本發(fā)明涉及基因工程，具體涉及一種雙展示噬菌體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、骨質(zhì)疏松，是一種由多種原因引發(fā)的全身性骨病，主要特征是骨密度和骨質(zhì)量下降，骨微結(jié)構(gòu)損害，使骨脆性增加，形成易發(fā)生骨折的狀態(tài)。骨質(zhì)疏松癥主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性，原發(fā)性又分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松、老年性骨質(zhì)疏松癥和特發(fā)性骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松癥的癥狀包括疼痛，脊柱變形和脆性骨折。這些癥狀可能導(dǎo)致疼痛，日常生活中的功能障礙，或者更嚴(yán)重的并發(fā)癥，如影響心肺功能的胸廓畸形。骨質(zhì)疏松癥的診斷主要通過雙能x線吸收法和其他相關(guān)癥狀進行。治療包括生活方式的調(diào)整，骨健康基本補充劑的應(yīng)用，藥物干預(yù)和必要時的手術(shù)治療。

2、bmp-2為骨形態(tài)發(fā)生蛋白，是由骨基質(zhì)分泌的一種疏水性蛋白，屬于轉(zhuǎn)化生長因子超家族成員。骨形態(tài)發(fā)生蛋白bmp-2具有明顯誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞定向分化為成骨細(xì)胞的作用并能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)異位骨形成和促進骨折愈合的功能。bmp-2是骨生成的啟動因子，可以加速骨的重建，是骨修復(fù)基因治療的理想目的基因。

3、但是，bmp-2在臨床使用中使用的劑量為“超生理”劑量，這種高劑量的bmp-2使用常帶來異位成骨、炎癥、成瘤、骨溶解等并發(fā)癥，從而顯著降低成骨效率，造成事倍而功半；bmp-2的大量使用也為患者帶來繁重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此，亟需開發(fā)一種新的用于促進成骨的產(chǎn)品。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為開發(fā)一種有效的降低bmp-2的用量，同時保證成骨效率的方法，本發(fā)明提供了一種雙展示噬菌體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的雙展示噬菌體具備促進間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。

2、本發(fā)明提供了一種雙展示噬菌體，所述雙展示噬菌體由如下步驟制備所得：

3、合成seq?id?no.1所示的pm8a質(zhì)粒和seq?id?no.2所示的pm8c質(zhì)粒，備用；

4、通過pcr擴增獲得編碼rgd肽的基因片段，將編碼rgd肽的基因片段插入pm8a質(zhì)粒的 ncoi和 hindiii酶切位點，獲得pm8a-rgd質(zhì)粒；

5、通過pcr擴增獲得編碼bmp2肽的基因片段，將編碼bmp2肽的基因片段插入pm8c質(zhì)粒的 ncoi和 hindiii酶切位點，獲得pm8c-bmp2質(zhì)粒；

6、pm8a-rgd質(zhì)粒和pm8c-bmp2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進tg1感受態(tài)細(xì)胞，然后加入輔助噬菌體孵育后純化獲得雙展示噬菌體pm8-rgd-bmp2。

7、本發(fā)明通過設(shè)計并合成了pm8a質(zhì)粒載體和pm8c質(zhì)粒載體，進一步獲得pm8a-rgd質(zhì)粒和pm8c-bmp2質(zhì)粒，pm8a-rgd質(zhì)粒和pm8c-bmp2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進tg1感受態(tài)細(xì)胞，然后加入輔助噬菌體孵育后純化獲得了長約1.3μm的雙展示噬菌體pm8-rgd-bmp2。獲得的雙展示噬菌體pm8-rgd-bmp2展示的bmp2結(jié)合肽促進了間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。

8、本發(fā)明還提供了所述雙展示噬菌體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

9、合成seq?id?no.1所示的pm8a質(zhì)粒和seq?id?no.2所示的pm8c質(zhì)粒，備用；

10、通過pcr擴增獲得編碼rgd肽的基因片段，將編碼rgd肽的基因片段插入pm8a質(zhì)粒的 ncoi和 hindiii酶切位點，獲得pm8a-rgd質(zhì)粒；

11、通過pcr擴增獲得編碼bmp2肽的基因片段，將編碼bmp2肽的基因片段插入pm8c質(zhì)粒的 ncoi和 hindiii酶切位點，獲得pm8c-bmp2質(zhì)粒；

12、pm8a-rgd質(zhì)粒和pm8c-bmp2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進tg1感受態(tài)細(xì)胞，然后加入輔助噬菌體孵育后純化獲得雙展示噬菌體pm8-rgd-bmp2。

13、進一步地，編碼rgd肽的基因片段的擴增引物如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。

14、進一步地，編碼bmp2肽的基因片段的擴增引物如seq?id?no.3和seq?id?no.5所示。

15、進一步地，所述pm8a-rgd質(zhì)粒和pm8c-bmp2質(zhì)粒通過熱激處理共轉(zhuǎn)染進tg1感受態(tài)細(xì)胞。

16、進一步地，所述熱激處理為：將構(gòu)建的pm8a-rgd質(zhì)粒和pm8c-bmp2質(zhì)粒各90ng～100ng加入至80μl～90μl的tg1感受態(tài)細(xì)胞中混勻，然后快速置入42℃水浴熱激60s,取出插入冰中靜置2min。

