本發(fā)明屬于發(fā)酵工程，具體涉及一種酪丁酸梭菌的非滅菌發(fā)酵工藝培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。

背景技術(shù)：

1、微生物發(fā)酵被認(rèn)為是一種綠色可持續(xù)的化合物生產(chǎn)方式，越來(lái)越多的專一高效生產(chǎn)某種化合物的微生物被發(fā)現(xiàn)或被改造得到，但是這些微生物發(fā)揮作用往往需要專一的群落，其他雜菌的污染會(huì)大大降低化合物的生產(chǎn)效率，甚至破壞微生物發(fā)酵生產(chǎn)線的總體功能。為此，目前微生物發(fā)酵主要還是需要通過(guò)添加抗生素和高溫高壓的方式來(lái)維持發(fā)酵過(guò)程中的菌株純度。但是抗生素的添加作用存在半衰期效果降低和濫用產(chǎn)生突變株的隱患，而高溫高壓的滅菌條件會(huì)帶來(lái)生產(chǎn)的成本的增加，也會(huì)帶來(lái)處理的安全隱患。

2、為避免上述隱患，非滅菌發(fā)酵是一種有效的發(fā)酵工藝思路，其通過(guò)給予一種或同時(shí)給予多種極端（溫度、ph、滲透壓、抑制劑）條件，或者配置非常規(guī)菌株能夠利用的碳源、氮源、磷源，或者是通過(guò)代謝工程改造賦予微生物抑制其它污染微生物的生長(zhǎng)而不影響主體發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)和生產(chǎn)化合物的發(fā)酵。

3、酪丁酸梭菌，是一種專性厭氧的梭狀芽孢桿菌，能夠天然生產(chǎn)短鏈脂肪酸（乙酸、丁酸）?，F(xiàn)有技術(shù)通過(guò)代謝工程改造，已經(jīng)得到了酪丁酸梭菌高效合成丁酸、丁酸丁酯、丁醇等高價(jià)值化合物的發(fā)酵菌株。

4、而傳統(tǒng)酪丁酸梭菌的發(fā)酵工藝需要滅菌來(lái)控制菌株的單一、高效，這帶來(lái)了巨大的滅菌成本，包括滅菌設(shè)備的采購(gòu)、維護(hù)等費(fèi)用，用電、水的成本。因此開(kāi)發(fā)酪丁酸梭菌非滅菌的發(fā)酵工藝可以縮減成本，提高以酪丁酸梭菌生產(chǎn)發(fā)酵化學(xué)品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了克服現(xiàn)有的技術(shù)缺點(diǎn)和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種酪丁酸梭菌的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法。

2、本發(fā)明通過(guò)引入非常規(guī)氮源和磷源，實(shí)現(xiàn)了酪丁酸梭菌高效低成本非滅菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。

3、本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

4、一種酪丁酸梭菌的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，所述酪丁酸梭菌為酪丁酸梭菌l319保藏號(hào)gdmcc?62289，

5、所述培養(yǎng)基以尿素或甲酰胺中的一種或兩種為唯一氮源或者以亞磷酸鹽為唯一磷源。

6、所述培養(yǎng)基可同時(shí)以尿素或甲酰胺為唯一氮源且以亞磷酸鹽為唯一磷源，亦可以尿素或甲酰胺為唯一氮源的同時(shí)搭配任意可利用磷源，或者以亞磷酸鹽為唯一磷源的同時(shí)搭配任意可利用氮源。

7、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基的配方為：

8、5~10g/l葡萄糖，1~2?g/l?碳酸氫鈉，氮源，0.8~3?g/l?氯化鈉，0.2~0.5?g/l?七水硫酸鎂，0.5~1.2?g/l?l-半胱氨酸鹽酸鹽，磷源，0.1~0.2?g/l?氯化鉀，0.01~0.05?g/l?無(wú)水氯化鈣，金屬離子溶液和維生素溶液，所述培養(yǎng)基的ph為6.0~6.5。

9、優(yōu)選的，所述金屬離子溶液的配方為：1~2?g/l氨三乙酸、1~3?g/l?mgso4、30~50g/l?mnso4、0.1~1.0?g/l?nacl、10~100.0?mg/l?feso4、10~100.0?mg/l?cacl2、10~100.0mg/l?cocl2、10~100.0?mg/l?znso4、1~10.0?mg/l?cuso4、1~10.0?mg/l?alk(so4)2、1~10.0mg/l?na2moo4。

10、優(yōu)選的，所述維生素溶液的配方為：2~20?mg/l生物素、2~20?mg/l葉酸、10~100mg/l鹽酸吡哆辛、5~50?mg/l鹽酸硫胺素、5~50?mg/l?核黃素、5~50?mg/l?煙酸、5~50?mg/l泛酸鈣、0.1~1?mg/l氰鈷胺素、5~50?mg/l對(duì)氨基苯甲酸、5~50?mg/l硫辛酸。

