本發(fā)明涉及一種用于鑒定烤煙龍江911的引物組合，同時還涉及包含該引物組合的試劑盒、應(yīng)用及鑒定方法，屬于生物分子鑒別技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙草是一種重要的經(jīng)濟作物，是卷煙生產(chǎn)的主要原料。烤煙品種龍江911是由黑龍江省煙草科學(xué)研究所以龍江851(windel)為母本、cv91為父本雜交，系譜法選育而成，于2000年12月通過全國煙草品種審定委員會審定。龍江911株式塔形，自然株高193.3cm，節(jié)距5.98cm，莖圍8.62cm，有效葉數(shù)15.8片。腰葉長78.2cm，寬34.0cm，頂葉長54.7cm，寬22.8cm，長橢圓形，葉尖急尖，葉色綠色，葉面皺，葉緣波浪狀，葉耳中等，葉肉組織細致，莖葉角度中；田間生長整齊，生長勢強；花序集中，花冠淡紅色；移栽至現(xiàn)蕾44天，移栽至中心花開放49天，大田生育期120天左右，全生育期178天。龍江911是近年來我國煙葉生產(chǎn)中重要的主栽烤煙品種，也是卷煙生產(chǎn)中重要的工業(yè)常用品種。
品種是優(yōu)質(zhì)煙葉原料生產(chǎn)的基礎(chǔ)，是影響煙葉品質(zhì)最主要的因素之一。根據(jù)《中華人民共和國種子法》和《煙草專賣法》，為保證煙葉生產(chǎn)的穩(wěn)定性和可持續(xù)發(fā)展，必須選用經(jīng)全國煙草品種審定委員會審(認)定的品種，嚴禁種植劣雜品種。此外，煙草工業(yè)生產(chǎn)和產(chǎn)品開發(fā)對特定煙葉品種也提出了嚴格的要求。目前，我國面臨著煙草主栽品種遺傳背景狹窄，形態(tài)學(xué)上相似程度高難以區(qū)分鑒別的問題。煙草品種的檢測方法主要是田間種植鑒定法。但是，該方法存在田間種植規(guī)模大、鑒別項目多(鑒別性狀涉及株高、葉數(shù)、節(jié)距、葉長、葉寬、莖葉角度等)、周期長(跨越煙草不同生育期)、鑒別難度大(性狀指標差異小)、同一性狀年度間存在差異(受環(huán)境影響)等不足。煙草品種保護，種子純度的監(jiān)測，煙葉真假檢測等方面，都迫切需要從分子水平上進行煙草dna身份鑒定。
專利cn105734141a公開了一種鑒定煙草品種純度的分子生物學(xué)方法，包括：分別提取對照與待測煙草品種的基因組總dna，采用最新測序技術(shù)對其進行適當(dāng)深度的全基因組測序，基于煙草基因組參考序列利用生物信息學(xué)手段對它們進行序列拼接、組裝與全基因組序列比較，統(tǒng)計二者堿基差異，計算出待測煙草品種相對于對照煙草品種的純度百分比。該方法不受環(huán)境條件和季節(jié)影響，鑒定結(jié)果準確可靠，可從最小遺傳單位單堿基變異水平上準確鑒別煙草品種的純度，用于煙草品種親本提純與真?zhèn)舞b定。但是該方法操作復(fù)雜，檢測成本非常高。
單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)主要是指在基因組上由單個核苷酸變異所引起的dna序列多態(tài)性。與傳統(tǒng)的分子標記相比，snp標記具有密度高、分布范圍廣、分型簡單等優(yōu)點。隨著全基因組序列鑒定技術(shù)以及自動化的snp芯片分型技術(shù)的發(fā)展，利用大規(guī)模、高通量snp芯片進行遺傳多樣性研究已經(jīng)變得越來越普遍。國家煙草基因研究中心設(shè)計研制出首張煙草高密度snp芯片(420ktobaccosnparray)，涵蓋絕大多數(shù)標簽snp位點并均勻分布整個煙草基因組，為從全基因組水平上對煙草品種進行遺傳多樣性研究提供了便利。采用煙草高密度snp芯片標記技術(shù)對煙草主栽品種的遺傳多樣性進行分析，可以篩選獲得特定主栽品種的特異性snp分子標記，并依據(jù)該特異性snp標記設(shè)計煙草品種鑒定方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用于鑒定烤煙龍江911的引物組合。
其次，本發(fā)明還提供一種烤煙龍江911鑒定試劑盒。
再次，本發(fā)明再提供一種上述引物組合或試劑盒在烤煙龍江911品種鑒定方面的應(yīng)用。
最后，本發(fā)明還提供一種能夠簡單、快速、高效地鑒定烤煙龍江911的方法。
為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
用于鑒定烤煙龍江911的引物組合，所述引物針對烤煙龍江911的16個特異性snp位點側(cè)翼序列設(shè)計，具體根據(jù)檢測方法的不同對應(yīng)設(shè)計引物。這16個snp標記是基于近年來我國煙草主栽品種全基因組snp分型結(jié)果篩選出來的烤煙龍江911獨有的特異性snp位點，其物理位置是基于栽培煙草品種紅花大金元的全基因組序列比對確定的，具體位點信息如下表1所示，分別命名為fp01～fp16。包含這16個snp位點的基因序列如seqidno:1～16所示。
表1烤煙龍江911的16個特異性snp位點信息
所述檢測方法可采用snp經(jīng)典檢測法如pcr-rflp、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(sscp)、變性梯度凝膠電泳(dgge)、等位基因特異pcr(as-pcr)法，或是采用snps高通量檢測法如dna測序法、基因芯片技術(shù)、變性高效液相色譜(dhplc)、taqman探針法、snapshot法、massarray分子量陣列技術(shù)，以實現(xiàn)烤煙龍江911的品種鑒定。
烤煙龍江911鑒定試劑盒，除包含上述引物組合外，還可以包括pcr緩沖液、mgcl2、dntps、pcrenzyme、sap酶、sap緩沖液、iplex緩沖液、iplexterminationmix、iplexenzyme、水等。
上述引物組合或試劑盒在烤煙龍江911品種鑒定方面的應(yīng)用。具體為：取煙草樣本基因組dna進行snp分型檢測，若檢測樣本中16個snp位點的基因型與下表2中所示的結(jié)果完全一致，則判定該煙草樣本為烤煙龍江911。