17、進一步地，所述熱激處理后的細(xì)胞接種于lb培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得培養(yǎng)物，然后離心后收集沉淀并接種于含有氨芐青霉素和氯霉素雙抗lb固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得雙展示噬菌體培養(yǎng)物。

18、進一步地，純化過程為：將雙展示噬菌體培養(yǎng)物于4000rpm～4500rpm離心25min～30min除去細(xì)菌，上清中加入聚乙二醇和氯化鈉的混合液混勻，4℃靜置14h～16h后于10000rpm～12000rpm離心30min～35min，獲得雙展示噬菌體pm8-rgd-bmp2。

19、本發(fā)明還提供了所述的雙展示噬菌體在制備促成骨分化產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述產(chǎn)品以雙展示噬菌體為唯一有效成分。

20、進一步地，所述產(chǎn)品具備促進間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。

21、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

22、本發(fā)明設(shè)計并合成了pm8a質(zhì)粒載體和pm8c質(zhì)粒載體。pm8a質(zhì)粒載體和pm8c質(zhì)粒載體可通過 ncoi和 hindiii將攜帶外源多肽基因的p8蛋白基因插入載體，并表達多肽和p8蛋白的重組蛋白，在輔佐噬菌體作用下完成噬菌體展示。同時，pm8a質(zhì)粒載體和pm8c質(zhì)粒載體分別攜帶有氨芐青霉素抗性基因ampr和氯霉素抗性基因cmr，能為后續(xù)陽性克隆篩選帶來很大的方便。后續(xù)依靠噬菌體表面的rgd肽和bmp2肽共同完成促進間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化。

23、本發(fā)明制備的pm8-rgd-bmp2雙展示噬菌體具有較大的比表面積，所以能攜帶大量的分子藥物，能同時表達rgd肽和bmp2的雙功能性，依靠噬菌體表面的rgd肽和bmp2肽共同完成促間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化，因此，提高了成骨效率，從而間接降低了bmp-2的使用劑量。本發(fā)明制備的pm8-rgd-bmp2雙展示噬菌體對于牙槽骨或其他部位骨缺損修復(fù)，將極有臨床應(yīng)用價值。

技術(shù)特征：

1.一種雙展示噬菌體，其特征在于，所述雙展示噬菌體由如下步驟制備所得：

2.一種雙展示噬菌體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙展示噬菌體的構(gòu)建方法，其特征在于，編碼rgd肽的基因片段的擴增引物如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙展示噬菌體的構(gòu)建方法，其特征在于，編碼bmp2肽的基因片段的擴增引物如seq?id?no.3和seq?id?no.5所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙展示噬菌體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述pm8a-rgd質(zhì)粒和pm8c-bmp2質(zhì)粒通過熱激處理共轉(zhuǎn)染進tg1感受態(tài)細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙展示噬菌體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述熱激處理為：將構(gòu)建的pm8a-rgd質(zhì)粒和pm8c-bmp2質(zhì)粒各90ng～100ng加入至80μl～90μl的tg1感受態(tài)細(xì)胞中混勻，然后快速置入42℃水浴熱激60s，取出插入冰中靜置2min。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的雙展示噬菌體的構(gòu)建方法，其特征在于，所述熱激處理后的細(xì)胞接種于lb培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得培養(yǎng)物，然后離心后收集沉淀并接種于含有氨芐青霉素和氯霉素雙抗lb固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得雙展示噬菌體培養(yǎng)物。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙展示噬菌體的構(gòu)建方法，其特征在于，純化過程為：將雙展示噬菌體培養(yǎng)物于4000rpm～4500rpm離心25min～30min除去細(xì)菌，上清中加入聚乙二醇和氯化鈉的混合液混勻，4℃靜置14h～16h后于10000rpm～12000rpm離心30min～35min，獲得雙展示噬菌體pm8-rgd-bmp2。

9.一種權(quán)利要求1所述的雙展示噬菌體在制備促成骨分化產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品以雙展示噬菌體為唯一有效成分。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的雙展示噬菌體在制備促成骨分化產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品具備促進間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一種雙展示噬菌體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，包括如下步驟：合成SEQ?ID?NO.1所示的pM8A質(zhì)粒和SEQ?ID?NO.2所示的pM8C質(zhì)粒；將編碼RGD肽的基因片段插入pM8A質(zhì)粒的NcoI和HindIII酶切位點，獲得pM8A?RGD質(zhì)粒，將編碼BMP2肽的基因片段插入pM8C質(zhì)粒的NcoI和HindIII酶切位點，獲得pM8C?BMP2質(zhì)粒，pM8A?RGD質(zhì)粒和pM8C?BMP2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進TG1感受態(tài)細(xì)胞，然后加入輔助噬菌體孵育后純化獲得雙展示噬菌體pM8?RGD?BMP2。本發(fā)明提供的雙展示噬菌體具備促進間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及促進間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。

技術(shù)研發(fā)人員：李龑,毛傳斌,孫偉蓮,許純賓,繆瑤,徐勝前,曾菲菲,楊玉婷,陳可兒
受保護的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19