11、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中n元素的濃度為18~130?mm。更優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中氮源為尿素和甲酰胺的混合物，且尿素的濃度為20mm、甲酰胺的濃度為50mm。

12、優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中p元素的濃度為1~200?mm。最優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中p元素的濃度為50mm。

13、本發(fā)明還進(jìn)一步提供一種用上述非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法，包括：

14、（1）菌種活化；

15、（2）種子培養(yǎng)；

16、（3）厭氧發(fā)酵：將種子液接種至所述非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為3~8%（v/v），在37℃、厭氧條件下發(fā)酵培養(yǎng)50~60?h，得到丁酸；

17、所述菌種為酪丁酸梭菌l319保藏號(hào)gdmcc?62289。

18、優(yōu)選的，所述菌種活化為：將菌種進(jìn)行平板劃線后，在37℃、厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)20~36?h，之后接種至rcm培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)12~18?h。

19、所述rcm培養(yǎng)基的配方為：10?g/l?蛋白胨，10?g/l?牛肉浸粉，5?g/l?葡萄糖，5?g/l?nacl，3?g/l酵母粉，3?g/l?無(wú)水乙酸鈉，1?g/l?可溶性淀粉，0.5?g/l?l-半胱氨酸鹽酸鹽，ph?6.5。

20、本發(fā)明的有益效果在于：

21、（1）本發(fā)明采用非常規(guī)氮源、磷源的培養(yǎng)基成分，實(shí)現(xiàn)了酪丁酸梭菌菌株的正常生長(zhǎng)。

22、（2）本發(fā)明的培養(yǎng)基可以實(shí)現(xiàn)非滅菌發(fā)酵，酪丁酸梭菌優(yōu)勢(shì)占比可達(dá)95%。

23、（3）本發(fā)明的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法的應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)酪丁酸梭菌在非滅菌體系中生產(chǎn)得到2.2?g/l的丁酸。

24、（4）本發(fā)明的培養(yǎng)基無(wú)需滅菌處理，實(shí)現(xiàn)了酪丁酸梭菌高效低成本非滅菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本。

技術(shù)特征：

1.?一種酪丁酸梭菌的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述酪丁酸梭菌為酪丁酸梭菌l319保藏號(hào)gdmcc?62289，

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基的配方為：

3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述金屬離子溶液的配方為：1~2?g/l氨三乙酸、1~3?g/l?mgso4、30~50?g/l?mnso4、0.1~1.0?g/l?nacl、10~100.0?mg/l?feso4、10~100.0?mg/l?cacl2、10~100.0?mg/l?cocl2、10~100.0?mg/l?znso4、1~10.0?mg/l?cuso4、1~10.0?mg/l?alk(so4)2、1~10.0?mg/l?na2moo4。

4.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素溶液的配方為：2~20?mg/l生物素、2~20?mg/l葉酸、10~100?mg/l鹽酸吡哆辛、5~50?mg/l鹽酸硫胺素、5~50mg/l?核黃素、5~50?mg/l?煙酸、5~50?mg/l?泛酸鈣、0.1~1?mg/l氰鈷胺素、5~50?mg/l對(duì)氨基苯甲酸、5~50?mg/l硫辛酸。

5.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中n元素的濃度為18~130?mm。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中氮源為尿素和甲酰胺的混合物。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中尿素的濃度為20mm、甲酰胺的濃度為50mm。

8.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中p元素的濃度為1~200?mm，優(yōu)選的，所述培養(yǎng)基中p元素的濃度為50mm。

9.一種用權(quán)利要求1~8任一所述的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵生產(chǎn)丁酸的方法，其特征在于，包括：

10.?根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述菌種活化為：將菌種進(jìn)行平板劃線后，在37℃、厭氧培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)20~36?h，之后接種至rcm培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)12~18?h。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)一種酪丁酸梭菌的非滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵方法，所述酪丁酸梭菌為酪丁酸梭菌L319保藏號(hào)GDMCC?62289，所述培養(yǎng)基以尿素或甲酰胺中的一種或兩種為唯一氮源或者以亞磷酸鹽為唯一磷源。本發(fā)明的培養(yǎng)基無(wú)需滅菌處理，實(shí)現(xiàn)了酪丁酸梭菌高效低成本非滅菌發(fā)酵生產(chǎn)的工藝，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本，可實(shí)現(xiàn)酪丁酸梭菌在非滅菌體系中生產(chǎn)丁酸，酪丁酸梭菌優(yōu)勢(shì)占比可達(dá)95%。

技術(shù)研發(fā)人員：江凌,楊智晗,朱政明,蒙恭芮,陳盈利
受保護(hù)的技術(shù)使用者：南京工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19