本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種lipus對三維支架材料上mc3t3-e1細(xì)胞內(nèi)rna表達(dá)影響的研究方法。

背景技術(shù)：

低強(qiáng)度脈沖超聲波(low-intensitypulsedultrasoundstimulation，lipus)是一種使用頻率和劑量較低的超聲波。有文獻(xiàn)報(bào)道：lipus有利于體外三維材料內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化、促進(jìn)兔股骨多孔材料內(nèi)的血管化和骨形成、可提高兔脊椎與多孔材料間的骨融合率^[1-3]。還有文獻(xiàn)報(bào)道：lipus可以明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞在多孔材料內(nèi)的長入、增殖和早期分化^[4，5]；lipus與人工骨材料聯(lián)合修復(fù)beagle犬節(jié)段性骨缺損可提高新骨形成速度及骨組織密度，縮短骨愈合時(shí)間^[6]。本課題組與中科院金屬研究所合作的國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目：2015aa033702高強(qiáng)韌多孔鈦人工骨材料研發(fā)，對利用電子束逐層熔化技術(shù)三維打印制備的多孔鈦合金(ti-6al-4v，eli粉，醫(yī)療外科植入用)材料的生物學(xué)性能進(jìn)行了全面評價(jià)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lipus可以促進(jìn)鈦合金多孔材料內(nèi)mc3t3-e1細(xì)胞的分化和長入，對細(xì)胞的增殖無明顯影響^[7]；動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果是在兔下頜骨大面積骨缺損修復(fù)過程中，lipus促進(jìn)了鈦合金多孔材料內(nèi)的骨形成和骨成熟。以上數(shù)據(jù)均提示lipus可以提高多孔人工骨材料修復(fù)骨缺損的療效，“超聲波+多孔材料”方法應(yīng)用于大面積骨缺損修復(fù)具有可行性。

但到目前為止，對于超聲波促進(jìn)骨愈合機(jī)制的研究基本上都是基于二維空間^[8]，基于三維空間的研究尚未見報(bào)道。但是基于二維空間闡述的機(jī)制不能用于解釋三維支架上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。超聲波在三維支架材料內(nèi)的傳播非常復(fù)雜，完全不同于二維空間，并且骨缺損修復(fù)本身就是對缺損三維空間的修復(fù)過程，因此lipus對三維支架材料內(nèi)骨愈合的作用機(jī)制的探索具有重要意義。

越來越多的證據(jù)表明非編碼rna，特別是長鏈非編碼rna(longnoncodingrna，1ncrna)和微小rna(microrna，mirna)參與調(diào)控成骨分化^[9，10]，而1ncrna和mirna之間的相互調(diào)控關(guān)系是發(fā)揮作用的重要形式^[11]。1ncrna調(diào)控mirna的作用機(jī)制中最主要的是競爭性內(nèi)源rna(competitiveendogenousrna，cerna)途徑，即lncrna競爭結(jié)合具有相同mirna應(yīng)答元件的mirna，發(fā)揮內(nèi)源性“mirna海綿”功能，抑制該mirna表達(dá)及對靶基因的負(fù)向表達(dá)調(diào)控^[12]。cerna是一種全新的基因表達(dá)調(diào)控模式，相比其它調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，更為精細(xì)和復(fù)雜^[13]。但現(xiàn)有關(guān)于lipus對三維支架材料內(nèi)骨愈合的作用機(jī)制的探索主要集中在nf-κβ1、p38α、m-tor^[14]、mapk^[15]、α5β1/pi3k/akt^[16]、rock-cot/tpl2-mek^[17]這些通路，且這些研究都是基于二維空間闡述的機(jī)制，不能用于解釋三維支架上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果?，F(xiàn)在還未見lipus對三維支架材料內(nèi)成骨機(jī)制有關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)非編碼rna方面的研究，所以對于lipus對三維支架材料內(nèi)成骨機(jī)制在轉(zhuǎn)錄組學(xué)非編碼rna方面的探索具有非常重要的意義。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種lipus對三維支架材料上mc3t3-e1細(xì)胞內(nèi)rna表達(dá)影響的研究方法，為進(jìn)一步研究lipus促進(jìn)三維材料內(nèi)成骨分化的分子生物學(xué)機(jī)制提供新的研究思路。本發(fā)明的技術(shù)方案為：