表2烤煙龍江911中各snp位點的基因型
本發(fā)明優(yōu)選采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(massarray分子量陣列平臺)，并基于assaydesignsuit(agena)針對每個位點設(shè)計兩條擴增引物和一條延伸引物，引物組合如下表3所示。
表3基于烤煙龍江911的特異性snp位點設(shè)計的引物組合
烤煙龍江911的鑒定方法，包括以下步驟：
1)snp位點多重pcr擴增反應(yīng)
以煙草樣本基因組dna為模板，利用引物組合中的擴增引物進行多重pcr擴增反應(yīng)，得pcr產(chǎn)物；
2)sap酶反應(yīng)
用sap酶去除pcr產(chǎn)物中剩余的dntp和引物，得反應(yīng)產(chǎn)物；
3)單堿基延伸反應(yīng)
在反應(yīng)產(chǎn)物中加入延伸引物進行單堿基延伸反應(yīng)，得延伸產(chǎn)物；
4)基因型檢測及結(jié)果判定
對延伸產(chǎn)物進行預(yù)處理，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)進行snp基因型檢測，若檢測樣本中16個snp位點的基因型與烤煙龍江911的完全一致，則判定該煙草樣本為烤煙龍江911；烤煙龍江911中16個snp位點fp01～fp16的基因型依次為aa、tt、tt、cc、tt、aa、tt、tt、aa、tt、gg、aa、cc、aa、gg、aa。
步驟1)中多重pcr擴增反應(yīng)為：反應(yīng)體系：10×pcr緩沖液0.5μl、25mmmgcl20.4μl、25mmdntps0.1μl、5u/μlpcrenzyme0.2μl、1μm擴增引物的混合液(等量混合)1μl、10ng/μl煙草樣本基因組dna1μl，水補足至5μl；反應(yīng)條件為：95℃2min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，45個循環(huán)；72℃5min。
步驟2)中sap酶反應(yīng)為：在pcr產(chǎn)物中加入1.7u/μlsap0.3μl和10×sap緩沖液0.17μl，水補足至7μl；反應(yīng)條件為：37℃40min，85℃5min。
步驟3)中單堿基延伸反應(yīng)為：在反應(yīng)產(chǎn)物中加入10×iplex緩沖液0.2μl、10×iplexterminationmix0.2μl、33u/μliplexenzyme0.041μl和1μm延伸引物的混合液(等量混合)0.94μl，水補足至9μl；反應(yīng)條件為：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5個循環(huán)]40個循環(huán)；72℃3min。
步驟4)中預(yù)處理為：在延伸產(chǎn)物中加入水41μl，潔凈樹脂15mg，混勻后進行脫鹽去離子防干擾處理，離心取上清液備用。
步驟4)中snp基因型檢測為：利用massarraynanodispenserrs1000點樣儀將上清液點到384點spectrochip芯片上，將芯片置于massarraytyperworkstationma4中，用maldi-tof(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間)質(zhì)譜儀掃描芯片，得到snp基因型檢測結(jié)果。
本發(fā)明的有益效果：
本發(fā)明利用煙草420k高密度snp芯片對近年來我國煙草主栽品種進行全基因組snp分型，根據(jù)品種間多態(tài)性snp位點篩選獲得了一套適用于鑒定烤煙龍江911的特異性snp標記共16個，其物理位置基于栽培煙草品種紅花大金元的全基因組序列比對確定，具體位點信息見上表1，對比栽培煙草參考基因組獲得16條包含snp位點的基因序列，如seqidno:1～16所示。針對烤煙龍江911中16個特異性snp位點側(cè)翼序列，根據(jù)檢測方法的不同設(shè)計相應(yīng)引物，可用于烤煙龍江911的品種鑒定。本發(fā)明優(yōu)選采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(massarray分子量陣列平臺)，基于assaydesignsuit(agena)針對每個位點設(shè)計兩條擴增引物和一條延伸引物，引物組合見上表3。
本發(fā)明在烤煙龍江911品種鑒定中，先提取待測樣品基因組dna，再按照massarray系統(tǒng)平臺操作要求依次進行snp位點多重pcr擴增、sap酶除雜和單堿基延伸反應(yīng)，封片后利用maldi-tof質(zhì)譜儀掃描芯片得到分型結(jié)果，若檢測樣品中snpa標記fp01～fp16的基因型依次為aa、tt、tt、cc、tt、aa、tt、tt、aa、tt、gg、aa、cc、aa、gg、aa，則判斷該煙草樣本為烤煙龍江911。該方法操作簡便，樣品用量少，檢測周期短，鑒定結(jié)果準確，可重復(fù)性好，檢測通量高，快捷、高效、可靠，是國內(nèi)外首套烤煙龍江911品種分子檢測體系，為烤煙龍江911的鑒定技術(shù)體系提供了基礎(chǔ)和依據(jù)，有較好的應(yīng)用推廣前景。
具體實施方式
下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
實施例1
用于鑒定烤煙龍江911的引物組合，針對烤煙龍江911的特異性snp位點標記設(shè)計，包括：
1)煙草主栽品種全基因組snp分型檢測
