發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及逆轉(zhuǎn)錄酶。

背景技術(shù)：

1、轉(zhuǎn)錄組是指細(xì)胞或生物體在給定時間的rna轉(zhuǎn)錄物。對轉(zhuǎn)錄組的了解會揭露活躍的細(xì)胞過程并且可以提供關(guān)于細(xì)胞調(diào)節(jié)、生長和功能異常的信息。

2、轉(zhuǎn)錄組分析通常涉及微陣列技術(shù)，并且更通常地，涉及下一代測序技術(shù)(例如，rna-seq)。rna-seq的一般目標(biāo)為檢測所存在的所有各種轉(zhuǎn)錄物，包括mrna和非編碼rna，以及檢測在各種發(fā)育階段期間或在各種條件下的剪接變異體、突變、可動遺傳因子和表達(dá)水平。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和rna-seq已應(yīng)用于診斷學(xué)、疾病分析、病原體檢測、進(jìn)化生物學(xué)和其它研究領(lǐng)域。舉例來說，rna-seq可潛在地鑒別出涉及對環(huán)境壓力的抗性(如作物的抗旱性)的基因。在另一實(shí)例中，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可以提供關(guān)于抗藥性機(jī)制的信息，潛在地揭露對抗醫(yī)院獲得性抗生素抗性感染的策略。

3、通常，在rna-seq工作流程中，rna首先用于通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成標(biāo)靶rna的穩(wěn)定互補(bǔ)dna(cdna)拷貝。逆轉(zhuǎn)錄酶是用于從rna合成cdna的典型酶。與dna聚合酶不同，由于逆轉(zhuǎn)錄酶不具有矯正能力，因此逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)通常需要較高的反應(yīng)溫度。這是因?yàn)檩^高的溫度會減少脫靶引物結(jié)合。另外，較高的溫度會減少rna中的二級結(jié)構(gòu)，可能會導(dǎo)致對rt的空間位阻，從而截短轉(zhuǎn)錄物。然而，常見的市售逆轉(zhuǎn)錄酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurine?leukemia?virus；mmlv)、superscript?ii和禽成髓細(xì)胞瘤病毒(amv)，在37℃以上開始失去有效性。因此，與矯正形式的合成相比，高錯誤率使得突變以加快的速率累積。舉例來說，amv逆轉(zhuǎn)錄酶通常具有1/17,000個堿基的錯誤率，且mmlv通常具有1/30,000個堿基的錯誤率。因此，市售逆轉(zhuǎn)錄酶妨礙轉(zhuǎn)錄組的準(zhǔn)確測定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供相比于常規(guī)市售逆轉(zhuǎn)錄酶(例如superscript?ii逆轉(zhuǎn)錄酶(在本文中展示為prod-dnd，seq?id?no:2))具有提高的熱穩(wěn)定性、提高的溶解性和降低的qpcr抑制的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶。提高的熱穩(wěn)定性使得rna能在高于37℃的溫度下逆轉(zhuǎn)錄成cdna，從而降低cdna合成期間引入的錯誤率。因此，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的準(zhǔn)確性的提高。

2、本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶可以包含多肽，所述多肽包含與seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列，和至少一個在選自位置56、72、138、163、232、234、249、290、344、420、424、444和615的氨基酸位置處的氨基酸取代。

