中軟體動物門、雙殼綱、牡蠣科、牡蠣屬。作為一種具有顯著經(jīng)濟價值的物種，長牡蠣在中國的海水養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)了重要地位。隨著長牡蠣全基因組測序工作的完成，長牡蠣等海洋貝類在功能基因的驗證方面取得顯著進展。但由于目前缺乏長牡蠣細胞系，限制了對長牡蠣基因功能和調(diào)控機制的深入研究和發(fā)掘利用，以及貝類養(yǎng)殖技術(shù)的創(chuàng)新，這已成為研究和應(yīng)用開發(fā)的主要瓶頸。

2、在海洋軟體動物的細胞培養(yǎng)過程中，細菌污染是最普遍且難以解決的問題之一。因此，采用抑菌物質(zhì)以降低細菌污染的風(fēng)險是至關(guān)重要的。盡管長牡蠣原代細胞培養(yǎng)技術(shù)取得了一定進步，但在組織(外套膜、鰓、消化腺和性腺)的抑菌處理和細胞分離制備技術(shù)方面仍有待完善。特別是鰓，作為長牡蠣抵御病原微生物的主要防線，由于鰓組織中微生物種類繁多且數(shù)量眾多，其細胞培養(yǎng)過程中的抑菌難度更加顯著。目前，利用長牡蠣鰓細胞進行的細胞培養(yǎng)和功能驗證的研究還較為有限。鑒于長牡蠣資源的豐富性，其在細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用中具有極大的潛力和經(jīng)濟價值。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)本發(fā)明提供了一種長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

3、一種長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑體積比為65.895-70.895：29.105-34.105；所述添加劑為細胞生長類組分和促進細胞增殖類組分。

4、所述細胞生長類組分體積占長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基體積的28％～33％，其成分為長牡蠣血清，fbs，抗生素，混合鹽(cacl2、nacl、kcl、mgcl2)，硫酸鹽(mgso4)。

5、所述促進細胞增殖類組分體積占長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基體積的1.105％，其為poly-d-lysine，hepes緩沖劑，egf，β-巰基乙醇。

6、所述長牡蠣血清與fbs的體積比為0.5～1。

7、所述長牡蠣血清為將長牡蠣血淋巴離心取上清，0.22μm濾膜過濾除菌，即得；離心條件為：離心溫度4℃，離心轉(zhuǎn)速800×g，離心15min。

8、所述抗生素包括以下組分：10ku/ml青霉素，10mg/ml鏈霉素，5mg/ml慶大霉素。

9、所述混合鹽包括以下成分：0.6g?cacl2、20.2g?nacl、0.54g?kcl、3.9gmgcl2，純水定容至100ml。

10、所述硫酸鹽為mgso4，配制濃度為50g/l。

11、所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為l-15培養(yǎng)基。

12、一種所述的長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基的應(yīng)用，所述培養(yǎng)基在原代培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞中的應(yīng)用。

13、一種原代培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞的方法：

14、(1)將長牡蠣鰓組織用消毒液殺菌后剪碎；

15、(2)將步驟(1)中的剪碎組織通過組織裂解液制成長牡蠣鰓細胞懸液；

16、(3)使用權(quán)利要求1所述原代培養(yǎng)基將步驟(2)獲得長牡蠣鰓細胞懸液稀釋，而后加入至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

17、所述步驟(2)中的所述組織裂解液為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶與edta的混合液；裂解液各成分在長牡蠣鰓細胞懸液中終濃度依次為：2.5mg/ml胰蛋白酶，5mg/ml木瓜蛋白酶，0.5mg/ml膠原蛋白酶，0.2mg/ml?edta；其中，剪碎的組織塊與組織裂解液之間體積的比例為1:1。

18、所述組織裂解液酶解時間為15min，酶解溫度為37℃。

19、所述步驟(3)中培養(yǎng)的條件為：18℃，靜置培養(yǎng)。

20、所述培養(yǎng)瓶為使用poly-d-lysine溶液對細胞培養(yǎng)瓶進行處理，0.1mg/ml的poly-d-lysine過夜鋪被后吸走多余poly-d-lysine溶液，超凈內(nèi)干燥1小時，待用。

21、所述步驟(1)中所述消毒液為75％酒精消毒液、洗必泰消毒液和抗生素消毒液三種。各消毒液的作用時間為：75％酒精消毒液浸泡10-15s，洗必泰消毒液10min，抗生素消毒液15min。消毒液使用之后需要用pbs進行沖洗。

22、所述抗生素消毒液包括以下成分：100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、50μg/ml慶大霉素、10μg/ml卡那霉素、2μg/ml兩性霉素b和100μg/ml氯霉素，溶劑為純水。

23、本發(fā)明原代培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加提供細胞生長類營養(yǎng)物質(zhì)和促進細胞增殖物質(zhì)，兩類物質(zhì)共同保證體外培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞的存活和生長。