利用420ktobaccosnparray(affymetrix)對近年來我國煙草主栽品種進行全基因組掃描，依托國家煙草基因研究中心genetitan芯片平臺(affymetrix)進行樣本dna的snp分型。煙草樣品dna經(jīng)全基因組擴增后將產(chǎn)物隨機片段化為25到125bp之間的片段，片段純化后進行重懸浮，與420ktobaccosnparray進行雜交，對每一個snp通過芯片表面所發(fā)生的雙色連接反應(yīng)進行鑒別連接。雜交過程完成后進行嚴謹性洗滌以去除非特異性結(jié)合，連接反應(yīng)完成后，芯片在genetitan多通道自動化芯片工作站上完成染色洗滌等步驟，最后進行掃描并輸出結(jié)果。將芯片分析獲得的數(shù)據(jù)進行處理，得到不同品種snp分型結(jié)果。
2)烤煙龍江911特異性snp位點篩選
根據(jù)芯片系統(tǒng)數(shù)據(jù)分級及推薦類型，選取polyhighresolution和monohighresolution兩種類型位點數(shù)據(jù)，過濾后得到高質(zhì)量snp分型結(jié)果，保留在所有檢測品種中callrate均為100％的位點，進一步篩選去除在任一品種中出現(xiàn)雜合分型的位點，最終獲得在所有檢測品種中純合的snp位點，篩選獲得在烤煙龍江911中特異性的snp位點。由于煙草中存在大量重復(fù)序列，為避免檢測引物設(shè)計中出現(xiàn)非特異性擴增，對snp位點側(cè)翼各200bp序列與參考基因組進行blast比對，篩選基因組中無高度相似序列的位點，結(jié)合snp位點在染色體上分布情況，在存在多態(tài)性位點的染色體上挑選一個位點作為烤煙龍江911的特異性snp標記，篩選結(jié)果見上表1。
3)用于鑒定烤煙龍江911的引物組合設(shè)計
對篩選得到的特異性snp位點在參考基因組中進行染色體定位，獲得包含這些snp位點的上下游序列，如seqidno:1～16所示?；赼ssaydesignsuit(agena)針對每個位點設(shè)計兩條擴增引物和一條延伸引物，引物組合見上表3。所述引物均由華大基因合成。
基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的massarray分子量陣列平臺可以針對snp位點設(shè)計最高多達40重pcr反應(yīng)和基因型檢測，實驗設(shè)計非常靈活，分型結(jié)果準確性高。根據(jù)應(yīng)用需要，對于數(shù)十到數(shù)百個snp位點進行數(shù)百至數(shù)千份樣本檢測時，massarray具有極高性價比，特別適合于對有限數(shù)量的snp位點進行大規(guī)模分型檢測。
實施例2
烤煙龍江911鑒定試劑盒，包括：實施例1中擴增引物的混合液(1μm)5ml，10×pcr緩沖液5ml，25mmmgcl24ml，25mmdntps2ml，5u/μlpcrenzyme2ml，1.7u/μlsap3ml，10×sap緩沖液3ml，10×iplex緩沖液2ml，10×iplexterminationmix2ml，33u/μliplexenzyme1ml，實施例1中延伸引物的混合液(1μm)5ml，水200ml。
實施例3
烤煙龍江911的鑒定方法，包括以下步驟：
1、待測樣品dna提取
采用煙草樣品的新鮮葉片組織，利用genepurenewayplantgenomicdnakit試劑盒(geneanswer)提取樣品基因組dna；再用核酸蛋白測定儀nanodropnd-2000(thermofisherscientific)檢測dna濃度，將dna稀釋至10ng/μl備用。
2、massarray檢測
操作按照massarray系統(tǒng)平臺(agena)要求進行，反應(yīng)利用iplexgoldreagentkit試劑盒(agena)，具體為：
1)snp位點多重pcr擴增反應(yīng)
以待測樣品基因組dna為模板，利用實施例1中擴增引物進行多重pcr擴增反應(yīng)，得pcr產(chǎn)物；
反應(yīng)體系為：pcr緩沖液(10×)0.5μl、mgcl2(25mm)0.4μl、dntps(25mm)0.1μl、pcrenzyme(5u/μl)0.2μl、擴增引物的混合液(1μm)1μl、待測樣品基因組dna(10ng/μl)1μl，水補足至5μl；反應(yīng)條件為：95℃2min；95℃30s、56℃30s、72℃1min，45個循環(huán)；72℃5min。
2)sap酶反應(yīng)
用sap酶(蝦堿性磷酸酶，shrimpalka-linephosphatase)去除pcr產(chǎn)物中剩余的dntp和引物，在步驟1)的pcr產(chǎn)物中加入sap(1.7u/μl)0.3μl、sap緩沖液(10×)0.17μl，水補足至7μl；反應(yīng)條件為：37℃40min，85℃5min，得反應(yīng)產(chǎn)物。
3)單堿基延伸反應(yīng)
使用iplexreagentkit進行延伸反應(yīng)，在步驟2)的反應(yīng)產(chǎn)物中加入iplex緩沖液(10×)0.2μl、iplexterminationmix(10×)0.2μl、iplexenzyme(33u/μl)0.041μl、延伸引物的混合液(1μm)0.94μl，水補足至9μl；反應(yīng)條件為：94℃30s；[94℃5s、(52℃5s、80℃5s)5個循環(huán)]40個循環(huán)；72℃3min，得延伸產(chǎn)物。
4)基因型檢測
在步驟3)的延伸產(chǎn)物中加入水41μl，潔凈樹脂15mg(96孔板)，顛倒搖勻15min進行脫鹽去離子防干擾處理，3200g離心5min，取上清液備用；利用massarraynanodispenserrs1000點樣儀將上清液點到384點spectrochip(芯片)上；將芯片置于massarraytyperworkstationma4中，利用maldi-tof(基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間)質(zhì)譜儀掃描芯片，掃描結(jié)果以typer4.0軟件分析并導(dǎo)出結(jié)果。
3、檢測結(jié)果比對
對獲得的snp標記檢測結(jié)果進行判定，其中檢測樣品中16個snp位點的檢測結(jié)果與龍江911指紋圖譜結(jié)果完全一致，判定該樣品為烤煙龍江911。
