本發(fā)明涉及生物，具體地，涉及一種基于crispr的重組子篩選方法及相應(yīng)試劑盒。

背景技術(shù)：

1、基因工程的基本技術(shù)路線大概可以概括為4個步驟：1、獲取目的基因；2、構(gòu)建克隆載體；3、目的基因與克隆載體重組后導(dǎo)入受體細胞；4、對受體細胞中目的基因進行檢測和鑒定。

2、載體dna分子上通常攜帶了一定的選擇遺傳標(biāo)記基因，可進行轉(zhuǎn)化子或重組子初步篩選。做法是將轉(zhuǎn)化處理后的菌液(包括對照處理)適量涂布在選擇培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時間，觀察菌落生長情況，即可挑選出轉(zhuǎn)化子。

3、對于受體細胞而言，通常用lb培養(yǎng)基，在lb培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物，即為選擇培養(yǎng)基。選擇物是由載體dna分子上攜帶的選擇標(biāo)記基因所決定。比較常見為抗性藥篩選。這是利用載體dna分子上的抗藥性篩選標(biāo)記進行篩選的方法。主要用于重組質(zhì)粒dna分子的轉(zhuǎn)化子篩選。重組質(zhì)粒dna分子攜帶特定的抗藥性選擇標(biāo)記基因，在含有相應(yīng)選擇藥物的選擇培養(yǎng)基上正常生長。

4、后續(xù)對受體細胞進一步篩選，可以采用質(zhì)粒pcr或菌落pcr的方式。質(zhì)粒pcr是把每個菌落挑出來進行培養(yǎng)提取質(zhì)粒，然后質(zhì)粒進行測序或者酶切驗證目的片段。但是從培養(yǎng)細菌到最后送測序，花費太多時間。

5、菌落pcr(colony?pcr)可不必提取目的基因dna，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的dna為模板進行pcr擴增，省時少力。建議使用載體上的通用引物來篩選陽性克隆。通常利用此pcr的方法進行篩選插入的目的基因或者dna測序分析。最后的pcr產(chǎn)物大小是載體通用引物之間的片斷大小。菌落pcr有耗時長且產(chǎn)物不能直接送于測序的缺點。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種新的可以縮短重組子篩選時間的重組子篩選方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種新的可以縮短重組子篩選時間的重組子篩選方法。

2、本發(fā)明第一方面提供了一種重組子篩選方法，包括步驟：

3、(i)提供一經(jīng)過人工導(dǎo)入dna重組分子的步驟的受體細胞，對所述受體細胞進行裂解，從而獲得受體細胞裂解產(chǎn)物，所述人工導(dǎo)入dna重組分子所用的載體上含有識別所述載體的特異性基因；

4、(ii)對所述受體細胞裂解產(chǎn)物進行核酸擴增，從而獲得擴增產(chǎn)物；

5、(iii)將所獲得的擴增產(chǎn)物與crispr核酸檢測試劑接觸，對所述特異性基因進行檢測，判斷受體細胞中是否含有所述特異性基因。

6、在另一優(yōu)選例中，所述方法在步驟(i)之前還包括步驟：

7、將dna重組分子人工導(dǎo)入受體細胞，從而獲得經(jīng)過人工導(dǎo)入dna重組分子的步驟的受體細胞，并對所述受體細胞進行培養(yǎng)。

8、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：(iv)根據(jù)特異性基因的檢測結(jié)果，從而對受體細胞進行篩選，獲得重組子。

9、在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括：(v)對所述重組子進行測序，從而鑒定出目的重組子。

10、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)包括平板培養(yǎng)、菌液培養(yǎng)。

11、在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)時間為8-20h，較佳地，9-15h，更佳地，12-14h。

12、在另一優(yōu)選例中，所述特異性基因包括：抗性基因、復(fù)制子或終止子。

13、在另一優(yōu)選例中，所述核酸擴增的方法包括等溫擴增。

14、在另一優(yōu)選例中，所述等溫擴增包括滾環(huán)擴增(rolling?circle?amplification，rca)。

15、在另一優(yōu)選例中，所述crispr核酸檢測試劑包括：

16、v型cas蛋白；

17、向?qū)na，所述向?qū)na包括能夠結(jié)合所述v型cas蛋白的同向重復(fù)序列(directrepeat，dr)和能夠靶向所述載體的特異性基因的導(dǎo)向序列；和

18、cas蛋白反式切割報告分子，所述cas蛋白反式切割報告分子包括單鏈核酸分子或單鏈核酸類似物分子，所述單鏈核酸分子或單鏈核酸類似物分子不與所述向?qū)na的導(dǎo)向序列雜交。

19、在另一優(yōu)選例中，所述v型cas蛋白具有反式切割活性。

20、在另一優(yōu)選例中，所述v型cas蛋白選自下組：v-a型cas蛋白、v-b型cas蛋白、v-c型cas蛋白、v-d型cas蛋白、v-e型cas蛋白、v-f型cas蛋白、v-g型cas蛋白、v-h型cas蛋白、v-i型cas蛋白、v-j型cas蛋白、v-l型cas蛋白、v-m型蛋白、或其組合。