3、至少一個氨基酸取代可以選自：

4、在位置56處的s，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

5、在位置138處的g，其經(jīng)s、c、t或m取代；

6、在位置232處的s，其經(jīng)c、t或m取代；

7、在位置234處的l，其經(jīng)d、e、n、q取代；

8、在位置290處的g，其經(jīng)h、k或r取代；

9、在位置344處的y，其經(jīng)f或m取代；

10、在位置420處的t，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

11、在位置424處的g，其經(jīng)d、e、n、q取代；

12、在位置444處的v，其經(jīng)g、a、l或i取代；以及

13、在位置615處的d，其經(jīng)e、n或q取代。

14、舉例來說，至少一個氨基酸取代可以是s56a、g138s、s232t、l234e、g290k、y344f、t420v、g424d、v444i和d615e。另外，以下中的任一個為根據(jù)本發(fā)明的突變的實(shí)例：s27t、v43k、a46p、l48i、a54p、s56a、s60w、q68k、l72q/r、e123q、y133c、g138s、t163k、m177r、d200h、i212t、i218t、t231e、s232t、l234e、q237e、a242d、n249e、q265e、k264q、k267t、l272i、t281s、g290k、n335q、p338e、d339e、y344f、q345d、e346d、q349r、y376f、v413i、t420v、g424d、a442s、v433t、v444i、d518e、g524d、l528f、a554p、q562e、d583n、k550s、d615e、a619e、f625w/h、r629k、h642d和k658e。

15、本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)一步包含至少一個在選自位置524、583和562的氨基酸位置處的額外氨基酸取代。額外氨基酸取代可以選自：

16、在位置524處的d，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

17、在位置583處的d，其經(jīng)e、n或q取代；以及

18、在位置562處的e，其經(jīng)d、n或q取代。

19、舉例來說，至少一個額外氨基酸取代可以選自d524g、d583n和e562q。

20、在一些實(shí)施方式中，逆轉(zhuǎn)錄酶包含任何數(shù)目的選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583和562處的取代。舉例來說，逆轉(zhuǎn)錄酶可在至少3個選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583和562的氨基酸位置處包含取代。逆轉(zhuǎn)錄酶可在至少5個選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583和562的氨基酸位置處包含取代。逆轉(zhuǎn)錄酶可在至少10個選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583和562的氨基酸位置處包含取代。逆轉(zhuǎn)錄酶可在12個選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583、562的氨基酸位置處包含取代。

21、在本發(fā)明的各方面中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶包含多肽，所述多肽包含與seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列，和至少一個在選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615和642的氨基酸位置處的氨基酸取代。

22、至少一個氨基酸取代選自：

23、在位置56處的s，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

24、在位置138處的g，其經(jīng)s、c、t或m取代；

25、在位置232處的s，其經(jīng)c、t或m取代；

26、在位置234處的l，其經(jīng)d、e、n或q取代；

27、在位置290處的g，其經(jīng)h、k或r取代；

28、在位置344處的y，其經(jīng)f或m取代；

29、在位置420處的t，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

30、在位置424處的g，其經(jīng)d、e、n或q取代；

31、在位置444處的v，其經(jīng)g、a、l或i取代；

32、在位置615處的d，其經(jīng)e、n或q取代；以及

33、在位置642處的h，其經(jīng)d、e、n或q取代。

34、舉例來說，至少一個氨基酸取代可以選自s56a、g138s、s232t、l234e、g290k、y344f、t420v、g424d、v444i、d615e和h642d。

35、逆轉(zhuǎn)錄酶可進(jìn)一步包含至少一個在選自位置524、583、562、204和306的氨基酸位置處的額外氨基酸取代。

36、至少一個額外氨基酸取代可以選自：

37、在位置524處的d，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

38、在位置583處的d，其經(jīng)e、n或q取代；

39、在位置562處的e，其經(jīng)d、n或q取代；

40、在位置204處的h，其經(jīng)k或r取代；以及

41、在位置306處的t，其經(jīng)h、k或r取代。

42、舉例來說，額外氨基酸取代可以是g524d、n583d、q562e、r204h或k306t。

43、本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶相對于野生型逆轉(zhuǎn)錄酶以及常見市售逆轉(zhuǎn)錄酶(如superscript?ii(seq?id?no:2))兩者展現(xiàn)提高的熱穩(wěn)定性。舉例來說，在50℃下本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶具有在42℃下野生型逆轉(zhuǎn)錄酶或seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的至少約50％。然而，取決于突變的數(shù)目和條件，在50℃或更高下，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的活性可以甚至超過42℃下的野生型逆轉(zhuǎn)錄酶或seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的約90％。舉例來說，當(dāng)存在10個或更多個突變時，逆轉(zhuǎn)錄活性超過在42℃下seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的80％。

