本發(fā)明屬于基因工程領域，尤其涉及一種產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株及其構建方法和應用。

背景技術：

1、本部分的陳述僅僅是提供了與本發(fā)明相關的背景技術信息，不必然構成在先技術。

2、l-蘋果酸是一種重要的平臺化合物，在食品、醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應用。蘋果酸主要是通過化學法，酶法，生物發(fā)酵合成，其中利用微生物細胞工廠合成蘋果酸具有綠色、可持續(xù)等優(yōu)勢。利用發(fā)酵法生產(chǎn)蘋果酸的生產(chǎn)菌種主要包括絲狀真菌，大腸桿菌，酵母等。絲狀真菌如米曲霉是天然的蘋果酸生產(chǎn)菌株，已經(jīng)用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，但是絲狀真菌的發(fā)酵周期較長；大腸桿菌是應用最廣泛的原核微生物細胞工廠，也已經(jīng)被工程化改造合成蘋果酸。目前，蘋果酸發(fā)酵過程均需要加堿中和，大量中和劑的使用，為產(chǎn)品的分離帶來不便，也使生產(chǎn)成本增加。

3、釀酒酵母是極具潛力的細胞工廠，具有較好的耐酸性，現(xiàn)有技術中也存在一些改造釀酒酵母生產(chǎn)蘋果酸的例子，如，torulopsis?glabrata?cctcc?m202019是用于工業(yè)生產(chǎn)丙酮酸的酵母，經(jīng)過以下代謝改造生產(chǎn)蘋果酸，主要操作有過表達內(nèi)源丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶構建rtca途徑以及過表達ropyc、romdh和spmae1。在最終菌株t.glabrata?t.g-pms中產(chǎn)生了8.5g/l蘋果酸，比初始菌株高約10倍。據(jù)調(diào)查，釀酒酵母改造株中還存在蘋果酸產(chǎn)量低、菌株自身生長受限或發(fā)酵時間較長等問題。

技術實現(xiàn)思路

1、為克服上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株及其構建方法和應用。本研究通過引入rtca途徑，構建了蘋果酸的生產(chǎn)菌株，并通過增加前體物質(zhì)，關鍵基因多拷貝，調(diào)節(jié)輔因子供應等代謝工程策略，提高蘋果酸的產(chǎn)量，比初始構建的菌株提高了7.2倍。在此基礎上，將蘋果酸生產(chǎn)菌株與耐酸菌株交配提高了菌株的生產(chǎn)效率，優(yōu)化副產(chǎn)物積累，在搖瓶中發(fā)酵24h能夠產(chǎn)生12g/l蘋果酸，轉化率為0.69g/g，生產(chǎn)率為0.5g/l/h，在1l發(fā)酵罐中獲得65.3g/l蘋果酸。同時為低ph發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸奠定了基礎。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個或多個實施例提供了如下技術方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株，以釀酒酵母by-a0為出發(fā)菌株，構建蘋果酸生產(chǎn)途徑、增加前體物質(zhì)草酰乙酸、多輪整合蘋果酸脫氫酶、過表達磷酸烯醇式丙酮酸激酶、敲除蘋果酸內(nèi)運蛋白dic1后過表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶zwf1和轉氫酶ecstha獲得；

4、所述構建蘋果酸生產(chǎn)途徑通過過表達蘋果酸脫氫酶、蘋果酸轉運蛋白mae1實現(xiàn)；

5、所述增加前體物質(zhì)草酰乙酸通過過表達丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc，并敲除甘油-3-磷酸脫氫酶實現(xiàn)。

6、本發(fā)明的具體實施方式中，所述蘋果酸脫氫酶為釀酒酵母內(nèi)源的截短過氧化物酶定位肽的蘋果酸脫氫酶scmdh3δskl，其氨基酸序列在malic?acid?production?bysaccharomyces?cerevisiae:engineering?of?pyruvate?carboxylation,oxaloacetatereduction,and?malate?export文獻中公開；其氨基酸序列如seq?id?no.1所示；