21、在另一優(yōu)選例中，所述v型cas蛋白包括cas12。

22、在另一優(yōu)選例中，所述v型cas蛋白選自下組：cas12a、cas12b、cas12c、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h、cas12i、cas12j、cas12l、cas12m、或其組合；

23、另一優(yōu)選例中，所述cas12a選自下組：fncas12a、lbcas12a、ercas12a、evcas12a、lb5cas12a、hkcas12a、oscas12a、tscas12a、bbcas12a、bocas12a、lb4cas12a、cecas12a、prcas12a、csbcas12a、bhcas12a、sscas12a、lb3cas12a、bpcas12a、pdcas12a、bfcas12a、pccas12a、cmtcas12a、pecas12a、licas12a、lb2cas12a、pmcas12a、mbcas12a、eecas12a、csbcas12a、arcas12a、bscas12a、abcas12a、ascas12a、或其組合。

24、在另一優(yōu)選例中，所述cas12a的來源選自下組：纖毛菌屬、李斯特菌屬、棒狀桿菌屬、薩特氏菌屬、軍團菌屬、密螺旋體屬、產(chǎn)線菌屬、真細菌屬、鏈球菌屬、乳酸菌屬、支原體屬、擬桿菌屬、flaviivola、黃桿菌屬、固氮螺菌屬、sphaerochaeta、葡糖醋桿菌屬、奈瑟氏菌屬、羅氏菌屬、parvibaculum、葡萄球菌屬、nitratifractor、支原體屬、彎曲桿菌屬、毛螺菌屬、或其組合。

25、在另一優(yōu)選例中，所述cas12a的來源選自下組：圖拉弗朗西斯菌(francisellatularensis)(fncas12a)、氨基酸球菌屬bv3l6(acidaminococcus?sp.bv3l6)(ascas12a)、毛螺菌科細菌nd2006(lachnospiraceae?bacterium?nd2006)(lbcas12a)、毛螺菌科細菌nc2008(lachnospiraceae?bacterium?nc2008)(lb5cas12a)、孔氏創(chuàng)傷球菌(helcococcussp?kunzii)(hkcas12a)、oribacteriumsp.nk2b42(oscas12a)、thiomicrospira?sp.xs5(tscas12a)、擬桿菌ka00251(bacteroidales?bacterium?ka00251)(bbcas12a)、口腔擬桿菌(bacteroidetes?oral?taxon?274)(bocas12a)、毛螺菌科細菌mc2017(lachnospiraceaebacterium?mc2017)(lb4cas12a)、規(guī)則糞球菌(coprococcus?eutactus)(cecas12a)、棲瘤胃普氏菌(prevotella?ruminicola?strain?bpi-34)(prcas12a)、candidatussaccharibacteria?bacterium(csbcas12a)、亨氏丁酸弧菌(butyrivibrio?hungateistrain?mb2003)(bhcas12a)、史密斯氏菌sc_k08d17(smithella?sp.sc_k08d17)(sscas12a)、毛螺菌科細菌mc2017(lachnospiraceae?bacterium?mc2017)(lb3cas12a)、瘤胃溶纖維丁酸弧菌(bytyrivibrio?proteoclasticus)(bpcas12a)、普氏桿菌(prevotelladisens)(pdcas12a)、溶纖維丁酸弧菌md2001(butyrivibrio?fibrisolvens?md2001)(bfcas12a)、狗口腔卟啉單胞菌(porphyromonas?crevioricanis)pccas12a、candidatusmethanoplasma?termitum(cmtcas12a)、異域菌門細菌(peregrinibacteria?bacterium)(pecas12a)、leptospira?inadaiserovar?lyme(licas12a)、毛螺菌科細菌ma2020(lachnospiraceae?bacterium?ma2020)(lb2cas12a)、獼猴卟啉單胞菌(porphyromonasmacaca)(pmcas12a)、牛莫拉氏菌(moraxella?bovoculi?237)(mbcas12a)、挑剔真桿菌(eubacterium?eligens)(eecas12a)、candidatus?saccharibacteria?bacterium(csbcas12a)、直腸真桿菌(eubacte?riumrectale)(ercas12a)、直腸酵母菌(agathobacterrectalisstrain)(arcas12a)、丁酸弧菌nc3005(butyrivibrio?sp.nc3005)(bscas12a)、布氏弓形桿菌(arcobacter?butzleri)(abcas12a)或其組合。

26、在另一優(yōu)選例中，所述cas12b的來源選自下組：卡克氏脂環(huán)酸芽孢桿菌(alicyclobacillus?kakegawensis)、芽孢桿菌屬v3-13種、外村尚芽孢桿菌(bacillushisashii)、黏膠球形菌綱細菌(lentisphaeria?bacterium)、沉積物萊西氏菌(laceyellasediminis)或其組合。

27、在另一優(yōu)選例中，所述cas12b選自下組：aaccas12b、aacas12b、bthcas12b、aapcas12b、akcas12b、amcas12b、bs3cas12b、lscas12b、brcas12b(來自brevibacillussp.syp-b805，出自文章pmid:31926228doi:10.1016/j.ijbiomac.2020.01.079)、或其組合。

