本發(fā)明屬于乳腺癌標(biāo)志物，具體涉及一種circegfr作為分子靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物在制備三陰性乳腺癌治療產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的最新全球數(shù)據(jù)，2020年全球約有226萬(wàn)例乳腺癌新發(fā)病例，使其成為最常被診斷出的癌癥，它是發(fā)展中國(guó)家死亡率最高的癌癥，也是婦女惡性腫瘤死亡率最高的癌癥。乳腺癌主要包括luminal?a型、luminal?b型、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human?epidermal?growth?factor?receptor?2,her2)過(guò)表達(dá)型和三陰性乳腺癌(triple-negative?breast?cancer,tnbc)。乳腺癌分類(lèi)的目的是根據(jù)潛在腫瘤分子生物學(xué)和治療敏感性的已知關(guān)聯(lián)，確定患者的最佳治療方案。乳腺癌已成為全球性的健康問(wèn)題，其中tnbc亞型約占15％～20％，具有侵襲性強(qiáng)、死亡率高和預(yù)后不良等特點(diǎn)，發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)，是一種高度異質(zhì)性的癌癥，其分子特點(diǎn)是雌激素受體(estrogenreceptor,er)，孕激素受體(progesterone?receptor,pr)和her2表達(dá)均為陰性，尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的tnbc治療方案。因此，開(kāi)發(fā)新的tnbc治療策略已成為臨床迫切需要。

2、以蒽環(huán)類(lèi)藥物為基礎(chǔ)的新輔助化療目前仍然是tnbc的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物之一。吡柔比星(pirarubicin,thp,又稱(chēng)吡喃阿霉素)屬于蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥物，可以通過(guò)非特異性嵌入dna雙鏈堿基之間，形成相對(duì)穩(wěn)定的蒽環(huán)-dna復(fù)合物，抑制dna的復(fù)制與mrna的合成；抑制dna聚合酶及dna拓?fù)洚悩?gòu)酶ii活性，干擾dna合成；產(chǎn)生氧自由基，破壞細(xì)胞膜功能。然而，化療尚未形成特別有效的tnbc靶向治療策略，因此迫切需要尋找新的藥物干預(yù)靶點(diǎn)，為tnbc的發(fā)生、發(fā)展和治療提供新的理論依據(jù)，以指導(dǎo)個(gè)體化治療和改善癌癥患者的預(yù)后。thp在tnbc新輔助治療中應(yīng)用廣泛，但其通過(guò)干預(yù)circrnas治療tnbc的作用機(jī)制尚未明確。

3、環(huán)狀rna(circular?rna,circrna)屬于非編碼rna(non-coding?rna,ncrna)，是近些年新興的研究熱點(diǎn)。circrna是一類(lèi)不具有5’端帽子和3’端polya尾結(jié)構(gòu)，并且以共價(jià)鍵形成環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)的rna分子。circrna主要是通過(guò)反向剪接的方式產(chǎn)生，明顯不同于線(xiàn)性rna經(jīng)典的5’-3’的模式。由于circrna環(huán)狀的特殊結(jié)構(gòu)，使其具有半衰期更長(zhǎng)和更穩(wěn)定的特點(diǎn)。大量的circrnas被認(rèn)為在體液中穩(wěn)定且高水平存在，包括血漿、血清、外泌體和尿液。有研究已經(jīng)揭示了血漿外泌體circrna可以作為癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。circrna的一個(gè)重要功能是作為競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源rna(competitive?endogenous?rna,cerna)競(jìng)爭(zhēng)海綿吸附微小rna(microrna,mirna)來(lái)影響mirna靶基因的表達(dá)。目前，circrna的研究不僅集中在tnbc發(fā)生發(fā)展的機(jī)制上，還包括circrna作為tnbc診斷、治療和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

4、circegfr(circbase?id:hsa_circ_0080220)位于基因組chr7:55209978-55214433，是由其親本基因egfr外顯子2、3和4反向剪接形成，長(zhǎng)度為471bp。有研究報(bào)道circegfr可以通過(guò)mir-106a-5p/ddx5軸調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展。雖然已有研究報(bào)道circegfr在結(jié)直腸癌中發(fā)揮重要作用，但circegfr在tnbc中發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚。因此如何利用circegfr治療tnbc是亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是為了彌補(bǔ)已有技術(shù)缺陷，提供一種circegfr作為分子靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物在制備三陰性乳腺癌治療產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建circegfr的慢病毒過(guò)表達(dá)載體及慢病毒沉默載體，評(píng)估其過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)mda-mb-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和emt的影響，實(shí)現(xiàn)了利用沉默circegfr治療三陰性乳腺癌。通過(guò)rt-qpcr檢測(cè)三陰性乳腺癌患者組織及血漿外泌體中circegfr表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)circegfr具有預(yù)測(cè)患者預(yù)后的作用。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