lipus對三維支架材料上mc3t3-e1細(xì)胞內(nèi)rna表達(dá)影響的研究方法，包括以下步驟：

(1)將mc3t3-e1細(xì)胞接種到三維支架材料上；

(2)將接種完畢的三維支架材料和超聲探頭浸入水中，保持超聲探頭和材料的距離為5cm，從材料底部加載lipus，加載參數(shù)為：超聲頻率1～3.3mhz，強(qiáng)度10～100mw/cm²，10～30min/次，1次/d，加載周期為1～21d，加載過程中每2～3天更換一次mc3t3-e1細(xì)胞的培養(yǎng)基；

(3)停止加載lipus后，收集材料上的mc3t3-e1細(xì)胞，進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組和mirna的高通量測序，篩選差異表達(dá)的mrna、lncrna、mirna，并結(jié)合go和kegg進(jìn)行整合分析。

進(jìn)一步地，所述將mc3t3-e1成骨細(xì)胞接種到三維支架材料上，具體接種方法為：將經(jīng)過真空除氣和預(yù)濕的三維支架材料放入六孔板中；將融合度達(dá)到80％的mc3t3-e1細(xì)胞用胰蛋白酶消化得到細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液均勻接種到三維支架材料上，然后在六孔板中加入培養(yǎng)基孵育。

進(jìn)一步地，所述三維支架材料為ti-6al-4v多孔支架材料。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明將三維支架材料與mc3t3-e1成骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)后加載lipus，然后收集細(xì)胞測序后，根據(jù)測序結(jié)果可以初步了解lipus對三維支架材料上細(xì)胞分化影響的機(jī)制是由于lipus引起蛋白編碼基因和非編碼rna的改變，為后續(xù)研究lipus促進(jìn)三維材料內(nèi)成骨分化的分子生物學(xué)機(jī)制提供可靠數(shù)據(jù)和新的研究思路。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例采用的lipus加載裝置的結(jié)構(gòu)簡圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的高通量測序全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的熱圖結(jié)果，其中，l：超聲組；k：對照組。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組go富集結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組kegg富集結(jié)果。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的高通量測序mirna差異表達(dá)的熱圖結(jié)果，其中，l：超聲組；k：對照組。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的mirna的go富集結(jié)果。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的mirna的kegg富集結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施所采用的lipus加載裝置型號為sonicator740，如圖1所示，圖中顯示，接種mc3t3-e1細(xì)胞的材料放置于六孔板中，將孔板和超聲儀器的探頭放置于裝水的容器中，材料位于上方，探頭位于下方，從材料底部加載lipus，并且材料和探頭之間保持5cm的距離。

本發(fā)明實(shí)施例所采用的ti-6al-4v多孔支架材料為中國科學(xué)院金屬研究所提供，該材料的加工方法是采用粉末原料為ti-6al-4veli醫(yī)療(外科植入)用合金粉末，平均粒度約為50μm。通過materialise/magics軟件生成鈦合金多孔支架模型，利用瑞典arcam(a1)型電子束熔融金屬快速成形系統(tǒng)制備鈦合金多孔支架，該材料的壓縮強(qiáng)度高于150mpa，疲勞強(qiáng)度高于50mpa，彈性模量低于20gpa。直徑10mm，高度3mm的圓柱體，孔徑400～500um，孔隙率為65％～70％。

在本發(fā)明的描述中，需要說明的是，實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。此外，下面所描述的本發(fā)明不同實(shí)施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互結(jié)合。

下面結(jié)合附圖和具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

本發(fā)明提供一種lipus對三維支架材料上mc3t3-e1細(xì)胞內(nèi)rna表達(dá)影響的研究方法，包括以下步驟；

(1)將mc3t3-e1細(xì)胞接種到ti-6al-4v多孔支架材料上，具體接種方法為：將經(jīng)過真空除氣和預(yù)濕的24個(gè)三維支架材料放入4組六孔板中；將融合度達(dá)到80％的小鼠mc3t3-e1細(xì)胞用質(zhì)量濃度為0.25％的胰蛋白酶消化得到細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液均勻接種到這些三維支架材料上，然后在4組六孔板中加入α-mem培養(yǎng)基，放入恒溫培養(yǎng)箱中孵育24h，將細(xì)胞脫落較多的樣本材料丟棄，并從余留樣本材料中至少選擇6個(gè)較好地樣本材料隨機(jī)分為兩組：超聲組和對照組(各至少3個(gè)樣本材料)，加載過程中每2～3天更換一次mc3t3-e1細(xì)胞的培養(yǎng)基；