28、在另一優(yōu)選例中，所述cas蛋白反式切割報告分子選自下組：基于金納米顆粒的報告分子、基于熒光團的報告分子、基于熒光偏振的報告分子、基于膠體相變/分散的報告分子、基于電化學(xué)信號的報告分子、基于半導(dǎo)體信號的報告分子、基于顏色的報告分子。

29、在另一優(yōu)選例中，所述cas蛋白反式切割報告分子包括選自下組的分子：單鏈核酸分子、單鏈核酸類似物分子或其組合。

30、在另一優(yōu)選例中，所述單鏈核酸分子選自下組：未修飾的單鏈核酸分子、經(jīng)修飾的單鏈核酸分子、含有無堿基間隔物的單鏈核酸分子、或其組合。

31、在另一優(yōu)選例中，所述cas蛋白反式切割報告分子即核酸探針。

32、在另一優(yōu)選例中，所述核酸探針帶有可檢測標(biāo)記。

33、在另一優(yōu)選例中，所述可檢測標(biāo)記包括熒光基團、淬滅基團。

34、在另一優(yōu)選例中,所述熒光基團選自下組：fam、hex、cy3、cy5、cy5.5、cy7、rox、vic、joe、tet、texas?red、fitc、lc?red640、rb200或其組合。

35、在另一優(yōu)選例中，所述淬滅基團選自下組：tamara、bhq1、bhq2、bhq3、dabsyl、dabcyl、eclipse或其組合。

36、在另一優(yōu)選例中，所述的熒光基團和淬滅基團各自獨立地位于所述核酸探針的核酸的5'端、3'端和中部。

37、在另一優(yōu)選例中，所述的核酸探針的長度為3-300nt，較佳地5-100nt，更佳地5-50nt，最佳地5-15nt。

38、在另一優(yōu)選例中，所述核酸探針包括單鏈dna、單鏈rna或單鏈核酸類似物分子。

39、在另一優(yōu)選例中，所述的核酸探針包括帶有可檢測標(biāo)記的單鏈dna、單鏈rna或單鏈核酸類似物分子。

40、在另一優(yōu)選例中，所述的單鏈dna為熒光和生物素標(biāo)記的單鏈dna、單鏈rna或單鏈核酸類似物分子。

41、在另一優(yōu)選例中，所述的單鏈dna為熒光標(biāo)記的單鏈dna、單鏈rna或單鏈核酸類似物分子。

42、在另一優(yōu)選例中，所述v型cas蛋白是cas12b時，所述crispr核酸檢測試劑還包括tracrrna。

43、在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)之前，還包括目的基因的獲取、與載體的連接獲得dna重組分子的步驟。

44、在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)過dna重組分子人工導(dǎo)入，是用載體對受體細胞進行轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)。

45、在另一優(yōu)選例中，所述載體包括克隆載體、表達載體、測序載體、穿梭載體、探針載體或整合載體。

46、在另一優(yōu)選例中，所述載體選自下組：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、cosmid克隆載體、噬菌粒載體、人工染色體載體、附加型載體、病毒載體、或其組合。

47、在另一優(yōu)選例中，所述人工染色體載體選自下組：細菌人工染色體(bac)、酵母人工染色體(yac)、p1人工染色體(pac)、或其組合。

48、在另一優(yōu)選例中，所述病毒載體選自下組：逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體、痘病毒載體、桿狀病毒載體、乳頭多瘤空泡病毒、乳頭瘤病毒載體、hbp愛巴病毒(hbp?epstein?barrvirus)載體、牛痘病毒載體、塞姆利基森林病毒(semliki?forest?virus；sfv)、或其組合。

49、在另一優(yōu)選例中，所述載體選自下組：pcdna、ptt、ptt3、pefbos、pbv、pjv、pbj、pgex、vsv、pbr322、pcmv-ha、pen、yac、bac、λ噬菌體、m13噬菌體、噬菌粒、pcas9、pcen6、pyes1l、p3hprt1、pfn2a、pbc、ptz、pgem、pgemk、pex、psar、pcep、黏性質(zhì)粒、pbluescript、pkjk、pfloxin、pcp、phr、puc、pmal、palter、pbad、pcal、pl、pet、pgemex、pci、pcmv、pegfp、pegft、psv2、pfuse、pvitro、pvivo、pmono、pselect、puno、pduo、psg5l、pbabe、pwpxl、pbi、p15tv-l、ppro18、ptd、prs420、plexa、pact2.2、prs403、prs404、prs405、prs406、prs413、prs414、prs415、prs416、或其組合。