本發(fā)明使用的基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的massarray分子量陣列平臺可以針對16個snp位點設(shè)計16重pcr反應(yīng)和基因型檢測，實驗設(shè)計靈活，分型結(jié)果準確性高?？梢詫?6個snp位點同時進行396份樣本的檢測，檢測通量高。
試驗例
以24份已知品種樣品為例，采用實施例3中方法進行檢測鑒定，驗證該方法的特異性，檢測結(jié)果見下表4。表中參與檢測的樣品1～24依次為：烤煙k326、紅花大金元、中煙100、翠碧1號、云煙85、云煙87、云煙97、云煙100、nc95、龍江911、龍江981、秦?zé)?6、畢納1號、南江3號，香料煙云香巴斯瑪1號、云香2號、basma，白肋煙鄂煙1號、鄂煙3號、vam、burley-21，雪茄煙beinhart-1000、havana-10、florida-301。參與檢測的樣品中，烤煙k326、紅花大金元、中煙100、翠碧1號、云煙85、云煙87、云煙97、云煙100、龍江911、龍江981、秦?zé)?6、畢納1號、南江3號，香料煙云香巴斯瑪1號、云香2號，白肋煙鄂煙1號、鄂煙3號，均為近年來我國煙葉生產(chǎn)中推廣使用的主栽品種。
表424份已知品種樣品檢測結(jié)果
由表4可知，24份樣品中只有樣品10的snp位點檢測結(jié)果與龍江911的指紋圖譜結(jié)果完全一致，說明該檢測方法對烤煙龍江911具有特異性。
序列表
sequencelisting
<110>中國煙草總公司鄭州煙草研究院
<120>用于鑒定烤煙龍江911的引物組合及試劑盒、應(yīng)用及鑒定方法
<170>patentinversion3.5
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp01位點的基因序列（n為c或a）
<222>(1)..(201)
<400>1
cgtttttgtcccaattgggtttttcggcaaggttttagtaaggcaacagtggatcgtgtt60
aacttataattgaaggtcgttcacgaatcggtattaaaaantatgtttatagtatctgag120
atttctttacaatcaacctcgaatactagggaccctcagatattgaattgttttagcaag180
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<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp02位點的基因序列（n為c或t）
<222>(1)..(201)
<400>2
ttagatctgagattcgaggcgatggagggggatttgagaggatttgtttggagatttggg60
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<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp03位點的基因序列（n為c或t）
<222>(1)..(201)
<400>3
cgggaggtagagatgagaactttttatcagctagtagtggagatagctcggaggattgag60
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<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp04位點的基因序列（n為t或c）
<222>(1)..(201)
<400>4
gaatagacgccctctgccatgctgaaattgacccccatgaggagcacccccaaaactacc60
agatccacgaggcctcttggcctccctctccactcgctccngatggtgaatcaactctat120
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<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp05位點的基因序列（n為g或t）
<222>(1)..(201)
<400>5
accctgtcttcaccagctgggatatgcaacaacctccaccttctcctgcccaacaagaaa60
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<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp06位點的基因序列（n為c或a）
<222>(1)..(201)
<400>6
ggtcacatagacgatgtcgaactcacttagcagtactttccacttcgccaacttgccagt60
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gctcaaaaaaagaataccgag201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp07位點的基因序列（n為g或t）
<222>(1)..(201)
<400>7
cttttgagtaactccttgatgtacttatgttggtgtatcatggttcccttttctgtttgc60
ttgacttgaagccctaggaagaacttaattctcccattatnctcattttaaattcacttc120
ccattagttcagcaaatgcattgcaaagatattcgttcgtggctccaaaaatgatgccat180
ccacataaatttgcactttca201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp08位點的基因序列（n為c或t）
<222>(1)..(201)
<400>8
