本發(fā)明屬于生物基因工程
技術領域：
，具體涉及一種重組羊長效干擾素τ及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法。
背景技術：
：由病毒引起的動物傳染性疾病嚴重制約了各個國家和地區(qū)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，中國是世界上羊存欄量、出欄量、羊肉產(chǎn)量最多的國家，肉羊產(chǎn)業(yè)也是我國畜牧業(yè)的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。隨著羊養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)發(fā)展，不可避免的要面對病毒引起的疾病的問題，畜類疾病不僅給羊養(yǎng)殖者造成巨大的經(jīng)濟損失，更為嚴重的是，一些人獸共患傳染性疾病還給人類健康帶來潛在威脅。目前羊類傳染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和藥物治療，由于疫苗免疫的血清型單一，而病毒的血清型復雜，毒株變異快，常導致疫苗免疫失敗。一些病毒病目前尚無疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人類的健康。常用的藥物治療主要采用抗生素進行治療，但是近年來由于抗生素的廣泛和大量使用，導致耐藥性菌株大量產(chǎn)生，并通過食物鏈傳染給人，給人類健康帶來更大的威脅?，F(xiàn)在一些國家己明令禁止一些抗生素和抗菌劑在養(yǎng)殖業(yè)中的應用。因此，使用干擾素來積極治療和預防家畜、家禽的病毒性疾病將是人類最為關注的問題。ifn是一類病毒感染誘導機體產(chǎn)生具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，1957年issacs和lindeman首先發(fā)現(xiàn)，它是一類多功能的細胞因子，與細胞受體結合后，可誘導機體產(chǎn)生多種特異性蛋白質(zhì)和酶類，主要通過抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄和降解病毒rna來抑制病毒的生長繁殖以及發(fā)揮抗腫瘤等的活性。按照ifn的產(chǎn)生細胞、生化特征及在機體免疫方面所發(fā)揮作用的不同，分為α、β、γ三類?，F(xiàn)已知，α型ifn在體內(nèi)可有選擇性地作用于病毒等感染細胞，通過抑制受染細胞內(nèi)的病毒蛋白質(zhì)的生物合成，發(fā)揮廣譜和高效抗病毒作用。γ型ifn是由激活的t細胞和nk細胞產(chǎn)生，具有較強抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能。大量研究表明，干擾素γ除了具有廣譜抗病毒功能外，對免疫系統(tǒng)也起著關鍵的調(diào)節(jié)作用，所以ifn-γ又稱為免疫調(diào)節(jié)干擾素。雖然各種類型的干擾素均能夠介導細胞對病毒感染的反應，但干擾素γ的免疫調(diào)節(jié)活性在協(xié)調(diào)免疫反應和確定機體長期的抗病毒狀態(tài)中發(fā)揮更為重要的作用，因此干擾素γ具有極為重要的臨床應用價值。干擾素τ(interferontau，ifn-τ)最初被稱為滋養(yǎng)層蛋白，由滋養(yǎng)層分泌的一類新型的i型ifn，是反芻動物母體妊娠識別的孕體信號，在黃體維持和妊娠建立過程中發(fā)揮重要的生物學功能。干擾素τ具有ⅰ型干擾素的共同特性:具有抗病毒、抗細胞增生、免疫調(diào)節(jié)等功能。ifn-τ在生物學功能方面有自身特點，它僅在胚胎滋養(yǎng)層細胞中表達，無需病毒誘導，而且比ifn-α或ifn-β更少的細胞毒性?；谄涮赜械纳飳W活性及低細胞毒性，為許多疾病的治療帶來新的希望。天然干擾素及人工重組干擾素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般為2-4個小時。半衰期短給治療帶來了極大的不便，治療次數(shù)的增加，相應的時間成本及經(jīng)濟成本隨之增加，而機體的耐受極限也有可能被突破導致不良反應的產(chǎn)生。半衰期短的主要原因有兩個：干擾素的分子量過小在體內(nèi)代謝過快，干擾素尤其是重組干擾素親和力較差被免疫系統(tǒng)清除。而市面上常見的長效干擾素以聚乙二醇融合干擾素為代表，僅在分子量的層面上部分解決了干擾素分子量小而導致半衰期短的問題，同時聚乙二醇融合干擾素成本非常高，不利于在家畜臨床上應用。技術實現(xiàn)要素：為解決上述技術問題，本發(fā)明提供了一種重組羊長效干擾素τ及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法，所述重組羊長效干擾素可顯著提高羊干擾素的半衰期，較普通羊干擾素的半衰期提高10倍以上，并具有廣譜抗病毒作用并能提高羊自身的免疫應答。本發(fā)明采取的技術方案為：一種由羊干擾素γ與羊干擾素τ組成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如sequencelisting400〈1〉所示。本發(fā)明還提供了編碼上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示，記為基因組1；或如sequencelisting400〈3〉所示，記為基因組2。所述基因組1和所述基因組2均可編碼所述融合蛋白?；蚪M2是對基因組1的核苷酸序列進行優(yōu)化之后的結果，通常密碼子適應指數(shù)cai＝1.0時被認為該基因在該表達系統(tǒng)中為最優(yōu)的高效表達狀態(tài)，cai值越低表明在宿主中表達水平越低?