50、在另一優(yōu)選例中，所述受體細胞包括原核細胞或真核細胞。

51、在另一優(yōu)選例中，所述原核細胞選自下組：大腸桿菌、乳酸菌、枯草桿菌、藍細菌、鏈霉菌(streptomyces)、假單胞菌、丙酸桿菌屬(propionibacterium)、梳狀菌屬(pectinatus?sp.)、擬桿菌屬(bacteroides?sp.)、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、鏈霉菌屬(streptomyces)、魚腥藻屬(anabaena)、節(jié)桿菌屬(arthrobacter)、農(nóng)桿菌屬(agrobacterium)、醋桿菌屬(acetobacter)、醋酸桿菌屬(acetobacterium)、芽孢桿菌屬(bacillus)、短芽孢桿菌屬(brevibacillus)、雙歧桿菌屬(bifidobacterium)、短狀桿菌屬(brachybacterium)、短桿菌屬(brevibacterium)、肉桿菌屬(carnobacterium)、致病桿菌屬(xenorhabdus)、發(fā)光桿菌屬(photorhabdus)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)、腸桿菌屬(enterobacter)、巴氏桿菌屬(pasteurella)、乳桿菌屬(lactobacillus)、產(chǎn)堿桿菌屬(alcaligenes)、黃桿菌屬(flavobacterium?spp.)、梭菌屬(clostridium)、巴斯德氏芽菌屬(pasteuria)、埃希氏菌屬(escherichia)、葡糖酸醋酸桿菌屬(gluconacetobacter)、葡糖桿菌屬(gluconobacter)、哈夫尼菌屬(hafnia)、嗜鹽單胞菌屬(halomonas)、克雷伯氏菌屬(klebsiella)、考克氏菌屬(kocuria)、明串珠菌屬(leucononstoc)、巨大球菌屬(macrococcus)、甲基單胞菌屬(methylomonas)、甲基細菌屬(methylobacter)、甲基細胞菌屬(methylocella)、甲基球菌屬(methylococcus)、微桿菌屬(microbacterium)、微球菌屬(micrococcus)、微囊菌屬(microcystis)、穆爾氏菌屬(moorella)、酒球菌屬(oenococcus)、片球菌屬(pediococcus)、原綠球藻屬(prochlorococcus)、丙酸桿菌屬(propionibacterium)、變形桿菌屬(proteus)、假交替單胞菌屬(pseudoalteromonas)、假單胞菌屬(pseudomonas)、嗜冷菌屬(psychrobacter)、紅細菌屬(rhodobacter)、紅球菌屬(rhodococcus)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonas)、歐文氏菌屬(erwinia)、志賀氏菌屬(shigella)、沙雷氏菌屬(serratia)、沙門氏菌屬(salmonella)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、鏈霉菌屬(streptomyces)、根瘤菌屬(rhizobium)、聚球藻菌屬(synechococcus)、集胞藻屬(synechocystis)、四聯(lián)球菌屬(tetragenococcus)、魏斯氏菌屬(weissella)、黃單胞菌屬(xanthomonas)、發(fā)酵單胞菌屬(zymomonas)、紅假單胞菌屬(rhodopseudomonas)、以及鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimuium)、嗜甲基菌屬(methylophilius)、固氮菌屬(azotobacter)、劍菌屬(ensifer)、鞘脂單胞菌屬、伯克氏菌屬、candidatus?glomeribacter、戴氏菌屬、草螺菌屬、慢生根瘤菌屬、貪噬菌屬、鞘氨醇桿菌屬(sphingobacterium)、單胞發(fā)酵菌屬、沙雷菌屬、氣單孢菌屬、弧菌屬、脫硫弧菌屬、螺旋菌屬、醋菌屬、或其組合。