44、此外，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的活性在甚至更高溫度(例如65℃)下超過例如seq?idno:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶的生理活性。舉例來說，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶在約65℃或更高的溫度下展示在42℃下seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的至少50％。相比之下，在高于約50℃的溫度下，野生型轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性或seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶活性將顯著受到抑制，且在接近約65℃的溫度下幾乎無活性。然而，同樣，取決于突變的數(shù)目和條件，在約65℃或更高下，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性甚至可以超過在42℃下的seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶或野生型逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的80％。舉例來說，當(dāng)存在10個或更多個突變時，逆轉(zhuǎn)錄活性可以超過在42℃下野生型逆轉(zhuǎn)錄酶或seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的70％。

45、在抑制劑存在的情況下，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶相比于常規(guī)市售逆轉(zhuǎn)錄酶(包括野生型逆轉(zhuǎn)錄酶)具有提高的活性。在多種樣品中發(fā)現(xiàn)使野生型和市售逆轉(zhuǎn)錄酶的效率變低的各種抑制劑。舉例來說，植物樣品通常含有抑制逆轉(zhuǎn)錄的多糖、酚類物質(zhì)和類黃酮。樣品制備步驟也經(jīng)常引入逆轉(zhuǎn)錄抑制劑，例如清潔劑、醇、鹽、肝素和血色素。

46、本發(fā)明進(jìn)一步提供使用本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶從rna逆轉(zhuǎn)錄cdna的方法。

47、本發(fā)明的優(yōu)選方法包括以下步驟：向包含rna的樣品提供逆轉(zhuǎn)錄酶和用于逆轉(zhuǎn)錄的試劑，所述逆轉(zhuǎn)錄酶包含多肽，所述多肽包含與seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列，和至少一個在選自位置56、138、234、290、344、420、424、444和615的氨基酸位置處的氨基酸取代。所述方法進(jìn)一步包括在逆轉(zhuǎn)錄酶與樣品中的rna之間進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以形成cdna的步驟。

48、至少一個氨基酸取代可以選自：

49、在位置56處的s，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

50、在位置138處的g，其經(jīng)s、c、t或m取代；

51、在位置232處的s，其經(jīng)c、t或m取代；

52、在位置234處的l，其經(jīng)d、e、n、q取代；

53、在位置290處的g，其經(jīng)h、k或r取代；

54、在位置344處的y，其經(jīng)f或m取代；

55、在位置420處的t，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

56、在位置424處的g，其經(jīng)d、e、n或q取代；

57、在位置444處的v，其經(jīng)g、a、l或i取代；以及

58、在位置615處的d，其經(jīng)e、n或q取代。

59、舉例來說，至少一個氨基酸取代可以是s56a、g138s、s232t、l234e、g290k、y344f、t420v、g424d、v444i和d615。

60、逆轉(zhuǎn)錄酶可進(jìn)一步包含至少一個在選自位置524、583和562的氨基酸位置處的額外氨基酸取代。至少一個額外氨基酸取代可以選自：在位置524處的d，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；在位置583處的d，其經(jīng)e、n或q取代；以及在位置562處的e，其經(jīng)d、n或q取代。

61、在一個實(shí)例中，額外氨基酸取代選自g524d、n583d和q562e。

62、逆轉(zhuǎn)錄酶可包含任何數(shù)目的選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583和562處的取代。舉例來說，逆轉(zhuǎn)錄酶可在至少3個選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583和562的氨基酸位置處包含取代。逆轉(zhuǎn)錄酶可在至少5個選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583和562的氨基酸位置處包含取代。逆轉(zhuǎn)錄酶可在至少10個選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583和562的氨基酸位置處包含取代。逆轉(zhuǎn)錄酶可在13個選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、524、583、562的氨基酸位置處包含取代。

63、在本發(fā)明的各方面中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶包含與seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少約95％序列同一性的氨基酸序列，和至少一個在選自位置56、138、234、290、344、420、424、444、615、444、615和642的氨基酸位置處的氨基酸取代。