；蛑術c含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區(qū)域內(nèi)超過該范圍均會影響翻譯和轉(zhuǎn)錄效率。利用軟件檢測發(fā)現(xiàn)羊ifn-γ和ifn-τ原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應指數(shù)(cai)分別為0.25、0.27，gc百分比為40.9％、54.4％；而通過對羊ifn-γ和ifn-τ基因優(yōu)化后得到重組基因在大腸桿菌中密碼子適應指數(shù)(cai)為1.0、1.0，gc百分比44.1％、53.1％。通過基因優(yōu)化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對蛋白表達的影響，改善了基因的gc含量，提高了轉(zhuǎn)錄翻譯效率。本發(fā)明還提拱了含有基因組1或基因組2的表達載體。進一步地，所述表達載體為含有基因組1或基因組2的pet-32a大腸桿菌表達載體。本發(fā)明還提供了含有基因組1或基因組2的基因工程菌。進一步地，所述基因工程菌為pet-32a/rifnγ-ifnτ。含有基因組1或基因組2的宿主細胞也屬于本發(fā)明的保護范圍，進一步地，所述宿主細胞為大腸桿菌宿主細胞，更進一步地，所述大腸桿菌宿主細胞為bl21(de3)感受態(tài)細胞或帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞。本發(fā)明還提供了一種重組羊長效干擾素τ，所述重組羊長效干擾素τ由所述的融合蛋白與凍干保護劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥而成。所述凍干保護劑為甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs為緩沖液，三者的終濃度為甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。本發(fā)明還公開了所述融合蛋白的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：將含有基因組1或基因組2的表達載體導入到大腸桿菌宿主細胞中，獲得基因工程菌，基因工程菌經(jīng)iptg誘導表達后得到所述融合蛋白的粗品，經(jīng)純化后即可得到融合蛋白。所述表達載體為含有基因組1或基因組2的pet-32a大腸桿菌表達載體；所述基因工程菌為pet-32a/rifnγ-ifnτ，其制備方法為：(1)設計引物，通過反轉(zhuǎn)錄得到或者人工合成連接有柔性linker序列的羊干擾素γ和羊干擾素τ的目的基因；通過柔性linker將羊干擾素γ和羊干擾素τ的目的基因連接起來，目的基因的核苷酸序列表如sequencelisting400〈2〉所示或如sequencelisting400〈3〉所示；(2)將連接后的目的基因連接到pet-32a質(zhì)粒上獲得表達載體；(3)將表達載體導入到大腸桿菌宿主細胞中，即可得到基因工程菌pet-32a/rifnγ-ifnτ。所述大腸桿菌宿主細胞為bl21(de3)感受態(tài)細胞或帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號為v205。所述基因組1的獲取方法為：a.引物設計羊干擾素γ(ifn-γ)的引物序列為：上游ifn-γ-f1：ccggaattcatgaaatacacaagctc，帶有ecori酶切位點；下游ifn-γ-r1：accaccaccagaaccaccaccacccattgatgctctccg，帶有柔性linker；羊干擾素τ(ifn-τ)的引物序列為：上游ifn-τ-f1：ggtggttctggtggtggtggttctatggccttcgtgc，帶有柔性linker；下游ifn-τ-r1：ccctcgagtcaaggtgagttc，帶有xhoi酶切位點；b.從羊肝臟中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得ifn-γ和ifn-τ的目的基因，兩者的基因序列分別如sequencelisting400〈4〉和sequencelisting400〈5〉所示；分別以ifn-γ和ifn-τ的目的基因為模板，并分別利用ifn-γ和ifn-τ的上下游引物進行pcr擴增，分別得到連接有柔性linker的ifn-γ和ifn-τ的目的基因。pcr反應體系及條件為：在25μl的總反應體系中，模板rna1.5μl，上下游引物各0.5μl，反轉(zhuǎn)錄酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反應的反應條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預變性4min，進入循環(huán)；95℃變性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker將ifn-γ基因與ifn-τ基因連接起來連接的pcr反應體系及反應條件為：在25μl的總反應體系中，連接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-α模板dnai1μl，ifn-γ上游引物0.5μl，ifn-τ下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為9μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應條件為：95℃預變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min?；蚪M2是對基因組1進行優(yōu)化之后，人工合成的基因，所述基因組2的獲取方法為：a.