52、在另一優(yōu)選例中，所述原核細胞選自下組：大腸桿菌(escherichia?coli.)、類球紅細菌(rodhobacter?sphaeroides)、游海假交替單胞菌(pseudoalteromonashaloplanktis)、希瓦氏菌屬(shewanella?sp.)菌株ac10、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、惡臭假單胞菌(pseudomonas?putida)、銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa)、產(chǎn)堿假單胞菌(p.alcaligenes)、銅綠假單胞菌pao1-lac、惡臭假單胞菌kt2440、伸長鹽單胞菌(halomonas?elongata)、檸檬假交替單胞菌(pseudoalteromonascitrea)、需鹽色鹽桿菌(chromohalobacter?salex’igens)、變鉛青鏈霉菌(streptomyceslividans)、灰色鏈霉菌(streptomyces?griseus)、天藍鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、除蟲鏈霉菌(s.avermitilis)、灰色鏈霉菌(s.griseus)、瘡痂鏈霉菌(s.scabies)、淺青紫鏈霉菌(s.lividans)tk24、淺青紫鏈霉菌1326、耐內(nèi)酰胺諾卡氏菌(nocardia?lactamdurans)、恥垢分枝桿菌(mycobacterium?smegmatis)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)、產(chǎn)氨棒狀桿菌(corynebacterium?ammoniagenes)、乳糖發(fā)酵短桿菌(brevibacteriumlactofermentum)、煙草節(jié)桿菌(arthrobacter?nicotianae)、紋膜醋酸桿菌(acetobacter?aceti)、阿氏節(jié)桿菌(arthrobacter?arilaitensis)、蠟樣芽孢桿菌(bacillus?cereus)、凝結(jié)芽孢桿菌(bacillus?coagulans)、球形芽孢桿菌(bacillus?sphaericus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillus?stearothermophilus)、枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、短芽孢桿菌(bacillus?brevis)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、地衣芽孢桿菌(bacillus?licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)、乳酸乳球菌(lactococcus?lactis)、植物乳桿菌(lactobacillusplantarum)、干酪乳桿菌(lactobacillus?casei)、羅伊氏乳桿菌(lactobacillusreuteri)、加氏乳桿菌(lactobacillus?gasseri)、酸面乳桿菌(lactobacillusacidifarinae)、山梨乳桿菌(lactobacillusyamanashiensis)、詹氏乳桿菌(lactobacillusjensenii)、沙克乳桿菌(lactobacillus?sakei)、氧化葡糖桿菌(gluconobacter?oxydans)、青春雙歧桿菌(bifidobacterium?adolescentis)、奶酪發(fā)酵小短桿菌(brachybacteriumtyrofermentans)、擴展短桿菌(brevibacterium?linens)、廣布肉毒桿菌(carnobacteriumdivergens)、微黃棒狀桿菌(corynebacterium?flavescens)、歐洲葡糖酸醋酸桿菌(gluconacetobacter?europaeus)、約氏葡糖酸醋酸桿菌(gluconacetobacter?johannae)、氧化葡糖桿菌(gluconobacter?oxydans)、產(chǎn)酸克氏桿菌(klebsiella?oxytoca)、產(chǎn)琥珀酸放線桿菌(actinobacillus?succinogenes)、產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌(mannhei?succiniciproducers)mbel?55e、嗜淀粉擬桿菌(bacteroidesamylophilus)、小葉微桿菌(microbacterium?foliorum)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(propionibacterium?acidipropionici)、普通變形桿菌(proteus?vulgaris)、速生嗜冷桿菌(psychrobacter?celer)、比菲德氏/短/長雙歧桿菌(bifidobacterium?bifidum/breve/longum)、蜂房哈夫尼菌(hafnia?alvei)、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌(anaerobiospirillumsucciniciproducens)、生黃瘤胃球菌(ruminococcus?flavefaciens)、棲瘤胃普雷沃氏菌(prevotella?ruminicola)、溶淀粉琥珀酸單胞菌(succcinimonas?amylolytica)、溶糊精琥珀酸弧菌(succinivibrio?dextrinisolvens)、產(chǎn)琥珀酸沃林氏菌(wolinellasuccinogenes)、產(chǎn)琥珀酸噬纖維菌(cytophaga?succinicans)、菜豆根瘤菌(rhizobium?etli)、運動單胞發(fā)酵菌(zymomonas?mobilis)、丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)、楊氏/醋酸/丙酮丁醇/拜氏/丁酸梭菌(clostridium?ljungdahlii/aceticum/acetobutylicum/beijerinckii/butyricum)、屎腸球菌(enterococcusfaecium)、里拉微球菌(micrococcuslylae)、酒類酒球菌(oenococcus?oeni)、溶酪大球菌(macrococcus?caseolyticus)、乳酸片球菌(pediococcus?acidilactici)、香料葡萄球菌(staphylococcus?condimenti)、嗜熱鏈球菌(streptococcus?thermophilus)、嗜鹽四聯(lián)球菌(tetragenococcus?halophilus)、嗜根考克氏菌(kocuriarhizophila)、檸檬明串珠菌(leuconostoc?citreum)、食竇魏斯氏菌(weissella?cibaria)、高麗魏斯氏菌(weissellakoreensis)、嗜熱纖維/熱乙酸穆爾氏菌(moorellathemocellum/thermoacetica)、蘇云金芽孢桿菌(bacillus?thuringiensis)、或其組合。

53、在另一優(yōu)選例中，所述大腸桿菌選自下組：bl21、bl21(de3)、w3110、mg1655、rb791、rv308、hms?174、hms174(de3)、nm533、xl1-blue、c600、dh1、hb101、jm109、top10、dh5α、dh10β、tg1、bw23473、bw23474、mw003、mw005細胞或其組合；所述巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)選自下組：qmb1551、pv361、dsm319、或其組合。

54、在另一優(yōu)選例中，所述真核細胞選自下組：酵母、真菌、植物細胞、動物細胞、或其組合。

55、在另一優(yōu)選例中，所述酵母選自以下種：紅酵母屬(rhodotorula?spp.)、短梗霉屬物(aureobasidium?spp.)、酵母屬(saccharomyces?spp.)、擲孢酵母屬物種(sporobolomyces?spp.)、或其組合。

56、在另一優(yōu)選例中，所述酵母選自下組：釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces?pombe)、乳酸克魯維酵母(kluyveromyces?lactis)、脆壁克魯維酵母(atcc?12,424)、保加利亞克魯維酵母(atcc?16,045)、魏氏克魯維酵母(atcc24,178)、克魯雄酵母(atcc?56,500)、瓦爾提魯維酵母(k.waltii)(atcc?56500)、果蠅克魯維酵母(atcc?36,906)、耐熱克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母(kluyveromyces?marxianus)、巴斯德畢赤酵母(pichia?pastoris)、甲醇畢赤酵母(p.methanolica)、樹干畢赤酵母(p.stipitis)、解脂耶羅維亞酵母(yarrowia?lipolytica)、假絲酵母、許旺酵母(schwanniomyces?occidentalis)、多形漢遜酵母(hansenulapolymorpha)、卡爾酵母、糖化酶母、道格拉氏酵母、克魯弗酵母、諾地酵母、卵形酵母、或其組合。