64、至少一個氨基酸取代選自：

65、在位置56處的s，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

66、在位置138處的g，其經(jīng)s、c、t或m取代；

67、在位置232處的s，其經(jīng)c、t或m取代；

68、在位置234處的l，其經(jīng)d、e、n或q取代；

69、在位置290處的g，其經(jīng)h、k或r取代；

70、在位置344處的y，其經(jīng)f或m取代；

71、在位置420處的t，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

72、在位置424處的g，其經(jīng)d、e、n或q取代；

73、在位置444處的v，其經(jīng)g、a、l或i取代；

74、在位置615處的d，其經(jīng)e、n或q取代；以及

75、在位置642處的h，其經(jīng)d、e、n或q取代。

76、舉例來說，氨基酸取代可以選自s56a、g138s、s232t、l234e、g290k、y344f、t420v、g424d、v444i、d615e和h642d。

77、逆轉(zhuǎn)錄酶可進(jìn)一步包含至少一個在選自位置524、583、562、204和306的氨基酸位置處的額外氨基酸取代。

78、額外氨基酸取代還可以選自：

79、在位置524處的d，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

80、在位置583處的d，其經(jīng)e、n或q取代；

81、在位置562處的e，其經(jīng)d、n或q取代；

82、在位置204處的h，其經(jīng)k或r取代；以及

83、在位置306處的t，其經(jīng)h、k或r取代。

84、在一個替代方案中，額外氨基酸取代選自g524d、n583d、q562e、r204h和k306t。

85、本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的使用實(shí)現(xiàn)在50℃或更高的溫度下發(fā)生反應(yīng)而不會像常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄酶那樣損失酶活性。因此，操作步驟可以在約65℃或更高的溫度下進(jìn)行，活性為在42℃下seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶的活性的至少約50％。歸因于本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的提高的熱穩(wěn)定性，提高的反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)cdna合成中的高度逆轉(zhuǎn)錄酶活性以及減少的核苷酸堿基添加錯誤。此外，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)可使得培育時間減少，例如與需要50分鐘的典型方法相比，培育時間可為約5、10、15、20或30分鐘。

86、本發(fā)明的各方面提供經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶，其包含至少一個seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶的至少一個結(jié)構(gòu)域中的突變。重要的是，本發(fā)明的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶相對于野生型逆轉(zhuǎn)錄酶或seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶展現(xiàn)提高的熱穩(wěn)定性，使得逆轉(zhuǎn)錄酶在約50℃或更高的溫度下的活性為seq?id?no:2的轉(zhuǎn)錄酶在42℃下的活性的至少約90％。

87、優(yōu)選突變包括seq?id?no:2的掌型結(jié)構(gòu)域(palm?domain)中的位置27、138、200、204、212、218、231、232、234、237、242、249、264、265、267和/或272處的氨基酸取代。此外，本發(fā)明考慮以下處的突變：seq?id?no:2的指型結(jié)構(gòu)域(finger?domain)中的位置43、46、48、54、56、72、163和/或177；拇指型結(jié)構(gòu)域(thumb?domain)中的位置280、281、290、306、335、338、339、344、345、346和/或349；連接結(jié)構(gòu)域中的位置376、413、420、424、443和/或444，和/或seq?id?no:2的rna酶h結(jié)構(gòu)域中的位置518、524、528、550、554、562、583、615、619、625、629、642和/或658。

88、下文為用于本發(fā)明的優(yōu)選取代突變的列表：

89、在位置56處的s，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

90、在位置72處的l，其經(jīng)q或r取代；

91、在位置138處的g，其經(jīng)s、c、t或m取代；

92、在位置204處的h，其經(jīng)k或r取代；

93、在位置232處的s，其經(jīng)c、t或m取代；

94、在位置234處的l，其經(jīng)d、e、n、q取代；

95、在位置290處的g，其經(jīng)h、k或r取代；

96、在位置306處的t，其經(jīng)h、k或r取代；

97、在位置344處的y，其經(jīng)f或m取代；

98、在位置420處的t，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

99、在位置424處的g，其經(jīng)d、e、n或q取代；

100、在位置444處的v，其經(jīng)g、a、l或i取代；

101、在位置524處的d，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

102、在位置562處的e，其經(jīng)d、n或q取代；

103、在位置583處的d，其經(jīng)e、n或q取代；

104、在位置615處的d，其經(jīng)e、n或q取代；以及

105、在位置642處的h，其經(jīng)d、e、n或q取代。

106、本發(fā)明的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在1到14個選自位置56、72、138、204、232、234、290、306、344、420、424、444、524、562、583、615和642的氨基酸位置處具有取代。