3、一種circegfr作為分子靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物在制備三陰性乳腺癌治療產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述circegfr的circbase?id：hsa_circ_0080220。

4、優(yōu)選地，circegfr作為分子靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物在制備三陰性乳腺癌治療產(chǎn)品中的應(yīng)用包括以下步驟：

5、(1)shrna克隆于慢病毒沉默載體，獲得穩(wěn)定沉默circegfr慢病毒載體；

6、(2)將步驟(1)獲得的穩(wěn)定沉默circegfr慢病毒載體轉(zhuǎn)染mda-mb-231細(xì)胞；

7、(3)rt-qpcr檢測(cè)三陰性乳腺癌患者組織及血漿外泌體中circegfr表達(dá)量。

8、優(yōu)選地，步驟(1)中所述慢病毒沉默載體為plent-u6-gfp-puro。

9、優(yōu)選地，步驟(1)中所述shrna序列為針對(duì)circegfr的剪切位點(diǎn)設(shè)計(jì)的以下3對(duì)互補(bǔ)鏈shrna中的任意一對(duì)或者多對(duì)；

10、circegfr?shrna-1bamhi?f：5’-gatcccctgggcagcttttgccaaggc?tcgagccttggcaaaagctgcccaggttttta-3’；

11、circegfr?shrna-1mlul?r：5’-cgcgtaaaaacctgggcagcttttgccaaggctcgagccttggcaaaagctgcccaggg-3’；

12、circegfr?shrna-2bamhi?f：5’-gatcctgggcagcttttgccaaggcac?tcgagtgccttggcaaaagctgcccattttta-3’；

13、circegfr?shrna-2mlul?r：5’-cgcgtaaaaatgggcagcttttgccaaggcactcgagtgccttggcaaaagctgcccag-3’；

14、circegfr?shrna-3bamhi?f：5’-gatccgcagcttttgccaaggcacgac?tcgagtcgtgccttggcaaaagctgcttttta-3’；

15、circegfr?shrna-3mlul?r：5’-cgcgtaaaaagcagcttttgccaaggcacgactcgagtcgtgccttggcaaaagctgcg-3’。

16、優(yōu)選地，步驟(1)shrna克隆于慢病毒沉默載體的構(gòu)建步驟如下：

17、(1)shrna互補(bǔ)鏈準(zhǔn)備；

18、(2)慢病毒沉默載體雙酶切；

19、(3)酶切產(chǎn)物回收，獲得酶切后的慢病毒沉默載體；

20、(4)將目的片段shrna互補(bǔ)鏈與步驟(3)獲得的載體連接，獲得連接產(chǎn)物；

21、(5)步驟(4)獲得的連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；

22、(6)對(duì)步驟(5)獲得的轉(zhuǎn)化后的連接產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

23、優(yōu)選地，步驟(2)所述穩(wěn)定沉默circegfr慢病毒載體轉(zhuǎn)染mda-mb-231細(xì)胞的具體步驟如下：

24、a、慢病毒載體轉(zhuǎn)染mda-mb-231細(xì)胞：

25、轉(zhuǎn)染前一天對(duì)mda-mb-231細(xì)胞進(jìn)行傳代，傳入24孔板中，使其融合度為70％～80％，每孔加入慢病毒沉默載體200μl，培養(yǎng)24h后換為完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；

26、b、殺傷曲線(xiàn)的檢測(cè)：

27、(1)將步驟a獲得的mda-mb-231細(xì)胞用無(wú)雙抗無(wú)血清培養(yǎng)基制備成細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，培養(yǎng)24h；

28、(2)加入不同濃度嘌呤霉素：所述濃度分別為0μg/ml、0.2μg/ml、0.4μg/ml、0.6μg/ml、0.8μg/ml、1μg/ml、1.2μg/ml、1.4μg/ml、1.6μg/ml、1.8μg/ml、2μg/ml；

29、(3)培養(yǎng)7天，期間細(xì)胞換液一次；第7天觀(guān)察發(fā)現(xiàn)0～1μg/ml嘌呤霉素濃度的細(xì)胞存活，1～2μg/ml嘌呤霉素濃度的細(xì)胞部分死亡；