57、在另一優(yōu)選例中，所述真菌是絲狀真菌，所述絲狀真菌選自下組：枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬(aureobasidium)、煙管霉屬(bjerkandera)、擬蠟菌屬(ceriporiopsis)、金孢子菌屬(chrysosporium)、鬼傘菌屬(coprinus)、革蓋菌屬(coriolus)、隱球菌屬(cryptococcus)、線黑粉菌屬(filibasidium)、鐮孢屬(fusarium)、腐質(zhì)霉屬(humicola)、梨孢菌屬、大角間座殼屬(magnaporthe)、毛霉屬(mucor)、毀絲霉屬(myceliophthora)、新美鞭菌屬(neocallimastix)、鏈孢菌屬(neurospora)、擬青霉屬(paecilomyces)、青霉屬、平革菌屬(phanerochaete)、射脈菌屬(phlebia)、瘤胃壺菌屬(piromyces)、側(cè)耳屬(pleurotus)、裂褶菌屬(schizophyllum)、踝節(jié)菌屬(talaromyces)、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬(thermoascus)、梭孢殼菌屬(thielavia)、彎頸霉屬(tolypocladium)、栓菌屬(trametes)、木霉屬、鐮刀霉屬、腐殖菌屬、鏈孢霉屬、柱霉屬(scytalidium)、肉座菌屬(hypocrea)、金孢霉屬、黑粉酵母屬(filibasidium)、赤霉菌屬(gibberella)、梨孢菌屬(magnaporthe)、毛霉屬(mucor)、毀絲霉屬、漆斑菌屬(myrothecium)、新考瑪脂霉屬(neocallimastix)或其組合。

58、在另一優(yōu)選例中，所述真菌選自下組：土曲霉(aspergillus?terreus)、米曲霉(a.oryzae)、黑曲霉(aspergillus?niger)、泡盛曲霉(a.awamori)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、煙曲霉(aspergillusfumigatus)、棘孢曲霉(aspergillusaculeatus)、棒狀曲霉(aspergillusclavatus)、黃曲霉(aspergillusflavus)、臭曲霉(aspergillusfoetidus)、日本曲霉(aspergillusjaponicus)、米曲霉、少根根霉菌(rhizopus?arrhizus)、米根霉菌(rhizobus?oryzae)、里氏木霉(trichoderma?reesei)、里氏木霉qm9414、里氏木霉rut-c30、里氏木霉qm6a、深綠木霉(t.atroviride)、哈茨木霉(t.harzianum)、粘綠木霉(t.virens)、棘孢木霉(t.asperellum)、長枝木霉(t.longibrachiatum)、康氏木霉(trichoderma?koningii)、長梗木霉(trichodermalongibrachiatum)、深綠木霉(trichodermaatroviride)、綠木霉(trichoderma?virens)、綠色木霉(trichodermaviride)、宛氏擬青霉(paecilomycesvarioti)、葡萄酒青霉(penicillium?viniferum)、產(chǎn)紫青霉(p.purpurogenum)、繩狀青霉(p.funiculosum)、埃默森青霉(籃狀菌)(penicillium(talaromyces)emersonii)、沙門柏干酪青霉(p.camemberti)、婁地青霉(p.roqueforti)、黃孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、棉阿舒囊霉(ashbya?gossypii)、雪白絲衣霉(byssochlamys?nivea)、黑煙管菌(bjerkandera?adusta)、干擬蠟菌(ceriporiopsis?aneirina)、卡內(nèi)基擬蠟菌(ceriporiopsis?caregiea)、淺黃擬蠟菌(ceriporiopsis?gilvescens)、潘諾希塔擬蠟菌(ceriporiopsis?pannocinta)、環(huán)帶擬蠟菌(ceriporiopsis?rivulosa)、微紅擬蠟菌(ceriporiopsis?subrufa)、蟲擬蠟菌(ceriporiopsis?subvermispora)、盧克諾文思金孢子菌(chrysosporium?lucknowense)、狹邊金孢子菌(chrysosporium?inops)、嗜角質(zhì)金孢子菌(chrysosporium?keratinophilum)、糞狀金孢子菌(chrysosporiummerdarium)、租金孢子菌(chrysosporium?pannicola)、昆士蘭金孢子菌(chrysosporium?queenslandicum)、熱帶金孢子菌(chrysosporium?tropicum)、褐薄金孢子菌(chrysosporium?zonatum)、灰蓋鬼傘(coprinus?cinereus)、毛革蓋菌(coriolushirsutus)、桿孢狀鐮孢(fusariumbactridioides)、谷類鐮孢(fusariumcerealis)、庫威鐮孢(fusarium?crookwellense)、大刀鐮孢(fusarium?culmorum)、禾谷鐮孢(fusarium?graminearum)、禾赤鐮孢(fusariumgraminum)、異孢鐮孢(fusarium?heterosporum)、合歡木鐮孢(fusarium?negundi)、尖孢鐮孢(fusarium?oxysporum)、多枝鐮孢(fusarium?reticulatum)、粉紅鐮孢(fusariumroseum)、接骨木鐮孢(fusarium?sambucinum)、膚色鐮孢(fusarium?sarcochroum)、擬分枝孢鐮孢(fusarium?sporotrichioides)、硫色鐮孢(fusarium?sulphureum)、圓鐮孢(fusarium?torulosum)、擬絲孢鐮孢(fusariumtrichothecioides)、鑲片鐮孢、特異腐質(zhì)霉、柔毛腐質(zhì)霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌(neurospora?crassa)、產(chǎn)紫青霉(penicillium?purpurogenum)、黃孢平革菌(phanerochaete?chrysosporium)、射脈菌(phlebia?radiata)、刺芹側(cè)耳(pleurotuseryngii)、土生梭孢殼霉(thielaviaterrestris)、長域毛栓菌(trametes?villosa)、變色栓菌(trametes?versicolor)、或其組合。