107、此外，優(yōu)選氨基酸取代包括s56a、g138s、s232t、l234e、g290k、y344f、t420v、g424d、v444i和/或d615e。除前述以外，可添加選自g524d、n583d和q562e的額外氨基酸取代。在其它實(shí)施方式中，氨基酸取代選自l72q、t163k、n249e和h642d。在另外其它實(shí)施方式中，氨基酸取代選自s56a、g138s、s232t、l234e、g290k、y344f、t420v、g424d、v444i、d615e和h642d。所述實(shí)施方式還可以包括至少一個選自d524g、d583n、e562q、h204r和t306k的額外氨基酸取代。

108、在具體實(shí)施方式中，氨基酸取代選自關(guān)于seq?id?no:2的s27t、v43k、a46p、l48i、a54p、s56a、l72q、g138s、t163k、m177r、d200h、i212t、i218t、t231e、s232t、l234e、q237e、a242d、n249e、q265e、k264q、k267t、l272i、t281s、g290k、n335q、p338e、d339e、y344f、q345d、e346d、q349r、y376f、v413i、t420v、g424d、a442s、v433t、v444i、d518e、g524d、l528f、a554p、e562q、d583n、k550s、d615e、a619e、f625w/h、r629k、h642d和k658e。

109、在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶在約65℃或更高的溫度下展現(xiàn)的酶活性等效于seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶在約42℃下的逆轉(zhuǎn)錄活性的至少約50％。本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的活性在抑制劑存在的情況下提高。另外，本發(fā)明的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶相對于seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶展現(xiàn)提高的熱穩(wěn)定性，并且可以包含至少一個選自由以下組成的組的氨基酸取代：e5k；m39v或m39l；i49v或i49t；m66l；q91r或q91l；p130s；l139p；i179t或i179v；d200n、d200a或d200g；q221r；q237r；t287a；a307v；t330p；l333q；y344h；a502v；d524a；l528i；h594r、h594k或h594q；l603w或l603m；e607k、e607g或e607a；h634y；a644v或a644t；n649s；d653g、d653a、d653h或d653v；k658r或k658q；和l671p。

110、具體來說，在抑制劑存在的情況下，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的活性相對于seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶提高，并且可以包含至少一個選自由以下組成的組的氨基酸取代：m39v或m39l；i49v或i49t；m66l；q91r或q91l；p130s；l139p；i179t或i179v；d200n、d200a或d200g；q221r；q237r；t287a；a307v；t330p；l333q；y344h；a502v；d524a；l528i；h594r、h594k或h594q；l603w或l603m；e607k、e607g或e607a；h634y；a644v或a644t；n649s；d653g、d653a、d653h或d653v；k658r或k658q；和l671p。

111、在其它實(shí)施方式中，在福爾馬林固定的樣品中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶相對于seq?idno:2的逆轉(zhuǎn)錄酶展現(xiàn)提高的活性，并且可以包含至少一個選自由以下組成的組的氨基酸取代：m39v或m39l；i49v或i49t；m66l；q91r或q91l；p130s；l139p；i179t或i179v；d200n、d200a或d200g；q221r；q237r；t287a；a307v；t330p；l333q；y344h；a502v；d524a；l528i；h594r、h594k或h594q；l603w或l603m；e607k、e607g或e607a；h634y；a644v或a644t；n649s；d653g、d653a、d653h或d653v；k658r或k658q；和l671p。

112、在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶相對于seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶展現(xiàn)提高的熱穩(wěn)定性，并且可以包含至少一個選自由以下組成的組的氨基酸取代：a32v、e286r、e302k、w388r和l435r。