(2)將超聲組孔板和超聲探頭浸入水中，保持超聲探頭和材料的距離為5cm，從材料底部加載lipus，加載參數(shù)為：超聲頻率1mhz，強(qiáng)度30mw/cm²，脈沖寬度1ms，脈沖頻率100hz，20min/次，1次/d，加載周期為7d；

(3)將對照組以和超聲組同樣的方式放置在水中，區(qū)別在于：對照組進(jìn)行不開功率源的假輻照，20min/次，1次/d，加載天數(shù)為7d，加載過程中每2～3天更換一次mc3t3-e1細(xì)胞的培養(yǎng)基；

(4)停止加載lipus后，收集兩組樣本材料上的mc3t3-e1細(xì)胞，進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組和mirna的高通量測序，篩選差異表達(dá)的mrna、lncrna、mirna，并結(jié)合go和kegg進(jìn)行整合分析。

結(jié)果分析：圖2提供了本實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的高通量測序全轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)的熱圖結(jié)果，利用tophat2.0程序與參考基因組比對，每個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄本單獨(dú)組裝后，利用cuffmerge命令將所有樣本的轉(zhuǎn)錄本信息匯總與合并，使用cufflinks估算所有轉(zhuǎn)錄本的豐度，cuffdiff命令篩選差異基因。篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)是fold-change＞1.5，pvalue≤0.05和qvalue≤0.05。結(jié)果顯示差異轉(zhuǎn)錄本聚類分析，顏色的深淺代表基因表達(dá)量的高低，深灰色代表表達(dá)量高，淺灰色代表表達(dá)量低，橫坐標(biāo)顯示為樣本編號，其中l(wèi)：超聲組；k：對照組。lipus作用后引起163條lncrna上調(diào)，309個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。

圖3提供了本實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組go富集結(jié)果，geneontology(簡稱go)顯著性富集分析以goterm為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)(phyper)，找出與所有表達(dá)基因背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的goterm。對檢驗(yàn)p值＜0.05的goterm定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的goterm。通過go功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行駛的主要生物學(xué)功能。結(jié)果顯示富集的條形圖，表示富集個(gè)數(shù)從大到小前10位(top10)：ovarianfollicledevelopment(卵泡發(fā)育)，cellularresponsetohypoxia(細(xì)胞內(nèi)缺氧應(yīng)答)，positiveregulationofpeptidyl-tyrosinephosphorylation(肽酪氨酸磷酸化的正調(diào)控)，positiveregulationofproteinkinasedsignaling(蛋白激酶-d信號的正調(diào)控)，neuropilinbingding(神經(jīng)纖毛蛋白結(jié)合)，basophilchemotaxis(嗜堿性粒細(xì)胞的趨化作用)，regulationofcellshape(細(xì)胞形態(tài)調(diào)控)，responsetosulfurdioxide(二氧化硫反應(yīng))，tcellantigenprocessingandpresentation(t細(xì)胞抗原加工提呈)，positiveregulationoferk1anderk2cascade(erk1和erk2級聯(lián)的正調(diào)控)。

圖4提供了本實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組kegg富集結(jié)果，kegg顯著性富集分析以keggterm為單位，應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)(phyper)，找出與所有表達(dá)基因背景相比，在差異表達(dá)基因中顯著性富集的keggterm。對檢驗(yàn)p值＜0.05的pathway定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的keggterm。kegg是有關(guān)pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫，通過kegg功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)代謝途徑及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果顯示富集的條形圖，表示富集個(gè)數(shù)從大到小前10位(top10)：rheumatoidarthritis(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)，influenzaa(甲型流感)，aminobenzoatedegradation(氨基苯甲酸降解)，folatebiosynthesis(葉酸合成)，two-copmponentsystem(雙組份系統(tǒng))，africantrypanosomiasis(非洲錐蟲病)，bladdercancer(膀胱癌)，malaria(瘧疾)，staphylococcusaureusinfection(金黃色葡萄球菌感染)，vegfsignalingpathway(vegf信號通路)。