24、其中，細胞生長類組分中的長牡蠣血清為樣品提供了長牡蠣鰓細胞的生長環(huán)境，同時提供氨基酸、微量元素、離子、激素等必需的營養(yǎng)物質(zhì)；并且其也具有抗菌作用，并且配合抗生素防止細菌污染培養(yǎng)基；同時其他成分模擬海水鹽度，還原長牡蠣半開放系統(tǒng)下的海水鹽度；

25、促進細胞增殖物質(zhì)中的poly-d-lysine是輔助貼壁因子，包被在細胞培養(yǎng)瓶中，其促進細胞生長，促進細胞進行貼壁繁殖；成分中緩沖劑維持培養(yǎng)基的ph，以及egf激活受體胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸激酶，從而啟動dna合成和細胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；β-巰基乙醇中和細胞培養(yǎng)基中積累的氧自由基從而改善細胞周圍環(huán)境。

26、本發(fā)明對長牡蠣鰓細胞培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，該方法操作簡單，且培養(yǎng)的長牡蠣鰓細胞細胞密度大，形態(tài)好。

27、本發(fā)明的優(yōu)點包括：

28、本發(fā)明培養(yǎng)基可用于長牡蠣鰓原代細胞的體外培養(yǎng)，并能夠更好的維持體外培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞的存活和生長；該培養(yǎng)基中加入了特定比例的長牡蠣血清，使用該比例的培養(yǎng)基對長牡蠣鰓原代細胞進行培養(yǎng)時能夠有效抑菌；本申請還提供了一種該培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，該方法操作簡單，且培養(yǎng)的長牡蠣鰓細胞細胞密度大，形態(tài)好，抗菌能力強；具體為：

29、1.本申請長牡蠣鰓細胞培養(yǎng)基，通過加入特定比例的長牡蠣血清，使得培養(yǎng)基有更強的抑菌作用，能夠更好的維持體外原代培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞的生長和代謝；

30、2.本申請長牡蠣鰓細胞培養(yǎng)基在培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞中的應(yīng)用，該方法操作簡單，且培養(yǎng)的長牡蠣鰓原代細胞抗菌能力強。

技術(shù)特征：

1.一種長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑體積比為65.895-70.895：29.105-34.105；所述添加劑為細胞生長類組分和促進細胞增殖類組分。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，所述細胞生長類組分體積占長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基體積的28％～33％，其成分為長牡蠣血清，fbs，抗生素，混合鹽(cacl2、nacl、kcl、mgcl2)，硫酸鹽(mgso4)；

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，所述長牡蠣血清與fbs的體積比為0.5～1。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，所述長牡蠣血清為將長牡蠣血淋巴離心取上清，0.22μm濾膜過濾除菌，即得；離心條件為：離心溫度4℃，離心轉(zhuǎn)速800×g，離心15min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為l-15培養(yǎng)基。

6.一種權(quán)利要求1所述的長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于：所述培養(yǎng)基在原代培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞中的應(yīng)用。

7.一種原代培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞的方法，其特征在于：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的所述組織裂解液為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、膠原蛋白酶與edta的混合液；裂解液各成分在長牡蠣鰓細胞懸液中終濃度依次為：2.5mg/ml胰蛋白酶，5mg/ml木瓜蛋白酶，0.5mg/ml膠原蛋白酶，0.2mg/ml?edta；其中，剪碎的組織塊與組織裂解液之間體積的比例為1:1。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述步驟(3)中培養(yǎng)的條件為：18℃，靜置培養(yǎng)。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：所述培養(yǎng)瓶為使用poly-d-lysine溶液對細胞培養(yǎng)瓶進行處理，0.1mg/ml的poly-d-lysine過夜鋪被后吸走多余poly-d-lysine溶液，超凈內(nèi)干燥1小時，待用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別關(guān)注于海洋軟體動物細胞培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種長牡蠣鰓細胞原代培養(yǎng)基及其應(yīng)用。培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基與添加劑體積比為65.895?70.895：29.105?34.105；所述添加劑為細胞生長類組分和促進細胞增殖類組分。本發(fā)明培養(yǎng)基可用于長牡蠣鰓原代細胞的體外培養(yǎng)，并能夠更好的維持體外培養(yǎng)長牡蠣鰓細胞的存活和生長；該培養(yǎng)基中加入了特定比例的長牡蠣血清，使用該比例的培養(yǎng)基對長牡蠣鰓原代細胞進行培養(yǎng)時能夠有效抑菌；本申請還提供了一種該培養(yǎng)基的應(yīng)用方法，該方法操作簡單，且培養(yǎng)的長牡蠣鰓細胞細胞密度大，形態(tài)好，抗菌能力強。

技術(shù)研發(fā)人員：王玲玲,張林芳,張學(xué)書,宋林生,李明,李德良
受保護的技術(shù)使用者：大連海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19