引物設計羊干擾素γ(ifn-γ)的引物序列為：上游ifn-γ-f2：cgggatccatgaaatacacctcttct，帶有bamhi酶切位點；下游ifn-γ-r2：accaccaccagaaccaccaccacccatagaagcacgacg；帶有柔性linker；羊干擾素τ(ifn-τ)的引物序列為：上游ifn-τ-f2：ggtggttctggtggtggtggttctatggctttcgttctg，帶有柔性linker；下游ifn-τ-r2：ccctcgagttacggagagttc，帶有xhoi酶切位點；b.所述ifn-γ和ifn-τ的目的基因，兩者的基因序列分別如sequencelisting400〈6〉和sequencelisting400〈7〉所示；分別以ifn-γ和ifn-τ的目的基因為模板，并分別利用ifn-γ和ifn-τ的上下游引物進行pcr擴增。分別得到連接有柔性linker的優(yōu)化后的ifn-γ和ifn-τ的目的基因。pcr反應體系及條件為：在25μl的總反應體系中，基因組dna1.0μl，上下游引物各0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為10μl，加rnasefree水至25μl；所述rt-pcr反應的反應條件為：95℃預變性4min，進入循環(huán)；95℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10min。c.利用柔性linker將ifn-γ基因與ifn-τ基因連接起來連接的pcr反應體系及反應條件為：在25μl的總反應體系中，連接有柔性linker的ifn-γ模板dna1μl，連接有柔性linker的ifn-α模板dna1μl，ifn-γ上游引物0.5μl，ifn-τ下游引物0.5μl，taqdna聚合酶2.5μl，dntpmix為9μl，加rnasefree水至25μl；連接pcr反應條件為：95℃預變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。本發(fā)明還提供了所述重組羊長效干擾素τ的應用，其半衰期長達41小時以上，具有廣譜抗病毒作用并能提高羊自身的免疫應答。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1.通過柔性linker將羊干擾素γ和羊干擾素τ基因?qū)崿F(xiàn)融合，提高了干擾素半衰期，與普通干擾素相比，提高了10倍以上；2.通過對羊干擾素γ和羊干擾素τ基因進行優(yōu)化，提高了干擾素γ和羊干擾素τ融合蛋白的表達量；3.以重組大腸桿菌bl21/pet-32a-ifnγ-ifnτ作為表達菌株，通過引入分子伴侶pgro7質(zhì)粒，在蛋白表達時不產(chǎn)生包涵體，形成可溶性蛋白，避免了包涵體變性和復性的過程，大大縮短了融合蛋白表達的時間；4.本發(fā)明公開的由羊干擾素γ和羊干擾素τ組成的融合蛋白不僅具有干擾素τ的廣譜抗病毒作用，同時顯著提高了羊自身的免疫應答。附圖說明圖1為實施例1中的羊干擾素γ基因與羊干擾素τ基因rt-pcr擴增的結果；泳道m(xù)：dnamarkerdl2000；泳道1：羊干擾素γ基因rt-pcr擴增產(chǎn)物；泳道2：羊干擾素τ基因rt-pcr擴增產(chǎn)物；圖2為實施例1中的羊ifn-γ和羊ifn-τ的目的基因連接之后的pcr擴增的結果；泳道m(xù)：dnamarkerdl2000；泳道1：羊干擾素γ基因與羊干擾素τ基因連接擴增產(chǎn)物；圖3為實施例1中的陽性克隆質(zhì)粒的pcr擴增及雙酶切鑒定結果；泳道m(xù)：dnamarkerdl10000；泳道1：質(zhì)粒pcr結果；泳道2：重組質(zhì)粒雙酶切結果；圖4為實施例1中的重組蛋白的sds-page電泳檢查結果；泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：空菌對照；泳道2：重組菌誘導后的菌體破碎后上清；泳道3：重組菌誘導后的菌體破碎后沉淀；圖5為實施例1得到的融合蛋白的westernblot鑒定結果；泳道m(xù)：蛋白marker；泳道1：重組菌誘導破碎后沉淀；泳道2：為重組菌誘導破碎后上清；圖6為實施例5中由實施例1中的融合蛋白制得的重組羊長效干擾素τ對vsv致細胞病變的抑制作用；1為vsv病毒對照孔；2為hep-2細胞對照孔；a3-12為梯度稀釋(從右向左)的人干擾素標準品處理孔；b3-12為梯度稀釋(從右向左)的重組羊長效干擾素τ處理孔；圖7為實施例8中由實施例1中的融合蛋白制得的重組羊長效干擾素τ肌肉注射血藥濃度-時間變化曲線。具體實施方式實施例1一種由羊干擾素γ與羊干擾素τ組成的融合蛋白，其制備方法如下：1.羊干擾素γ(ifn-γ)與羊干擾素τ(ifn-τ)目的基因的獲取與擴增引物設計：根據(jù)genebank中已報道的目的基因序列設計合成引物見表1，在羊干擾素γ的上游引物和下游引物中分別引入ecori酶切位點和linker序列，在羊干擾素τ的上游引物和下游引物中分別引入linker序列和xhoi酶切位點。表1pcr擴增引物rt-pcr獲取目的基因：從羊肝臟組織中提取rna，通過反轉(zhuǎn)錄獲得ifn-γ和ifn-τ的目的基因，兩者的基因序列分別如sequencelisting400〈4〉和sequencelisting400〈5〉所示；rt-pcr反應體系(25μl)見表2表2rt-pcr反應體系rnasefree水10μldntpmix10μl反轉(zhuǎn)錄酶2.5μl上、下游引物各0.5μl基因組rna1.5μl反應參數(shù)為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min，95℃預變性4min，進入循環(huán)：95℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。