ggaagaaaggaaaaaaatgacttattggagtgaggctgcttgcatcaatggtcatgacat60
gcactttggattaataagcatagtccattcagtcaatcctntttcactcttcaccctttt120
atgcctgaggtttccataatctggttcctttgcaaagtcaacaaccttattcggcttgcg180
gtgccctgaaaggttttcacc201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp09位點的基因序列（n為g或a）
<222>(1)..(201)
<400>9
actctgaatttctaataaaataatcttgttttgattgtcacttaaaattggaaaaaactc60
tctatatactcccttccgggggtgtaggtaaaaaggaggtntggcaaagagcatatatgt120
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tatgtgctatgattcagtcat201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp10位點的基因序列（n為g或t）
<222>(1)..(201)
<400>10
tatcaccacctatacaacagcagtgaagggaactgatttagcttcccatgggattgaatc60
agttttgctaaagaaatttgaggagactcatacgagggganccctgatgtggtactcgct120
tttgctgagcattccatagactcctttgagatgttcgcagactctttcatcaaagcccat180
gccggggccagaaaggtccag201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp11位點的基因序列（n為t或g）
<222>(1)..(201)
<400>11
tggctttagcatagttatcgttatcaccttttcggccaacgtaaccatatctagcagctg60
aggattgtaaccaatgtagaacatcaaaattcttgtatganaaagctgtaactttaggaa120
accctcagacatgtgcaacacgaattgcttggtttgattccaagcgtcatcacgtggttc180
aggcagctttgaaactgcgta201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp12位點的基因序列（n為g或a）
<222>(1)..(201)
<400>12
ccggcatcgctacatgagcattagcctacactcgaggcgtagccaatgctatacgcggcg60
atgtccaccatacaccggcaaaagaaagcagcgttatgggnctttcatggtggtggccgc120
attctggtggtctggaataggcccaatgctgactccaattgataactctcaacgagagta180
ttcgatagtattggtatgaac201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp13位點的基因序列（n為t或c）
<222>(1)..(201)
<400>13
gttttcagggtaatcagaatgaatttggaagaacaactctcaatttgaagtttgaaattt60
gaaaggtttgaccaagattttgatttgttagcatatgattntgtatcggaatttttatga120
tttggttagccccgttaggatatttgggacttatgagcgtgatcggaatgcattttagaa180
gtccgtggaaggtttaggctt201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp14位點的基因序列（n為t或a）
<222>(1)..(201)
<400>14
atcaagaaaacattttgacatttctttttgacactgtttcttggatcggagaacatattt60
ttcttctgcaacaaatagaagactttattctctcatatttntattcaagtaatagggaga120
aacatagtctgtgaggaattatgtatcaaaaaagggtattccttttgagtgtgtaatagc180
ctcaatgaatttgtgatgctt201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp15位點的基因序列（n為a或g）
<222>(1)..(201)
<400>15
tcaacctcttatgaccaagaaaccgtaaggccttatattcatcaaattaaggatgtcgac60
cagcagctttgccacagagaagagcattggtaggtatgtcntattcgtttgctaaactgg120
gcgttggattatagacccttaggtaaacttgctgtccaagatattgcctatcccacattg180
aagacctcaaattccacatac201
<211>201
<212>dna
<213>序列
<221>包含fp16位點的基因序列（n為g或a）
<222>(1)..(201)
<400>16
cgtatgtttaatcgagtgagtgattcgaactcgaagtagtgtagcccgtaggtgtaatga60
tcgagtgagtgttagctcgaactcaaaataaaagtagcccntaggcttaatgatcgagtc120
atttttgagatataaaccaatatggaaaggttgtaccttagcaatagtaccgttttagat180
gtgatacattccaactgcttg201
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp01-f