113、在抑制劑存在的情況下，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的活性相對于seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶也得到提高，并且可以包含至少一個選自由以下組成的組的氨基酸取代：a32v、e286r、e302k、w388r和l435r。同樣地，在福爾馬林固定的樣品中，本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性相對于seq?id?no:2的逆轉(zhuǎn)錄酶提高，并且可以包含至少一個選自由以下組成的組的氨基酸取代：a32v、e286r、e302k、w388r和l435r。

114、在某些實(shí)施方式中，相對于seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶，本發(fā)明的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶具有至少約95％序列同一性。

115、本發(fā)明的各方面包括從rna逆轉(zhuǎn)錄cdna的方法。所述方法包括利用如本文所提供的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶。所述經(jīng)修飾的酶相對于現(xiàn)有逆轉(zhuǎn)錄酶展現(xiàn)提高的熱穩(wěn)定性，使得其在約50℃或更高的溫度下的活性為在42℃下的常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄活性的至少約90％，并且向樣品提供逆轉(zhuǎn)錄試劑，并且在逆轉(zhuǎn)錄酶與樣品中的rna之間進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在50℃或更高的溫度下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以形成cdna。

116、本發(fā)明的經(jīng)修飾的酶在選自以下的位置處包含至少一個氨基酸取代：seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶的掌型結(jié)構(gòu)域中的位置27、138、200、204、212、218、231、232、234、237、242、249、264、265、267和272，seq?id?no:2的指型結(jié)構(gòu)域中的位置43、46、48、54、56、72、163和177，seq?id?no:2的拇指型結(jié)構(gòu)域中的位置280、281、290、306、335、338、339、344、345、346和349，seq?id?no:2的連接結(jié)構(gòu)域中的位置376、413、420、424、443和444，和seq?id?no:2中所示的逆轉(zhuǎn)錄酶的rna酶h結(jié)構(gòu)域中的位置518、524、528、550、554、562、583、615、619、625、629、642和658。

117、舉例來說，氨基酸取代可以選自：

118、在位置56處的s，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

119、在位置72處的l，其經(jīng)q或r取代；

120、在位置138處的g，其經(jīng)s、c、t或m取代；

121、在位置204處的h，其經(jīng)k或r取代；

122、在位置232處的s，其經(jīng)c、t或m取代；

123、在位置234處的l，其經(jīng)d、e、n、q取代；

124、在位置290處的g，其經(jīng)h、k或r取代；

125、在位置306處的t，其經(jīng)h、k或r取代；

126、在位置344處的y，其經(jīng)f或m取代；

127、在位置420處的t，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

128、在位置424處的g，其經(jīng)d、e、n或q取代；

129、在位置444處的v，其經(jīng)g、a、l或i取代；

130、在位置524處的d，其經(jīng)g、a、v、l或i取代；

131、在位置562處的e，其經(jīng)d、n或q取代；

132、在位置583處的d，其經(jīng)e、n或q取代；

133、在位置615處的d，其經(jīng)e、n或q取代；以及

134、在位置642處的h，其經(jīng)d、e、n或q取代。

135、本發(fā)明的經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶可包含在至少3個氨基酸位置到至少12個氨基酸位置處的取代，其中所述氨基酸位置選自位置56、72、138、204、232、234、290、306、344、420、424、444、524、562、583、615和642。具體來說，氨基酸取代可以選自s56a、g138s、s232t、l234e、g290k、y344f、t420v、g424d、v444i和d615e。在某些實(shí)施方式中，經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄酶可以包含至少一個選自g524d、n583d和q562e的額外氨基酸取代。至少一個氨基酸取代可以選自l72q、t163k、n249e和h642d。另外和/或可替代地，氨基酸取代選自s56a、g138s、s232t、l234e、g290k、y344f、t420v、g424d、v444i、d615e和h642d。此實(shí)施方式可進(jìn)一步包括選自d524g、d583n、e562q、h204r和t306k的額外氨基酸取代。

136、本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄的任何已知試劑和方法。舉例來說，提供步驟可包括向樣品提供捕捉標(biāo)靶rna分子的捕捉寡核苷酸。