rt-pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在530bp和620bp左右出現(xiàn)特異條帶，其結果如圖1所示，說明成功制備得到了分別連接有柔性linker的犬干擾素γ的目的基因與犬干擾素τ的目的基因。2.目的基因的連接將目的基因均稀釋到10ug/ml，利用重疊pcr連接連段目的基因，25μl反應體系如表3所示：表3pcr反應體系反應參數(shù)為：95℃預變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1110bp左右出現(xiàn)特異條帶，其結果如圖2所示，得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈2〉所示。3.表達載體構建選擇連接后的目的基因經(jīng)測序后無誤的pcr膠回收產(chǎn)物與pet-32a質(zhì)粒均使用ecori和xhoi限制性內(nèi)切酶進行雙酶切和回收，按表4中的20μl體系做雙酶切：表4雙酶切體系通用buffer2μl限制性內(nèi)切酶(一對)1μl+1μl載體或回收片段2ulrnasefree水14μl將連接后的目的基因與pet-32a質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物按表5中的體系進行連接，4℃過夜連接：表5轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，將感受態(tài)涂布于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過夜；取lb平板上生長的菌落經(jīng)pcr鑒定目的基因，陽性克隆菌質(zhì)粒經(jīng)ecori和xhoi雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達載體構建成功，得到工程菌pet-32a/rifnγ-ifnτ；pcr擴增和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1110bp左右處出現(xiàn)單一條帶，其結果如圖3所示。4.重組蛋白的表達挑取工程菌pet-32a/rifnγ-ifnτ于含氨芐青霉素100μg/ml的lb培養(yǎng)基中37℃搖菌1h復蘇工程菌活性，在lb培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中放大培養(yǎng)4h后，測od值達到1.0時即可；加入iptg，32℃誘導表達(終濃度100μg/ml)5h；收集細菌，經(jīng)sds-page電泳檢測，重組菌誘導5h后的菌體破碎后上清和沉淀在59.1kd左右處可見優(yōu)勢表達條帶，其結果如圖4所示，從圖中可以看出，重組菌誘導5h后的菌體破碎后上清和沉淀在59.1kd左右處可見優(yōu)勢表達條帶，說明在沉淀和上清中均成功表達了融合蛋白。加入質(zhì)量體積比1:1的pbs重懸沉淀；-20℃于室溫反復凍融沉淀3次；4℃超聲裂解細菌沉淀，工作10s，間隔3s，超聲6min，整個過程重復3～4次；4℃，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白純化5.1his親和層析粗制融合蛋白用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在aktaexplorer100蛋白純化系統(tǒng)上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his親和層析柱，用pbs緩沖液洗去未結合的蛋白，直到a280nm穩(wěn)定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羥甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集ril2-ifnτ蛋白峰。5.2deae陰離子交換層析將經(jīng)過his親和層析純化后收集的蛋白置換到bindingbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上樣通過用bindingbufferⅱ平衡好的deae陰離子交換層析柱，再用bindingbufferⅱ過柱至a280nm值穩(wěn)定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)線性梯度洗脫，收集ril2-ifnτ蛋白峰。5.3分子篩層析將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子篩層析柱，用bindingbufferⅲ洗脫，收集rifnγ-ifnτ蛋白峰5.4樣品鑒定：測定rifnγ-ifnτ效價及比活性，比活性≥1.0×106iu/mg蛋白為合格；無菌分裝，-80℃保存。即可得到由羊干擾素γ與羊干擾素τ組成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。實施例2一種由羊干擾素γ與羊干擾素τ組成的融合蛋白，其他同實施例1，只是將其中的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞替換為了帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞。其融合蛋白的sds-page電泳結果同實施例1對照，上清液中59kd左右處優(yōu)勢表達條帶較粗，說明引入分子伴侶pgro7后，目的蛋白在上清液中的表達更好，得到的融合蛋白量更高。大腸桿菌表達的蛋白大部分存在于包涵體中；通過在表達菌株中引入分子伴侶，協(xié)同表達蛋白正確折疊，達到蛋白可溶性表達。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號v205。