59、在另一優(yōu)選例中，所述植物細胞是雙子葉植物細胞或單子葉植物細胞。

60、在另一優(yōu)選例中，所述雙子葉植物細胞選自下組：大豆細胞、向日葵細胞、番茄細胞、蕓苔屬作物細胞、棉花細胞、甜菜細胞、煙草細胞、馬鈴薯細胞、矮牽牛、擬南芥或其組合。所述單子葉植物細胞選自下組：大麥細胞、玉蜀黍細胞、玉米細胞、燕麥細胞、稻細胞、高粱細胞、甘蔗細胞、小麥細胞、或其組合。

61、在另一優(yōu)選例中，所述動物細胞是昆蟲細胞或哺乳動物細胞。

62、在另一優(yōu)選例中，所述昆蟲細胞選自下組：苜蓿銀紋夜蛾(autographacalifornica)(苜蓿環(huán)紋夜蛾(alfalfa?looper))，草地貪夜蛾(spodoptera?frugiperda)(草地夜蛾(fall?army?worm))，甜菜夜蛾(spodoptera?exigua)(甜菜夜蛾(beetarmyworm))，粉紋夜蛾(trichoplusia?ni)(粉紋夜蛾(cabbagelooper))，舞毒蛾(lymantria?dispar)(舞毒蛾(gypsy?moth))，家蠶(bombyx?mori)(桑蠶(silkworm))，黎豆夜蛾(anticarsia?gemmatalis)(黎豆毛蟲(velvetbeancaterpillar))，煙芽夜蛾(heliothis?virescens)(煙草夜蛾(tobacco?budworm))，heliothis?subflexa(subflexusstraw?moth)，甘藍夜蛾(mamestra?brassicae)(甘藍夜蛾(cabbage?moth))，棉鈴蟲(helicoverpa?armigera)(棉鈴蟲(cotton?bollworm))，玉米穗蟲(helicoverpa?zea)(玉米穗蟲(corn?earworm))，球菜夜蛾(agrotis?ipsilon)(黑地老虎(black?cutworm))，芹菜夜蛾(anagrapha?falcifera)(芹菜夜蛾(celery?looper))，大蠟螟(galleriamellonella)(蜂窩蛾(honeycomb?moth))，rachiplusia?ou(graylooper)，小菜蛾(plutella?xylostella)(小菜蛾(diamondback?moth))，黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)(果蠅)，埃及伊蚊(aedes?aegypti)(蚊子)，或其組合。

63、在另一優(yōu)選例中，所述昆蟲細胞選自下組：來自草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)的sf9細胞，來自草地貪夜蛾(spodoptera?frugiperda)的sf21細胞，來自粉紋夜蛾(trichoplusiani)的high-five細胞(與hi5相同，與high-five?bti-tn-5b1-4相同)，來自粉紋夜蛾(trichoplusiani)的tn-368細胞，來自甜菜夜蛾(spondoptera?exigua)的se301細胞，來自黑腹果蠅(drosophila?melanogaster)的s2細胞，來自家蠶的bm5細胞，來自舞毒蛾的ld652y，來自舞毒蛾的ldeita，或其組合。