7、所述蘋果酸轉運蛋白mae1來自粟酒裂殖酵母的spmae1，其genbank號為cac37422.1；

8、所述丙酮酸羧化酶包括pyc1和pyc2，genbank號分別為caa96765.1,caa85182.1；

9、所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc為大腸桿菌來源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的突變體ppck620s；在genbank:cad6022922.1所示的氨基酸序列中將k620突變?yōu)閟；

10、所述甘油-3-磷酸脫氫酶包括gpd1和gpd2，其genbank號分別為kag2509011.1,kag2511872.1；

11、所述磷酸烯醇式丙酮酸激酶pck，其genbank號為aac45394.1；所述蘋果酸內(nèi)運蛋白dic1，其genbank號為qhb10491.1；

12、所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶zwf1，其genbank號為caa96146.1；

13、所述轉氫酶ecstha，其genbank號為cad6022916.1。

14、本發(fā)明的具體實施方式中，scmdh3δskl基因受啟動子uastef-cit-clb-pgpd及終止子tcyc1的調(diào)控；其中啟動子序列在controlling?promoter?strength?and?regulation?insaccharomyces?cerevisiae?using?synthetic?hybrid?promoters文獻中公開，終止子從已公開的質(zhì)粒piyc04(addgene號：64741)中擴增。

15、本發(fā)明的具體實施方式中，轉運蛋白的表達由啟動子ptef1和終止子tpgk1控制，均從公開質(zhì)粒pjfe3(pmid:36636342)中擴增。

16、本發(fā)明的具體實施方式中，所述多輪整合蘋果酸脫氫酶將scmdh3δskl基因的表達盒整合在delta區(qū)實現(xiàn)。

17、第二方面，本發(fā)明提供產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株在如下任意一種或多種中的應用：

18、a1:生產(chǎn)l-蘋果酸；

19、a2：制備生產(chǎn)l-蘋果酸的試劑或試劑盒；

20、a3：構建高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株；

21、a4:生產(chǎn)蘋果酸下游產(chǎn)物；如，丁二酸，富馬酸等。

22、本發(fā)明的具體實施方式中，所述應用a3中，構建高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株的方法包括，將第一方面所述的產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株與耐酸菌株ma-α進行交配，獲得了二倍體菌株，隨后，敲除乙醇脫氫酶adh1和甘油-3-磷酸脫氫酶gpd1/gpd2；

23、所述耐酸菌株ma-α，具體為釀酒酵母cen.pk113-5d敲除丙酮酸脫羧酶的同工酶pdc1，并將其交配型改為matα后所得；優(yōu)選的，為了進一步提高其耐酸(蘋果酸)性能，在敲除丙酮酸脫羧酶的同工酶pdc1之前，可以對釀酒酵母cen.pk113-5d先基于適應性實驗室進化(adaptive?laboratory?evolution)策略，篩選獲得對蘋果酸耐受性更高的釀酒酵母；具體的，所述適應性實驗室進化策略具體方法為：將釀酒酵母cen.pk113-5d菌株在含有20g/l蘋果酸的培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，48h內(nèi)生長至od600為15-20時則轉接到蘋果酸濃度為25g/l培養(yǎng)基中繼續(xù)進化，否則繼續(xù)轉接到20g/l蘋果酸的培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，重復上述操作。

24、所述adh1、gpd1/gpd2、pdc1的genbank號分別為：kaf1902089.1,kag2509011.1,kag2511872.1,caa97575.1。

25、第三方面，本發(fā)明提供第二方面制備獲得高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株。

26、第四方面，本發(fā)明提供一種發(fā)酵物/微生物菌劑，由上述產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株或高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株發(fā)酵獲得。

27、第五方面，本發(fā)明提供上述的高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株或發(fā)酵物/微生物菌劑在如下任意一種或多種中的應用：