實施例3一種由羊干擾素γ與羊干擾素τ組成的融合蛋白，其制備方法如下：1.羊干擾素γ(ifn-γ)與羊干擾素τ(ifn-τ)目的基因的獲取與擴增對實施例1中的ifn-γ和ifn-τ進行優(yōu)化，人工合成ifn-γ和ifn-τ目的基因，優(yōu)化后，兩者的核苷酸序列分別如sequencelisting400〈6〉和sequencelisting400〈7〉所示。1.1密碼子優(yōu)化遺傳密碼子有64種，但是絕大多數(shù)生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最佳密碼子(optimalcodons)，那些不被經(jīng)常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子(rareorlow-usagecodons)。實際上，常用做蛋白表達或生產(chǎn)的每種生物(包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，植物細胞和昆蟲細胞)都表現(xiàn)出某種程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母和果蠅中對含最佳密碼子的基因的表達效率明顯高于含低利用率的密碼子的基因的表達效率。因此，在異源表達系統(tǒng)中，密碼子的偏愛性很大程度上影響了重組蛋白的表達。利用偏愛密碼子(preferredcodons)并避免利用稀有的密碼子進行基因合成，這種基因的重新設計叫密碼子優(yōu)化。因此，本實施例中對羊的ifn-γ和ifn-τ基因密碼子進行優(yōu)化。1.2密碼子優(yōu)化后結果分析通常密碼子適應指數(shù)(cai)＝1.0時被認為該基因在該表達系統(tǒng)中的最優(yōu)的高效表達狀態(tài)，cai值越低表明在宿主中表達水平越低?；蛑術c含量最理想分布范圍為30～70％，在任何區(qū)域內(nèi)超過該范圍均會影響翻譯和轉(zhuǎn)錄效率。利用軟件檢測發(fā)現(xiàn)羊ifn-γ和ifn-τ原始基因的密碼子在大腸桿菌中密碼子適應指數(shù)(cai)分別為0.25、0.27，gc百分比為40.9％、54.4％；而通過對羊ifn-γ和ifn-τ基因優(yōu)化后得到重組基因在大腸桿菌中密碼子適應指數(shù)(cai)為1.0、1.0，gc百分比44.1％、53.1％。通過基因優(yōu)化顯著降低了低密碼子的使用率，避免了稀有密碼子對蛋白表達的影響，改善了基因的gc含量，提高了轉(zhuǎn)錄翻譯效率。1.3引物設計：表6pcr擴增引物將優(yōu)化后的ifn-γ和ifn-τ的基因組dna分別稀釋至0.05mg/ml。利用pcr擴增獲得目的基因，25μl反應體系如表7所示：表7pcr反應體系反應參數(shù)為：95℃預變性4min，進入循環(huán)：95℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在530bp和620bp左右出現(xiàn)特異條帶，說明制備得到了分別連接有柔性linker的優(yōu)化后的ifn-γ和ifn-τ的目的基因。2.目的基因的連接將目的基因均稀釋到10ug/ml，利用重疊pcr連接連段目的基因，25μl反應體系如表8所示：表8pcr反應體系反應參數(shù)為：95℃預變性4min，進入循環(huán)：94℃變性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1110bp左右出現(xiàn)特異條帶，說明成功得到了ifn-γ和ifn-τ連接后的目的基因。得到的目的基因的核苷酸序列如sequencelisting400〈3〉所示。3.表達載體構建選擇連接后的目的基因經(jīng)測序后無誤的pcr的膠回收產(chǎn)物與pet-32a質(zhì)粒均使用bamhi、xhoi限制性內(nèi)切酶進行雙酶切和回收，按表9中的20μl體系做雙酶切：表9雙酶切體系通用buffer2μl限制性內(nèi)切酶(一對)1μl+1μl載體或回收片段2ulrnasefree水14μl將連接后的目的基因與pet-32a質(zhì)粒的酶切回收產(chǎn)物按表10中的體系進行連接，4℃過夜連接：表10目的片段dna10μl表達載體3μlbuffer2μl連接酶1μlrnasefree水4μl轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物至大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞中，將感受態(tài)涂布于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基平板培養(yǎng)過夜；取lb平板上生長的菌落經(jīng)pcr鑒定目的基因，陽性克隆菌質(zhì)粒經(jīng)bamhi、xhoi雙酶切鑒定，鑒定為陽性者表示表達載體構建成功，得到工程菌pet-32a/rifnγ-ifnτ；pcr擴增和雙酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳在1110bp左右處出現(xiàn)單一條帶，說明含有ifn-γ和ifn-τ連接后的目的基因的表達載體構建成功。4.重組蛋白的表達挑取工程菌pet-32a/rifnγ-ifnτ于含氨芐青霉素100μg/ml的lb培養(yǎng)基中37℃搖菌1h復蘇工程菌活性，在lb培養(yǎng)基(含氨芐青霉素100μg/ml)中放大培養(yǎng)4h后，測od值達到1.0時即可；加入iptg，32℃誘導表達(終濃度100μg/ml)5h；收集細菌，經(jīng)sds-page電泳檢測，重組菌誘導5h后的菌體破碎后上清和沉淀在59.1kd左右處可見優(yōu)勢表達條帶，說明在上清和沉淀中均得到了重組蛋白。