30、(4)選擇1μg/ml的嘌呤霉素濃度為穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選濃度；

31、c、穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選：

32、(1)將mda-mb-231細(xì)胞感染穩(wěn)定沉默circegfr慢病毒載體后，培養(yǎng)48h，加入含1μg/ml嘌呤霉素的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天，期間換液一次；

33、(2)顯微鏡下觀(guān)察并標(biāo)記培養(yǎng)板上單獨(dú)的細(xì)胞群；

34、(3)用胰酶消化細(xì)胞群，接種到新的24孔板中培養(yǎng)；

35、(4)繼續(xù)用嘌呤霉素亞克隆篩選7天；

36、(5)顯微鏡下觀(guān)察并挑選出正常生長(zhǎng)的細(xì)胞群傳代，用1μg/ml嘌呤霉素維持穩(wěn)定培養(yǎng)30天。

37、優(yōu)選地，circegfr的擴(kuò)增引物，其序列具體信息如下：

38、上游引物：5'-catgtcgatggacttccaga-3'；

39、下游引物：5'-aaattcccaaggaccacctc-3'。

40、一種用于過(guò)表達(dá)或沉默circegfr的物質(zhì)在制備三陰性乳腺癌治療產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述circegfr的circbase?id：hsa_circ_0080220。

41、優(yōu)選地，所述用于過(guò)表達(dá)或沉默circegfr的物質(zhì)包括circegfr的擴(kuò)增引物，其序列具體信息如下：

42、上游引物：5'-catgtcgatggacttccaga-3'；

43、下游引物：5'-aaattcccaaggaccacctc-3'。

44、優(yōu)選地，所述用于沉默circegfr的物質(zhì)還包括克隆于慢病毒沉默載體的shrna序列，所述shrna序列為針對(duì)circegfr的剪切位點(diǎn)設(shè)計(jì)的以下3對(duì)互補(bǔ)鏈shrna中的任意一對(duì)或者多對(duì)；

45、circegfr?shrna-1bamhi?f：5’-gatcccctgggcagcttttgccaaggc?tcgagccttggcaaaagctgcccaggttttta-3’；

46、circegfr?shrna-1mlul?r：5’-cgcgtaaaaacctgggcagcttttgccaaggctcgagccttggcaaaagctgcccaggg-3’；

47、circegfr?shrna-2bamhi?f：5’-gatcctgggcagcttttgccaaggcac?tcgagtgccttggcaaaagctgcccattttta-3’；

48、circegfr?shrna-2mlul?r：5’-cgcgtaaaaatgggcagcttttgccaaggcactcgagtgccttggcaaaagctgcccag-3’；

49、circegfr?shrna-3bamhi?f：5’-gatccgcagcttttgccaaggcacgac?tcgagtcgtgccttggcaaaagctgcttttta-3’；

50、circegfr?shrna-3mlul?r：5’-cgcgtaaaaagcagcttttgccaaggcacgactcgagtcgtgccttggcaaaagctgcg-3’。

51、本發(fā)明的有益效果是：

52、本發(fā)明的一種circegfr作為分子靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物在制備三陰性乳腺癌治療產(chǎn)品中的應(yīng)用，通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定沉默circegfr慢病毒載體，對(duì)mda-mb-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和emt進(jìn)行干擾，為circegfr的生物學(xué)功能提供了重要的補(bǔ)充，為三陰性乳腺癌提供了有效的治療手段，同時(shí)也為circegfr作為分子靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物在三陰性乳腺癌中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

53、本發(fā)明的一種circegfr作為分子靶點(diǎn)及預(yù)后生物標(biāo)志物在制備三陰性乳腺癌治療產(chǎn)品中的應(yīng)用，通過(guò)構(gòu)建circegfr的慢病毒過(guò)表達(dá)載體及慢病毒沉默載體，評(píng)估其過(guò)表達(dá)或沉默對(duì)mda-mb-231細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和emt的影響，實(shí)現(xiàn)了利用沉默circegfr治療三陰性乳腺癌。通過(guò)rt-qpcr檢測(cè)三陰性乳腺癌患者組織及血漿外泌體中circegfr表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)circegfr具有預(yù)測(cè)患者預(yù)后的作用。因此本發(fā)明為tnbc提供預(yù)后標(biāo)志物和有希望的治療靶點(diǎn)。