<222>(1)..(30)
<400>17
acgttggatggaaggtcgttcacgaatcgg30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp01-r
<222>(1)..(30)
<400>18
acgttggatggtccctagtattcgaggttg30
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp01-e
<222>(1)..(23)
<400>19
agttcacgaatcggtattaaaaa23
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp02-f
<222>(1)..(30)
<400>20
acgttggatgagatttgggatgaggaggtg30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp02-r
<222>(1)..(30)
<400>21
acgttggatgttgaaatcccaccgctactg30
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp02-e
<222>(1)..(16)
<400>22
agcactaccaccaacc16
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp03-f
<222>(1)..(30)
<400>23
acgttggatgattgagggttaccgtcagag30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp03-r
<222>(1)..(30)
<400>24
acgttggatgctaaactccccagaataacg30
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp03-e
<222>(1)..(16)
<400>25
cagatgcagagggaca16
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp04-f
<222>(1)..(30)
<400>26
acgttggatgccaaaactaccagatccacg30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp04-r
<222>(1)..(30)
<400>27
acgttggatgttgctagggacatagagttg30
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp04-e
<222>(1)..(15)
<400>28
ctctccactcgctcc15
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp05-f
<222>(1)..(30)
<400>29
acgttggatgacccactcaagcagaagaac30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp05-r
<222>(1)..(30)
<400>30
acgttggatgtggatgtgttcttcctcctc30
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp05-e
<222>(1)..(21)
<400>31
ggattcttgttgttgcatgtt21
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp06-f
<222>(1)..(30)
<400>32
acgttggatgcaacttgccagtaggcatag30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp06-r
<222>(1)..(30)
<400>33
acgttggatgatgcatacaccacatacctc30
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp06-e
<222>(1)..(19)
<400>34
accacatacctcatattga19
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp07-f
<222>(1)..(30)
<400>35
acgttggatggtttgcttgacttgaagccc30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp07-r
<222>(1)..(30)
<400>36
acgttggatgtgctgaactaatgggaagtg30
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp07-e
<222>(1)..(24)
<400>37
tgaagaacttaattctcccattat24
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp08-f
<222>(1)..(30)
<400>38
acgttggatgggtcatgacatgcactttgg30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp08-r
<222>(1)..(30)
<400>39
acgttggatgacctcaggcataaaagggtg30
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp08-e
<222>(1)..(17)
<400>40
aagggtgaagagtgaaa17
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp09-f
