本發(fā)明屬于植物育種和生物，具體涉及一種誘導(dǎo)植物無(wú)融合生殖的方法，具體涉及c2h6基因在誘導(dǎo)無(wú)融合生殖中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、水稻(學(xué)名：oryza?sativa?l.)是禾本科稻屬的一種植物，是全球最重要的糧食作物之一?？茖W(xué)家們一直在研究和改良水稻品種，以提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)和增強(qiáng)抗病蟲(chóng)能力。例如，雜交水稻和轉(zhuǎn)基因水稻就是現(xiàn)代科技在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。目前，雜交品種已覆蓋我國(guó)約50％的水稻種植面積，對(duì)我國(guó)糧食安全做出了重大貢獻(xiàn)。然而，由于雜種優(yōu)勢(shì)難以通過(guò)后代遺傳，因遺傳重組分離現(xiàn)象，每年都需投入大量人力和物力進(jìn)行雜交種的制種工作。這一繁瑣的過(guò)程不僅增加了風(fēng)險(xiǎn)和成本，也限制了雜交種的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。因此，實(shí)現(xiàn)雜交種自留種被視為雜交育種的最終目標(biāo)。無(wú)融合生殖是一種通過(guò)種子進(jìn)行克隆繁殖的無(wú)性生殖方式，可以產(chǎn)生與母本基因型完全一致的后代。引入無(wú)融合生殖特性至雜交種中，可使雜交后代保持穩(wěn)定的雜合基因型，防止性狀分離，從而穩(wěn)定遺傳雜種優(yōu)勢(shì)，這將極大簡(jiǎn)化育種程序，降低風(fēng)險(xiǎn)和成本，擴(kuò)展雜種優(yōu)勢(shì)利用。近幾十年來(lái)，隨著生殖發(fā)育分子機(jī)制的解析及基因編輯技術(shù)的發(fā)展，人工創(chuàng)制無(wú)融合生殖技術(shù)取得了重大突破。多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)mime策略(產(chǎn)生與母本基因型完全一致的克隆配子)和單倍體誘導(dǎo)策略，成功在模式植物如擬南芥和水稻中創(chuàng)制了克隆種子。mercier團(tuán)隊(duì)在擬南芥中率先嘗試了將mime(atspo11-1-atrec8-atosd1)與cenh3染色體消除系進(jìn)行雜交，獲得了約40％的克隆種子(marimuthump,jolivet?s,ravi?m,pereira?l,davda?jn,cromer?l,wang?l,noguéf,chan?sw,siddiqii,mercier?r.synthetic?clonal?reproduction?through?seeds.science.2011feb?18；331(6019):876.doi:10.1126/science.1199682.)。值得注意的是，盡管cenh3功能在多個(gè)物種中顯示出高度的保守性，但在擬南芥以外的系統(tǒng)中尚未報(bào)道基于cenh3的無(wú)融合生殖體系。2019年，venkatesan?sundaresan團(tuán)隊(duì)將mime(pair1-rec8-osd1)與卵細(xì)胞特異啟動(dòng)子pdd45驅(qū)動(dòng)的bbm1表達(dá)元件相結(jié)合，首次在常規(guī)水稻品種kitaake中建立了無(wú)融合生殖體系，獲得了kitaake的克隆種子。盡管結(jié)實(shí)率較低，但克隆種子效率最高達(dá)到了29％(khanday?i,skinner?d,yang?b,mercier?r,sundaresan?v.a?male-expressed?riceembryogenic?trigger?redirected?for?asexual?propagation?throughseeds.nature.2019jan；565(7737):91-95.doi:10.1038/s41586-018-0785-8.)。同一年，王克劍團(tuán)隊(duì)通過(guò)crispr/cas9技術(shù)在秈粳雜交稻春優(yōu)84(cy84)中獲得了mime(pair1-rec8-osd1)與mtl基因同時(shí)突變的fix株系，首次成功產(chǎn)生雜交水稻的克隆種子，結(jié)實(shí)率介于3.7％至5.2％，克隆種子占所有可育種子的4.7％至9.5％(wang?c,liu?q,shen?y,hua?y,wang?j,lin?j,wu?m,sun?t,cheng?z,mercier?r,wang?k.clonal?seeds?from?hybridrice?by?simultaneous?genome?engineering?of?meiosis?and?fertilizationgenes.nat?biotechnol.2019mar；37(3):283-286.doi:10.1038/s41587-018-0003-0.)。與cenh3策略不同，這兩種方法不需要雜交過(guò)程，通過(guò)自交就能獲得無(wú)融合生殖的克隆種子，為作物雜種優(yōu)勢(shì)的固定利用開(kāi)辟了新的研究方向。2022年，emmanuel?guiderdoni和raphael?mercier團(tuán)隊(duì)在雜交水稻brs-cirad?302品種中將bbm1與mime整合到同一載體上，創(chuàng)建了克隆種子比例超過(guò)90％的無(wú)融合生殖體系，盡管該體系在溫室條件下的結(jié)實(shí)率大約只有30％(vernet?a,meynard?d,lian?q,mieulet?d,gibert?o,bissah?m,rivallan?r,autran?d,leblanc?o,meunier?ac,frouin?j,taillebois?j,shankle?k,khanday?i,mercier?r,sundaresan?v,guiderdoni?e.high-frequency?synthetic?apomixis?inhybrid?rice.nat?commun.2022dec?27；13(1):7963.doi:10.1038/s41467-022-35679-3.)。2023年，王克劍團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探索了bbm1的同源基因bbm4在無(wú)融合生殖體系中的應(yīng)用潛力，他們?cè)诙i粳雜交稻春優(yōu)84(cy84)中成功獲得了能夠進(jìn)行無(wú)融合生殖的fix2株系，這些克隆植株在外觀上與野生型雜交水稻極為相似，且保持了80.9至82.0％的高結(jié)實(shí)率，盡管在這項(xiàng)研究中，克隆種子的比例最高僅為2.3％(wei?x,liu?c,chen?x,lu?h,wang?j,yangs,wang?k.synthetic?apomixis?with?normal?hybrid?rice?seed?production.molplant.2023mar?6；16(3):489-492.doi:10.1016/j.molp.2023.01.005.)。最新研究表明，通過(guò)結(jié)合蒲公英par基因誘導(dǎo)的孤雌生殖與mime(pair1-rec8-osd1)策略，可以在雜交水稻中實(shí)現(xiàn)無(wú)融合生殖，既保持了正常的結(jié)實(shí)率，又達(dá)到了最高67.7％的克隆種子效率(songm,wang?w,ji?c,li?s,liu?w,hu?x,feng?a,ruan?s,du?s,wang?h,dai?k,guo?l,qian?q,sih,hu?x.simultaneous?production?of?high-frequency?synthetic?apomixis?with?highfertility?and?improved?agronomic?traits?in?hybrid?rice.mol?plant.2024jan1；17(1):4-7.doi:10.1016/j.molp.2023.11.007.)。這些成果不僅為作物雜種優(yōu)勢(shì)的固定提供了新的研究路徑，也對(duì)保障全球糧食安全具有深遠(yuǎn)的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。

