本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物評(píng)價(jià)，涉及一種抗腫瘤藥物篩選方法及應(yīng)用，特別是涉及一種將胞內(nèi)氧化還原探針和三維腫瘤模型相結(jié)合的抗腫瘤藥物代謝評(píng)估和篩選方法。

背景技術(shù)：

1、腫瘤細(xì)胞系構(gòu)建出的腫瘤體外模型是抗腫瘤藥物篩選的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。盡管2d培養(yǎng)模型由于操作簡(jiǎn)便、成本效益高和具有良好的可重復(fù)性，在藥物開(kāi)發(fā)中廣受歡迎，但此類模型往往無(wú)法準(zhǔn)確模擬腫瘤的生長(zhǎng)。因此，3d腫瘤模型，特別是腫瘤球體模型，越來(lái)越受到關(guān)注。這主要是因?yàn)?d模型能夠更好地模擬體內(nèi)實(shí)體瘤的主要特性，如氧氣、ph、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)梯度，并且具有良好的可重復(fù)性以及較短的構(gòu)建周期。

2、癌細(xì)胞代謝的重新編程使癌細(xì)胞能夠滿足對(duì)能量和生物大分子快速合成的需求。在癌細(xì)胞代謝中，氧化還原反應(yīng)起著關(guān)鍵作用，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞命運(yùn)決定的重要組成部分。特別地，吡啶核苷酸(nadph/nadp+和nadh/nad+)、硫醇和ros構(gòu)成了復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。其中，nad+及其還原形式nadh是參與細(xì)胞能量代謝中最重要的輔因子。

3、然而，現(xiàn)有的生化檢測(cè)方法，如酶循環(huán)測(cè)定、色譜、質(zhì)譜和核磁共振光譜，均存在一定局限性。這些方法往往需要細(xì)胞裂解，無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞狀態(tài)，也不適用于高通量的藥物篩選。因此，我們面臨的挑戰(zhàn)是如何在保持3d腫瘤模型的同時(shí)，開(kāi)發(fā)一個(gè)可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，且適用于高通量藥物篩選的方法。

4、sonar探針是一種強(qiáng)熒光、快速響應(yīng)、耐ph變化、寬動(dòng)態(tài)范圍的基因編碼傳感器，能夠在活細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)胞質(zhì)中nad+和nadh氧化還原狀態(tài)的實(shí)時(shí)檢測(cè)。sonar探針的工作原理是通過(guò)測(cè)量由nad+/nadh比例引起的熒光光譜的變化，從而反映出細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。這使得sonar探針可以在無(wú)需細(xì)胞裂解的情況下，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的實(shí)時(shí)檢測(cè)，并用于高通量的藥物篩選，突破了現(xiàn)有生化檢測(cè)方法的局限性。

5、盡管現(xiàn)有的抗腫瘤藥物篩選方法已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足。例如，“用于抗腫瘤藥物篩選的熒光細(xì)胞模型及其標(biāo)記方法與應(yīng)用”(cn102220284a)提出了一種基于熒光的篩選方法，但未將此方法應(yīng)用于3d腫瘤模型?！耙环N抗腫瘤藥物篩選方法及應(yīng)用”(cn111893159a)雖然利用了更接近實(shí)際腫瘤環(huán)境的3d模型，但依賴于cck-8試劑盒檢測(cè)3d細(xì)胞的活力，需要額外的處理步驟，且不能實(shí)時(shí)獲取結(jié)果。

6、因此，我們的目標(biāo)是開(kāi)發(fā)一種新的抗腫瘤藥物篩選方法，這種方法將3d腫瘤模型和sonar探針結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)基于代謝的實(shí)時(shí)、高通量抗腫瘤藥物篩選。具體而言，我們將在3d腫瘤模型中引入sonar探針，以便實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，并根據(jù)這些信息評(píng)估和篩選抗腫瘤藥物。