64、在另一優(yōu)選例中，所述哺乳動物細胞選自下組：sv40轉(zhuǎn)化的猴腎細胞cv1系(cos-7，atcc?crl1651)；人胚胎腎細胞系(hek293或懸浮培養(yǎng)的293細胞亞克隆，graham等，j.genvirol.36:59(1977))，如expi293；幼倉鼠腎細胞(bhk，atcc?ccl?10)；幼倉鼠腎細胞(bhk)；中國倉鼠卵巢細胞/-dhfr(cho，urlaub等，proc.natl.acad.sci.usa?77:4216(1980))；小鼠睪丸支持細胞(tm4，mather，biol.reprod.23:243-251(1980))；猴腎細胞(cv1?atcc?ccl70)；非洲綠猴腎細胞(vero-76，atcc?crl-1587)；人宮頸癌細胞(hela，atcc?ccl?2)；犬腎細胞(mdck，atcc?ccl?34)；布法羅大鼠肝細胞(brl?3a，atcc?crl?1442)；人肺細胞(w138，atcc?ccl?75)；人肝細胞(hepg2，hb?8065)；小鼠乳腺瘤(mmt?060562，atcc?ccl51)；tri細胞(mather等，annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc?5細胞；fs4細胞；cho細胞；nso細胞；骨髓瘤細胞系如yb?2/0、yo、ns0、p3x63和sp2/0等；淋巴細胞(例如，y0、ns0、sp20細胞)；或其組合。

65、在另一優(yōu)選例中，所述哺乳動物細胞選自人類細胞，所述人類細胞選自下組：hela、huh7、hek293、hepg2、kato-iii、imr32、mt-2、胰腺β-細胞、角化細胞、骨髓成纖維細胞、chp212、原代神經(jīng)細胞、w12、sk-n-mc、saos-2、wi38、原代肝細胞、flc4、143tk-、dld-1、胚胎肺成纖維細胞、原代包皮成纖維細胞、saos-2骨肉瘤、mrc5、mg63細胞或其組合。

66、在另一優(yōu)選例中，在所述步驟(i)之前，將引物和所述受體細胞混合。

67、在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，將引物和受體細胞裂解產(chǎn)物混合。

68、在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，采用升溫(從室溫升到98℃)的方法對受體細胞進行裂解。

69、在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，如果受體細胞中存在載體，則會釋放出載體；如果受體細胞中不存在載體，則無法釋放出載體。

70、在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii)之前，添加核酸擴增所用的酶。

71、在另一優(yōu)選例中，核酸擴增所用的酶包括：phi29?dna?polymerase。

72、在另一優(yōu)選例中，在步驟(ii)之前，添加核酸擴增緩沖液。

73、在另一優(yōu)選例中，在所述步驟(i)中，將受體細胞裂解后，添加核酸擴增緩沖液。

74、在另一優(yōu)選例中，所述核酸擴增緩沖液包括：tris-hcl,mgcl2,(nh4)2so4,dtt。

75、在另一優(yōu)選例中，所述步驟(iii)還包括如下步驟：

76、(a)將擴增產(chǎn)物與crispr核酸檢測試劑接觸，所述crispr核酸檢測試劑包括v型cas蛋白、向?qū)na和cas蛋白反式切割報告分子；所述向?qū)na包括能夠結(jié)合所述v型ca蛋白的同向重復(fù)序列(direct?repeat，dr)和能夠靶向所述特異性基因的導(dǎo)向序列；所述cas蛋白反式切割報告分子包括單鏈核酸分子或單鏈核酸類似物分子，所述單鏈核酸分子或單鏈核酸類似物分子不與所述向?qū)na的導(dǎo)向序列雜交；

77、(b)通過檢測所述cas蛋白反式切割報告分子的信號變化情況，從而對特異性基因進行檢測，判斷受體細胞中是否含有所述特異性基因。

78、在另一優(yōu)選例中，所述檢測所述cas蛋白反式切割報告分子的信號變化情況是檢測所述cas蛋白反式切割報告分子是否被v型cas蛋白切割。

79、在另一優(yōu)選例中，所述cas蛋白反式切割報告分子被v型cas蛋白切割，則表示所述受體細胞中含有所述特異性基因，所述受體細胞是重組子；而所述cas蛋白反式切割報告分子不被v型cas蛋白切割，則表示所述受體細胞中不含所述特異性基因，所述受體細胞是非重組子。

80、本發(fā)明第二方面提供了一種重組子篩選試劑盒，包括：

81、i)第一容器以及位于第一容器內(nèi)的crispr核酸檢測試劑，所述crispr核酸檢測試劑包括v型cas蛋白、向?qū)na和cas蛋白反式切割報告分子；所述向?qū)na包括能夠結(jié)合所述v型ca蛋白的同向重復(fù)序列(direct?repeat，dr)和能夠靶向所述特異性基因的導(dǎo)向序列；所述cas蛋白反式切割報告分子包括單鏈核酸分子或單鏈核酸類似物分子，所述單鏈核酸分子或單鏈核酸類似物分子不與所述向?qū)na的導(dǎo)向序列雜交；

82、ii)任選的第二容器以及位于第二容器內(nèi)的用于核酸擴增的試劑。

83、在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括選自下組的一種或多種容器：

84、iii)第三容器以及位于第三容器內(nèi)的受體細胞，所述受體細胞為經(jīng)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體細胞，所述載體上含有識別所述載體的特異性基因；

85、iv)第四容器以及位于第四容器內(nèi)的緩沖液。

86、在另一優(yōu)選例中，所述的第一容器、第二容器、第三容器、第四容器中的任何二個、三個、四個(或全部)可以是相同(或同一)或不同容器。

87、應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。