<222>(1)..(30)
<400>41
acgttggatgtctctatatactcccttccg30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp09-r
<222>(1)..(30)
<400>42
acgttggatgcacgagtttaccgtcatcac30
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp09-e
<222>(1)..(22)
<400>43
atcacatatatgctctttgcca22
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp10-f
<222>(1)..(30)
<400>44
acgttggatgttcccatgggattgaatcag30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp10-r
<222>(1)..(30)
<400>45
acgttggatgtcagcaaaagcgagtaccac30
<211>17
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp10-e
<222>(1)..(17)
<400>46
atactcatacgagggga17
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp11-f
<222>(1)..(30)
<400>47
acgttggatgagcagctgaggattgtaacc30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp11-r
<222>(1)..(30)
<400>48
acgttggatgtgcacatgtctgagggtttc30
<211>24
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp11-e
<222>(1)..(24)
<400>49
ccgttttcctaaagttacagcttt24
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp12-f
<222>(1)..(30)
<400>50
acgttggatgacaccggcaaaagaaagcag30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp12-r
<222>(1)..(30)
<400>51
acgttggatgagtcagcattgggcctattc30
<211>16
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp12-e
<222>(1)..(16)
<400>52
gccaccaccatgaaag16
<211>29
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp13-f
<222>(1)..(29)
<400>53
acgttggatgtttgaaaggtttgaccaag29
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp13-r
<222>(1)..(30)
<400>54
acgttggatgagtcccaaatatcctaacgg30
<211>25
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp13-e
<222>(1)..(25)
<400>55
gattttgatttgttagcatatgatt25
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp14-f
<222>(1)..(30)
<400>56
acgttggatgtgtttcttggatcggagaac30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp14-r
<222>(1)..(30)
<400>57
acgttggatgtcacagactatgtttctccc30
<211>26
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp14-e
<222>(1)..(26)
<400>58
atagaagactttattctctcatattt26
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp15-f
<222>(1)..(30)
<400>59
acgttggatgagctttgccacagagaagag30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp15-r
<222>(1)..(30)
<400>60
acgttggatggtctataatccaacgcccag30
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp15-e
<222>(1)..(20)
<400>61
cccagtttagcaaacgaata20
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp16-f
<222>(1)..(30)
<400>62
acgttggatggagtgttagctcgaactcaa30
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp16-r
<222>(1)..(30)
<400>63
acgttggatgtgctaaggtacaacctttcc30
<211>22
<212>dna
<213>人工序列
<221>引物fp16-e
<222>(1)..(22)
<400>64
catgactcgatcattaagccta22