7、我們的方法預(yù)期能提供更準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)的細(xì)胞代謝狀態(tài)信息，從而有助于識(shí)別更有效的抗腫瘤藥物。這一方案旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的局限性，提高藥物開(kāi)發(fā)的成功率并降低成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、一種基于胞內(nèi)氧化還原探針的抗腫瘤藥物代謝評(píng)估和篩選方法

2、本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

3、步驟一、構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)sonar探針、inapc探針的細(xì)胞系，使用sonar探針和inapc探針的質(zhì)粒dna轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)sonar探針、inapc探針熒光傳感器的癌細(xì)胞系。

4、步驟二、2d單層細(xì)胞培養(yǎng)，使用t75培養(yǎng)瓶培養(yǎng)攜帶sonar探針、inapc探針的癌細(xì)胞系，于37℃，5％co2和95％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天。

5、步驟三、3d腫瘤球體的形成。在“u-形”超低吸附96孔板中接種攜帶sonar探針、inapc探針的癌細(xì)胞系，以一定的細(xì)胞密度(2000個(gè)細(xì)胞/孔)，然后將孔板在1000g下離心10分鐘形成腫瘤球體，于37℃，5％co2和95％濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。

6、步驟四、使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)加藥后sonar探針、inapc探針的熒光，對(duì)于2d單層細(xì)胞，直接酶解成單細(xì)胞懸液；對(duì)于3d腫瘤球體，需要收集腫瘤球，再酶解成單細(xì)胞懸液。使用hbss重懸細(xì)胞后加入藥物，充分混合后立即使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分別測(cè)定攜帶有sonar探針或inapc探針的hela細(xì)胞在ko525(405nm)和fitc(488nm)通道的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度。

7、步驟五、數(shù)據(jù)處理，對(duì)流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的結(jié)果進(jìn)行處理，根據(jù)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度計(jì)算出校正ph后的405nm、488nm通道的比值，作為藥物篩選的依據(jù)。

技術(shù)特征：

1.一種抗腫瘤藥物代謝評(píng)估和篩選方法，其特征在于，該方法采用2d單層培養(yǎng)或3d腫瘤球體培養(yǎng)，并結(jié)合了基因編碼傳感器sonar探針和inapc探針，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，并進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選，具體包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤藥物代謝評(píng)估和篩選方法，其特征在于，所述2d單層培養(yǎng)是在t25或者t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

3.如權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤藥物代謝評(píng)估和篩選方法，其特征在于，所述3d單層培養(yǎng)是在“u-形”超低吸附96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。

4.如權(quán)利要求1所述的一種抗腫瘤藥物代謝評(píng)估和篩選方法，其特征在于，所述藥物評(píng)價(jià)的具體過(guò)程如下：

技術(shù)總結(jié)
一種基于胞內(nèi)氧化還原探針的抗腫瘤藥物代謝評(píng)估和篩選方法。首先，構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)SoNar探針和iNapc探針熒光傳感器的癌細(xì)胞系。SoNar探針主要用于快速響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)NAD+和NADH的變化，而iNapc探針則用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)pH的變化。接著，以2D單層培養(yǎng)或3D腫瘤球體培養(yǎng)的方式對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)加藥后帶有這兩種探針的細(xì)胞在KO525(405nm)和FITC(488nm)通道的細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度，通過(guò)計(jì)算得出pH校正后細(xì)胞內(nèi)的NAD+/NADH的變化情況，進(jìn)而作為藥物篩選的依據(jù)。本發(fā)明的方法能夠精準(zhǔn)高效地評(píng)估藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞代謝的影響，有助于更有效的藥物篩選，從而對(duì)抗腫瘤治療的前沿研究產(chǎn)生積極影響。

技術(shù)研發(fā)人員：王冠,郭中方,陳曉倩,劉寅寅,李兆君,梅奕晨,姜欣瑜,翁翊軒,王彤,趙玉政,莊英萍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華東理工大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19