加入質(zhì)量體積比1:1的pbs重懸沉淀；-20℃于室溫反復凍融沉淀3次；4℃超聲裂解細菌沉淀，工作10s，間隔3s，超聲6min，整個過程重復3～4次；4℃，12000r/min離心15min，分別取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。5.融合蛋白純化5.1his親和層析粗制融合蛋白用0.22μm孔徑的濾膜過濾后，上樣通過連接在aktaexplorer100蛋白純化系統(tǒng)上，用bindingbufferⅰ(pbs)平衡好的his親和層析柱，用pbs緩沖液洗去未結合的蛋白，直到a280nm穩(wěn)定，再用elutionbufferⅰ(50mm三羥甲基氨基甲烷，20～500mm咪唑，ph8.0)洗脫，收集rifnγ-ifnτ蛋白峰。5.2deae陰離子交換層析將經(jīng)過his親和層析純化后收集的蛋白置換到bindingbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，ph6.5)中后，上樣通過用bindingbufferⅱ平衡好的deae陰離子交換層析柱，再用bindingbufferⅱ過柱至a280nm值穩(wěn)定后，用elutionbufferⅱ(50mm三羥甲基氨基甲烷，1mnacl，ph6.5)線性梯度洗脫，收集rifnγ-ifnτ蛋白峰。5.3分子篩層析將離子交換層析收集到的樣品濃縮后上樣通過用bindingbufferⅲ(50mmna2hpo4，0.15mnacl，ph7.4)平衡好superdex200分子篩層析柱，用bindingbufferⅲ洗脫，收集rifnγ-ifnτ蛋白峰。5.4樣品鑒定測定rifnγ-ifnτ效價及比活性，比活性≥1×106iu/mg蛋白為合格；無菌分裝，-80℃保存。即可得到由羊干擾素γ與羊干擾素τ組成的融合蛋白，其氨基酸序列如sequencelisting400〈1〉所示。實施例4一種由羊干擾素γ與羊干擾素τ組成的融合蛋白，其他同實施例3，只是將其中的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細胞替換為了帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞。其融合蛋白的sds-page電泳結果同實施例3對照，上清液中59.1kd左右處優(yōu)勢表達條帶較粗，說明引入分子伴侶pgro7后，目的蛋白在上清液中的表達更好，得到的融合蛋白量更高。大腸桿菌表達的蛋白大部分存在于包涵體中；通過在表達菌株中引入分子伴侶，協(xié)同表達蛋白正確折疊，達到蛋白可溶性表達。所述帶有pgro7質(zhì)粒的bl21(de3)感受態(tài)細胞購自上海近岸科技有限公司/欣百諾生物，貨號v205。實施例5一種重組羊長效干擾素τ，由實施例1、2、3、4中的融合蛋白分別與凍干保護劑混配之后，經(jīng)冷凍干燥而成。所述凍干保護劑為甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/lpbs為緩沖液，三者的終濃度為甘油100ml/l、甘露醇0.12g/ml和蔗糖0.025g/ml。實施例6實施例1～4得到由羊干擾素γ與羊干擾素τ組成的融合蛋白的鑒定6.1蛋白含量的定量檢測用lowry法，以中國食品藥品生物制品檢定院的標準蛋白作標準測定，測定實施例1～4得到的融合蛋白濃度均大于1.2mg/ml。6.2sds-page電泳檢測與空菌相比，融合蛋白在59.1kd左右有一條濃染的新增蛋白條帶，如圖4所示。6.3westernblot結果分別檢測實施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗羊τ干擾素(1:5000稀釋)為一抗，以山羊抗小鼠igg-hrp為二抗(1:10000稀釋)。重組羊長效干擾素τ樣品能與抗羊干擾素τ單克隆抗體發(fā)生特異性反應，59.1kd左右處出現(xiàn)特異性條帶，如圖5所示。實施例7實施例5中的四份重組羊長效干擾素τ凍干劑的效價檢測按照微量細胞病變抑制法，用培養(yǎng)基將hep-2細胞配成5×105細胞/ml細胞懸浮液，每孔接種0.1ml移入96孔細胞培養(yǎng)板。37℃、5％co2培養(yǎng)24h，加入不同劑量的重組羊長效干擾素τ，24h后吸棄，再分別接種100tcid50vsv病毒。試驗結果結果表明獲得的重組羊長效干擾素τ對vsv引起hep-2細胞的病變具有明顯的抑制作用。未經(jīng)處理的細胞接種病毒后均出現(xiàn)細胞變圓、脫落、崩解等病變。而獲得的重組羊長效干擾素τ處理后的細胞接種病毒后，在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察，細胞形態(tài)正常，未出現(xiàn)任何病變，測得效價≥1.0×106iu/ml，如圖6所示。實施例8重組羊長效干擾素τ在羊體內(nèi)的半衰期的測定實施例5中的分別由實施例1～4的融合蛋白得到的四份重組羊長效干擾素τ凍干劑(分別記為a、b、c、d)在羊體內(nèi)的半衰期的測定細胞病變抑制法測定rifnγ-ifnτ的血藥濃度與時間關系取六只體重大致相同的羊(雌雄各半)，頸部皮下注射2mg/ml重組羊長效干擾素τ凍干劑2ml，分別在1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h、72h靜脈采血，血樣4℃凝固，3500rpm低溫離心10min分離血清，各時點每只羊血樣于-20℃保存待測。采用細胞病變抑制法測定血清樣品中rifnγ-ifnτ的濃度，用das藥動學軟件進行曲線擬合并計算參數(shù)。a的擬合曲線如圖7所示；參數(shù)計算結果見表11。表11重組羊長效干擾素τ肌肉注射后血清中主要動力學參數(shù)結果表明重組羊長效干擾素τ有較長的半衰期。經(jīng)測定半衰期能達到41h左右，較普通干擾素提高約10倍。