2、目前，水稻的無(wú)融合生殖技術(shù)已取得了顯著進(jìn)展，但還面臨著關(guān)鍵挑戰(zhàn)。一方面，雖然無(wú)融合生殖植株能夠保持正常的結(jié)實(shí)率，其克隆種子的生成效率卻相當(dāng)?shù)?。另一方面，?dāng)克隆種子的效率接近100％時(shí)，無(wú)融合生殖植株的結(jié)實(shí)率卻會(huì)顯著降低。這說(shuō)明當(dāng)前尚未開(kāi)發(fā)出一套既能保證100％克隆效率，又能維持克隆植株正常結(jié)實(shí)率的無(wú)融合生殖技術(shù)體系，這限制了雜交水稻無(wú)融合生殖技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。因此，急需探索和鑒定更多與無(wú)融合生殖相關(guān)的基因，以便對(duì)現(xiàn)有技術(shù)體系進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和提升。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于無(wú)融合生殖植物株系的制備，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)水稻等植物中的c2h6基因可以用于構(gòu)建了無(wú)融合生殖株系，由此完成本發(fā)明。

2、本發(fā)明首先提供一種c2h6基因在制備無(wú)融合生殖植物株系中的應(yīng)用，優(yōu)選地，所述植物為單子葉植物和雙子葉植物；優(yōu)選的，所述植物為禾本科、豆科、十字花科植物；優(yōu)選的，所述植物為水稻、玉米、谷子、小麥、大麥、高粱、大豆、油菜。

3、進(jìn)而提供一種用于誘導(dǎo)無(wú)融合生殖植物株系的雙元表達(dá)載體，其包括由卵細(xì)胞特異表達(dá)的啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)連接的c2h6基因；優(yōu)選的，所述c2h6基因來(lái)源于單子葉植物或雙子葉植物；優(yōu)選的，所述c2h6基因來(lái)源于禾本科、豆科、十字花科植物；優(yōu)選的，所述c2h6基因來(lái)源于水稻、玉米、谷子、小麥、大麥、高粱、大豆、油菜；更具體地，所述c2h6基因是與水稻中osc2h6基因、谷子中sic2h6基因或玉米中zmc2h6基因具有50％以上，55％以上，60％以上，70％以上，80％以上，90％以上，95％以上，98％以上或99％以上同一性的同源基因，更優(yōu)選是來(lái)源于同一物種的同源基因，或其簡(jiǎn)并序列的基因。