28、a11:生產(chǎn)l-蘋果酸；

29、a12：制備生產(chǎn)l-蘋果酸的試劑或試劑盒；

30、a13：用于降解葡萄糖；

31、a14：制備降解葡萄糖的試劑或試劑盒；

32、a15：生產(chǎn)蘋果酸下游產(chǎn)物，如，丁二酸，富馬酸等；

33、a16：制備生產(chǎn)蘋果酸下游產(chǎn)物的試劑盒。

34、第六方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)l-蘋果酸的方法，將第一方面所述的產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株或第三方面所述的高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株，置于培養(yǎng)基中發(fā)酵獲得；

35、所述培養(yǎng)基為ypd培養(yǎng)基；所述ypd培養(yǎng)基中還包括3-8g/l?caco3；優(yōu)選的，所述ypd培養(yǎng)基中還包括5g/l?caco3。

36、第七方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株或高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株的構建方法，包括，

37、以釀酒酵母by-a0為出發(fā)菌株，依次過表達蘋果酸脫氫酶、蘋果酸轉運蛋白mae1、丙酮酸羧化酶pyc1和pyc2、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc、敲除油-3-磷酸脫氫酶gpd1/2；后將scmdh3δskl進行多拷貝整合至delta區(qū)；過表達磷酸烯醇式丙酮酸激酶pck的同時敲除蘋果酸內(nèi)運蛋白dic1；過表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶zwf1和轉氫酶ecstha，獲得產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株；

38、或，將產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株與耐酸菌株ma-α進行交配，獲得了二倍體菌株，隨后，敲除乙醇脫氫酶adh1和甘油-3-磷酸脫氫酶gpd1/gpd2；

39、所述耐酸菌株ma-α，具體為釀酒酵母cen.pk113-5d敲除丙酮酸脫羧酶的同工酶pdc1，并將其交配型改為matα后所得；優(yōu)選的，為了進一步提高其耐酸(蘋果酸)性能，在敲除丙酮酸脫羧酶的同工酶pdc1之前，可以對釀酒酵母cen.pk113-5d先基于適應性實驗室進化(adaptive?laboratory?evolution)策略，篩選獲得對蘋果酸耐受性更高的釀酒酵母；具體的，所述適應性實驗室進化策略具體方法為：將釀酒酵母cen.pk113-5d菌株在含有20g/l蘋果酸的培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，連續(xù)轉接傳代，od600達到10以上則轉接到蘋果酸濃度為25g/l培養(yǎng)基中繼續(xù)進化，否則繼續(xù)轉接到20g/l蘋果酸的培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，重復上述操作，逐漸提高蘋果酸濃度，最終將蘋果酸濃度提高至40g/l。

40、進一步的，所述高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株為釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)mat-2-2，其已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2024年6月7日，保藏編號為cctcc?no:m?20241183。

41、以上一個或多個技術方案存在以下有益效果：

42、本發(fā)明提供了一株產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株，經(jīng)過構建蘋果酸生物合成途徑、增加前體物質(zhì)草酰乙酸、將scmdh3δskl進行多拷貝整合提高表達量。隨后敲除蘋果酸內(nèi)運至線粒體的轉運蛋白dic1弱化蘋果酸消耗途徑，最后表達轉氫酶使胞內(nèi)nadh合成增加，進一步推動蘋果酸合成，產(chǎn)量達到3.7g/l，相比初始改造菌株提高了7.2倍。

43、本發(fā)明中還以產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株為出發(fā)菌株構建了高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株。本發(fā)明中所提供的高產(chǎn)l-蘋果酸的基因工程菌株，較產(chǎn)l-蘋果酸的釀酒酵母工程菌株蘋果酸產(chǎn)量顯著提高，在1l發(fā)酵罐中進行分批補料發(fā)酵獲得65.3g/l蘋果酸，同時更耐酸，副產(chǎn)物更少，菌體活性更穩(wěn)定，且發(fā)酵時間短。

44、該發(fā)明拓寬了對釀酒酵母生產(chǎn)蘋果酸的代謝工程策略的思路，是對蘋果酸生物合成研究的有益補充，為低ph發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸奠定了一定基礎，為高產(chǎn)l-蘋果酸提供新的菌株，具有實際生產(chǎn)意義。

45、本發(fā)明附加方面的優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。