圖5提供了本實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的高通量測序mirna差異表達(dá)的熱圖結(jié)果，將mirna數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，差異表達(dá)mirna分析，對于單重復(fù)，reads數(shù)較多的(兩樣本都大于20)mirna采用卡方檢驗(yàn)，較少的采用fisher精確檢驗(yàn)；對于多重復(fù)，在不事先假設(shè)其分布的情況下采用置換檢驗(yàn)。差異mirna篩選標(biāo)準(zhǔn)：|log2(fold-change)|≥1且pvalue≤0.05。結(jié)果顯示為用差異表達(dá)mirna與樣品進(jìn)行的雙向聚類圖，深灰色代表表達(dá)量高，淺灰色代表表達(dá)量低，橫坐標(biāo)為樣本編號。l1、l2、l3：超聲組3個(gè)樣本；k1、k2、k3：對照組3個(gè)樣本，縱坐標(biāo)為mirna名稱。lipus可以下調(diào)鈦合金多孔材料上成骨細(xì)胞內(nèi)mirna的表達(dá)量，下調(diào)的mirna30個(gè)，分別為：mmu-mir-5128_r6-23l23，mmu-mir-3471r16-1l22，mmu-mir-7667-5p_r15-1l22，mmu-mir-30c-1-3p_r1-20l22，hsa-mir-6754-3p_r19-5l22，mmu-mir-1187_r6-20l23，mmu-mir-9-3p_r1-21l22，rno-mir-3473_r4-18l22，mmu-mir-5114，mmu-mir-6239_r1-18l20，等。

圖6提供了本實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的mirna的go富集結(jié)果，差異mirna靶基因預(yù)測采用軟件miranda，對靶基因進(jìn)行g(shù)o富集分析，結(jié)果顯示go富集的條形圖，表示富集個(gè)數(shù)從大到小前10位(top10)：mitochondrion(線粒體)，deathdomainbinding(死亡結(jié)構(gòu)域的結(jié)合)，viralreleasefromhostcell(宿主細(xì)胞的病毒釋放)，cytoplasm(細(xì)胞質(zhì))，n-acetylneuraminatemetabolicprocess(n-乙酰神經(jīng)氨酸的代謝過程)，long-termsynapticpotentiation(長時(shí)程突觸增強(qiáng))，positiveregulationoffocaladhesionassembly(黏著斑附著的正調(diào)控)，structure-specificdnabingding(結(jié)構(gòu)特異性dna結(jié)合)，(ceramidebiosyntheticprocess神經(jīng)酰胺的生物合成過程)，nucleoplasm(核漿)。

圖7提供了本實(shí)施例最終收集的mc3t3-e1細(xì)胞的mirna的kegg富集結(jié)果，差異mirna靶基因預(yù)測采用軟件miranda，對靶基因進(jìn)行kegg富集分析，結(jié)果顯示kegg富集的條形圖，表示富集個(gè)數(shù)從大到小前10位(top10)：othertypesofo-glycanbiosynthesis(其他類型o-聚糖的生物合成)，sphingolipidsignalingpathway(神經(jīng)鞘脂的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路)，pancreaticcancer(胰腺癌)，tuberculosis(肺結(jié)核)，dopaminergicsynapse(多巴胺能神經(jīng)突觸)，pathwaysincancer(癌癥中的通路)，colorectalcancer(結(jié)直腸癌)，hepatitisc(c型肝炎)，chagasdisease(americantrypanosomiasis)(南美錐蟲病)，gabaergicsynapse(gaba能突觸)。

綜上，在采用超聲頻率1mhz，強(qiáng)度30mw/cm²，脈沖寬度1ms，脈沖頻率100hz，20min/次，1次/d的lipus對ti-6a1-4v多孔支架材料上的mc3t3-e1細(xì)胞作用后，引起該細(xì)胞中的309個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、163條lncrna上調(diào)(圖2)、30條mirna下調(diào)(圖5)、193條goterms富集上調(diào)和8條信號通路差異上調(diào)(圖3、4、6、7)。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。