4、所述c2h6基因是全長(zhǎng)的基因組序列基因或全長(zhǎng)的編碼區(qū)序列基因，或其簡(jiǎn)并序列的基因。

5、進(jìn)一步地，載體上還攜帶可產(chǎn)生mime的元件，優(yōu)選的，mime包括pair1、rec8和osd1的同時(shí)突變，可產(chǎn)生mime的元件包括：u3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼pari1?sgrna的dna序列，u3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼rec8?sgrna的dna序列以及u3啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的編碼osd1?sgrna的dna序列。

6、例如，對(duì)于水稻來(lái)說(shuō)，其是二倍體，mime元件導(dǎo)入后可產(chǎn)生四倍體的后代，c2h6表達(dá)元件可誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體，mime元件和c2h6表達(dá)元件結(jié)合后可以將四倍體減半成二倍體，即可產(chǎn)生克隆種子。因此mime元件和c2h6表達(dá)元件在一個(gè)載體上才能誘導(dǎo)產(chǎn)生無(wú)融合生殖株系。

7、具體地，其出發(fā)載體為pcambia系列載體(例如pcambia1300)、pgreen系列載體、pbin系列載體、pbi系列載體、phellsgate系列載體；所述啟動(dòng)子為卵細(xì)胞特異啟動(dòng)子，優(yōu)選地，選自atec1.2(at2g21740)、atec1.1(at1g76750)、atec1.3(at2g21750)、atec1.4(at4g39340)、atec1.5(at5g64720)、atec1.21(loc_os03g18530)、atec1.22(loc_os11g06730)、atec1.23(loc_os12g06970)。

8、優(yōu)選地，所述水稻osc2h6基因是全長(zhǎng)的osc2h6基因組序列基因或全長(zhǎng)的osc2h6編碼區(qū)序列基因。

9、本發(fā)明還提供一種誘導(dǎo)植物無(wú)融合生殖的方法，其包括如下步驟：將包含能夠產(chǎn)生mime的元件以及卵細(xì)胞特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的c2h6異位表達(dá)元件的雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入相應(yīng)的植物中，在轉(zhuǎn)基因植株中篩選mime且c2h6異位表達(dá)的株系，即獲得無(wú)融合生殖株系。

10、具體地，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；優(yōu)選的，所述植物為禾本科、豆科、十字花科植物；優(yōu)選的，所述植物為水稻、玉米、谷子、小麥、大麥、高粱、大豆、油菜。

11、在具體實(shí)施方式中，所述導(dǎo)入采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法實(shí)現(xiàn)。

12、任選地，還包括篩選出結(jié)實(shí)率正常且克隆種子效率高的無(wú)融合生殖植株的步驟。

13、其中，以水稻為例，由于是二倍體植物，在可產(chǎn)生mime的元件導(dǎo)入水稻后可產(chǎn)生四倍體后代，而c2h6基因的異位表達(dá)則能誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體。因此，當(dāng)mime元件和c2h6異位表達(dá)元件結(jié)合后，能將四倍體減半至二倍體，進(jìn)而產(chǎn)生克隆種子。只有將mime元件和c2h6異位表達(dá)元件共同表達(dá)(例如整合在一個(gè)表達(dá)載體上)，才能成功誘導(dǎo)出無(wú)融合生殖株系。

14、在水稻相關(guān)研究中，已有報(bào)道顯示bbm1和bbm4可以誘導(dǎo)無(wú)融合生殖，而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的c2h6基因，經(jīng)驗(yàn)證同樣可以應(yīng)用于無(wú)融合生殖產(chǎn)生克隆種子，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。盡管基于topar的無(wú)融合生殖植株實(shí)現(xiàn)了正常的結(jié)實(shí)率和最高67.7％的克隆種子效率，但由于topar是源自蒲公英的基因，而非水稻的內(nèi)源基因，這一點(diǎn)可能會(huì)限制其在水稻無(wú)融合生殖應(yīng)用中的實(shí)際落地。因此，我們的發(fā)明，即基于osc2h6的無(wú)融合生殖體系，展現(xiàn)出了顯著的優(yōu)勢(shì)。而且還因?yàn)閛sc2h6為水稻的內(nèi)源基因，更適合于水稻無(wú)融合生殖技術(shù)的應(yīng)用和推廣。