本發(fā)明涉及生物基因工程，具體涉及一種柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、屬于三萜化合物的柴胡皂苷是傘形科柴胡屬植物(bupleurum?l.)的主要活性成分，柴胡皂苷a(saikosaponin?a)和柴胡皂苷d(saikosaponin?d)是其中的代表性成分。柴胡皂苷是一類五環(huán)三萜化合物，研究表明柴胡皂苷具有顯著的抗抑郁、抗炎、肝臟保護(hù)、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用(jiang?n等,global?traditional?chinese?medicine,2018,11(5):796-800)，是中藥柴胡的主要活性成分?！吨袊幍洹分幸?guī)定，柴胡藥材中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的總含量不得低于0.3％。柴胡滴丸每袋含柴胡以柴胡皂苷a(c42h68o13)計(jì)，不得少于0.525mg。隨著對(duì)柴胡皂苷的深入研究，柴胡皂苷將面臨大量的需求。作為植物次生代謝產(chǎn)物，柴胡皂苷在柴胡植物中含量較低，而目前獲取柴胡皂苷的主要手段仍是對(duì)藥用植物柴胡的提取分離。柴胡生長周期長，且大量提取分離不符合綠色環(huán)保理念。通過解析柴胡皂苷生源合成途徑，并采用新穎的合成生物學(xué)手段異源合成，有望以綠色環(huán)保的方式大量獲取各種柴胡皂苷。

2、目前柴胡中三萜化合物上游合成途徑基因已經(jīng)得到克隆和表征，包括鯊烯合酶bfss1(kim?ys等,planta,2011,233(2):343-55.)。柴胡皂苷關(guān)鍵母核β-香樹脂醇合成的關(guān)鍵基因bcbas1已經(jīng)在煙草中鑒定功能(毛艷萍等，北柴胡β-香樹脂醇合酶基因家族成員鑒定及功能驗(yàn)證，中草藥,2023,54(11):3647-3654)，然而柴胡皂苷下游合成途徑解析及合成生物學(xué)研究未見相關(guān)報(bào)道。在165種柴胡皂苷中，有152種是β-香樹脂醇產(chǎn)生的齊墩果烷型柴胡皂苷。151種齊墩果烷型柴胡皂苷中，有101種在c-28位點(diǎn)羥基化修飾(圖1為本發(fā)明推導(dǎo)的柴胡皂苷生物合成途徑)，因此進(jìn)一步挖掘柴胡皂苷生物合成中c-28羥化酶，并探索其對(duì)柴胡皂苷生物合成途徑解析及其生物學(xué)合成手段具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了進(jìn)一步推動(dòng)柴胡皂苷生物合成途徑解析和合成生物學(xué)研究，本發(fā)明致力于挖掘具有催化柴胡皂苷生物合成中間體β-香樹脂醇，并在其c-28位進(jìn)一步多步氧化產(chǎn)生高根二醇和齊墩果酸的關(guān)鍵因子，進(jìn)而提供一種柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因及應(yīng)用，該柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因?yàn)閏yp716a41，其對(duì)柴胡皂苷等齊墩果烷型五環(huán)三萜化合物的合成調(diào)控具有重要的研究價(jià)值。

2、為達(dá)到以上技術(shù)目的，本申請(qǐng)采用的技術(shù)方案如下：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因，所述柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因來自川柴2號(hào)，所述柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因cds區(qū)核苷酸和cds區(qū)核苷酸反向互補(bǔ)序列分別如seq?id?no：2和seq?id?no：3所示。

4、第二方面，本發(fā)明提供一種柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因，所述柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因來自川北柴1號(hào)，所述柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因cds區(qū)核苷酸和cds區(qū)核苷酸反向互補(bǔ)序列分別如seq?id?no：5和seq?id?no：6所示。

5、第三方面，本發(fā)明提供編碼第一方面所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因的氨基酸，所述氨基酸具有seq?id?no：1所示序列。

6、第四方面，本發(fā)明提供編碼第二方面所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因的氨基酸，所述氨基酸具有seq?id?no：4所示序列。第五方面，本發(fā)明提供表達(dá)載體，含有第一方面或第二方面所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因。

7、第六方面，本發(fā)明提供重組宿主細(xì)胞，包含第一方面或第二方面所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因、或者第五方面所述的表達(dá)載體。

8、優(yōu)選地，所述細(xì)胞選自：細(xì)菌、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。

9、第七方面，本發(fā)明提供第一方面或第二方面所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因或第三方面或者第四方面所述的氨基酸或第五方面所述的表達(dá)載體或第六方面所述的重組宿主細(xì)胞在催化β-香樹脂醇c-28位羥基化反應(yīng)和/或催化高根二醇c-28位羧基化反應(yīng)中的應(yīng)用。

10、第八方面，本發(fā)明提供第一方面或第二方面所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因或第三方面或第四方面所述的氨基酸或第五方面所述的表達(dá)載體或第六方面所述的重組宿主細(xì)胞在合成高根二醇和/或齊墩果酸和/或齊墩果烷型柴胡皂苷中的應(yīng)用。

11、第九方面，本發(fā)明提供第一方面或第二方面所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因或第三方面或第四方面所述的氨基酸或第五方面所述的表達(dá)載體或第六方面所述的重組宿主細(xì)胞在柴胡植物育種中的應(yīng)用。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

13、本發(fā)明提供一種柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因cyp716a41，該酶經(jīng)催化實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有催化柴胡皂苷生物合成中間體β-香樹脂醇，并在其c-28位多步氧化產(chǎn)生高根二醇和齊墩果酸的功能。本發(fā)明應(yīng)用該酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了柴胡皂苷合成中間體高根二醇的異源生產(chǎn)，而高根二醇為各種c-28羥基化齊墩果烷型柴胡皂苷以及其他c-28羥基化位點(diǎn)三萜化合物的重要合成中間體。本發(fā)明進(jìn)一步推動(dòng)了柴胡皂苷生物合成途徑解析和合成生物學(xué)研究，對(duì)柴胡皂苷等齊墩果烷型五環(huán)三萜化合物的合成調(diào)控以及柴胡植物育種具有重要的研究價(jià)值。

技術(shù)特征：

1.一種柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因，其特征在于，所述柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因來自川柴2號(hào)，所述柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因cds區(qū)核苷酸和cds區(qū)核苷酸反向互補(bǔ)序列分別如?seq?id?no：2和seq?id?no：3所示。

2.一種柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因，其特征在于，所述柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因來自川北柴1號(hào)，所述柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因cds區(qū)核苷酸和cds區(qū)核苷酸反向互補(bǔ)序列分別如?seq?id?no：5和seq?id?no：6所示。

3.編碼權(quán)利要求1所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸具有seq?id?no：1所示序列。

4.編碼權(quán)利要求2所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸具有seq?id?no：4所示序列。

5.表達(dá)載體，其特征在于，含有權(quán)利要求1或2所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因。

6.重組宿主細(xì)胞，其特征在于，包含權(quán)利要求1或2所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因、或權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞選自：細(xì)菌、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。

8.權(quán)利要求1或2所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因或權(quán)利要求3或4所述的氨基酸或權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求6或7所述的重組宿主細(xì)胞在催化β-香樹脂醇c-28位羥基化反應(yīng)和/或催化高根二醇c-28位羧基化反應(yīng)中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求1或2所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因或權(quán)利要求3或4所述的氨基酸或權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求6或7所述的重組宿主細(xì)胞在合成高根二醇和/或齊墩果酸和/或齊墩果烷型柴胡皂苷中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求1或2所述的柴胡細(xì)胞色素p450氧化酶基因或權(quán)利要求3或4所述的氨基酸或權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求6或7所述的重組宿主細(xì)胞在柴胡植物育種中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種柴胡細(xì)胞色素P450氧化酶基因及應(yīng)用，該基因?yàn)镃YP716A41。該酶經(jīng)催化實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有催化柴胡皂苷生物合成中間體β?香樹脂醇，并在其C?28位多步氧化產(chǎn)生高根二醇和齊墩果酸的功能。本發(fā)明應(yīng)用該酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了柴胡皂苷合成中間體高根二醇的異源生產(chǎn)，而高根二醇為各種C?28羥基化齊墩果烷型柴胡皂苷以及其他C?28羥基化位點(diǎn)三萜化合物的重要合成中間體。本發(fā)明進(jìn)一步推動(dòng)了柴胡皂苷生物合成途徑解析和合成生物學(xué)研究，對(duì)柴胡皂苷等齊墩果烷型五環(huán)三萜化合物的合成調(diào)控以及柴胡植物育種具有重要的研究價(jià)值。

技術(shù)研發(fā)人員：余馬,董凱密,曾存華,張怡,趙軍,陳華,辛超
受保護(hù)的技術(shù)使用者：西南科技大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/11/18