實施例9實施例5中的四份重組羊長效干擾素τ凍干劑對羊細胞免疫應答影響的測定取六只體重大致相同的仔羊分為兩組，記為實驗組和對照組；實驗組頸部皮下注射2mg/ml重組羊長效干擾素τ凍干劑2ml，對照組頸部皮下注射2ml的pbs，取注射4周后羊外周血，之后每周取一次血，使用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，淋巴細胞經(jīng)過無血清rpmi1640培養(yǎng)基洗2次后，用完全培養(yǎng)基重懸、調(diào)整細胞濃度為2×106個/ml，24孔細胞培養(yǎng)板每孔加入1ml淋巴細胞，37℃，5％co2培養(yǎng)72h，收集淋巴細胞培養(yǎng)時上清。elisa檢測培養(yǎng)上清中il-2、il-4含量，按試劑盒說明書進行，檢測結果如表12所示：表12elisa檢測各組羊細胞免疫應答水平結果表明注射重組羊長效干擾素τ后，能夠顯著提高羊外周血中細胞因子il-2、il-4的含量，增強了細胞免疫應答水平，顯著提高免疫力水平。上述參照實施例對重組羊長效干擾素τ及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法進行的詳細描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個實施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構思下的變化和修改，應屬本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>蕪湖英特菲爾生物制品產(chǎn)業(yè)研究院有限公司<120>一種重組羊長效干擾素τ及制備此長效干擾素的融合蛋白及其制備方法<130>1<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>371<212>prt<213>重組羊長效干擾素τ融合蛋白<400>1metlystyrthrserserpheleualaleuleuleucysvalleuleu151015glypheserglysertyrglyglnglyprophephelysgluileglu202530asnleulysglutyrpheasnalaserasnproaspvalalalysgly354045glyproleuphesergluileleulysasntrplysglugluserasp505560lyslysileileglnserglnilevalserphetyrphelysleuphe65707580gluasnleulysaspasnglnvalileglnargsermetaspileile859095lysglnaspmetpheglnlyspheleuasnglyserserglulysleu100105110gluaspphelysargleuileglnileprovalaspaspleuglnile115120125glnarglysalaileasngluleuilelysvalmetasnaspleuser130135140prolysserasnleuarglysarglysargserglnasnleuphearg145150155160glyargargalasermetglyglyglyglyserglyglyglyglyser165170175metalaphevalleuserleuleumetalaleuvalleuvalsertyr180185190glyproglyglyserleuglycystyrleuserglnargleumetleu195200205aspalaarggluasnleulysleuleuaspargmetasnargleuser210215220prohissercysleuglnasparglysasppheglyleuproglnglu225230235240metvalgluglyaspglnleuglnlysaspglnalapheprovalleu245250255tyrglumetleuglnglnserpheasnleuphetyrthrgluhisser260265270seralaalatrpaspthrthrleuleuaspglnleucysthrglyleu275280285glnglnglnleuasphisleuaspthrcysargaspglnvalmetgly290295300glulysaspsergluleuglyasnmetaspproilevalthrvallys305310315320lystyrpheglnglyilehisasptyrleuglnglulysglytyrser325330335aspcysalatrpgluilevalargvalglumetmetargalaleuthr340345350valserthrthrleuglnlysargleuthrlysmetglyglyaspleu355360365asnserpro370<210>2<211>1116<212>dna<213>重組羊長效干擾素τ基因組1<400>2atgaaatacacaagctccttcttagctttactgctctgtgtgcttttgggtttttctggt60tcttatggccagggcccattttttaaagaaatagaaaacttaaaggagtattttaatgca120agtaacccagatgtagctaagggtgggcctcttttctcagaaattttgaagaattggaaa180gaggagagtgacaaaaagattattcagagccaaattgtctccttctacttcaaactcttt240gaaaacctcaaagataaccaggtcattcaaaggagcatggatatcatcaagcaagacatg300tttcagaagttcttgaacggcagctctgagaaactggaggacttcaaaaggctgattcaa360attccggtggatgatctgcagatccagcgcaaagccatcaatgaactcatcaaggtgatg420aatgacctgtcgccaaaatctaacctcagaaagcggaagagaagtcagaatctctttcga480ggccggagagcatcaatgggtggtggtggttctggtggtggtggttctatggccttcgtg540ctctctctactgatggccctggtgctggtcagctatggcccaggaggatctctgggttgt600tacctatctcagagactcatgctggatgccagggagaacctcaagctcctggaccgaatg660aacagactctcccctcattcctgtctgcaggacagaaaagactttggtcttccccaggag720atggtggagggcgaccagctccagaaggaccaggccttccctgtgctctacgagatgctc780cagcagagcttcaacctcttctacacagagcactcctctgctgcctgggacaccaccctc840ctggaccagctctgcactggactccaacagcagctggaccacctggacacctgcagggat900caagtgatgggagagaaagactctgaactgggtaacatggaccccattgtgaccgtgaag960aagtacttccagggcatccatgactacctgcaagagaagggatacagcgactgcgcctgg1020gaaatcgtcagagtcgagatgatgagagccctcactgtatcaaccaccttgcaaaaaagg1080ttaacaaagatgggtggagatctgaactcaccttga1116<210>3<211>1116<212>dna<213>重組羊長效干擾素τ基因組2<400>3atgaaatacacctcttctttcctggctctgctgctgtgcgttctgctgggtttctctggt60tcttacggtcagggtccgttcttcaaagaaatcgaaaacctgaaagaatacttcaacgct120tctaacccggacgttgctaaaggtggtccgctgttctctgaaatcctgaaaaactggaaa180gaagaatctgacaaaaaaatcatccagtctcagatcgtttctttctacttcaaactgttc240gaaaacctgaaagacaaccaggttatccagcgttctatggacatcatcaaacaggacatg300ttccagaaattcctgaacggttcttctgaaaaactggaagacttcaaacgtctgatccag360atcccggttgacgacctgcagatccagcgtaaagctatcaacgaactgatcaaagttatg420aacgacctgtctccgaaatctaacctgcgtaaacgtaaacgttctcagaacctgttccgt480ggtcgtcgtgcttctatgggtggtggtggttctggtggtggtggttctatggctttcgtt540ctgtctctgctgatggctctggttctggtttcttacggtccgggtggttctctgggttgc600tacctgtctcagcgtctgatgctggacgctcgtgaaaacctgaaactgctggaccgtatg660aaccgtctgtctccgcactcttgcctgcaggaccgtaaagacttcggtctgccgcaggaa720atggttgaaggtgaccagctgcagaaagaccaggctttcccggttctgtacgaaatgctg780cagcagtctttcaacctgttctacaccgaacactcttctgctgcttgggacaccaccctg840ctggaccagctgtgcaccggtctgcagcagcagctggaccacctggacacctgccgtgac900caggttatgggtgaaaaagactctgaactgggtaacatggacccgatcgttaccgttaaa960aaatacttccagggtatccacgactacctgcaggaaaaaggttactctgactgcgcttgg1020gaaatcgttcgtgttgaaatgatgcgtgctctgaccgtttctaccaccctgcagaaacgt1080ctgaccaaaatgggtggtgacctgaactctccgtaa1116<210>4<211>498<212>dna<213>羊干擾素γ<400>4atgaaatacacaagctccttcttagctttactgctctgtgtgcttttgggtttttctggt60tcttatggccagggcccattttttaaagaaatagaaaacttaaaggagtattttaatgca120agtaacccagatgtagctaagggtgggcctcttttctcagaaattttgaagaattggaaa180gaggagagtgacaaaaagattattcagagccaaattgtctccttctacttcaaactcttt240gaaaacctcaaagataaccaggtcattcaaaggagcatggatatcatcaagcaagacatg300tttcagaagttcttgaacggcagctctgagaaactggaggacttcaaaaggctgattcaa360attccggtggatgatctgcagatccagcgcaaagccatcaatgaactcatcaaggtgatg420aatgacctgtcgccaaaatctaacctcagaaagcggaagagaagtcagaatctctttcga480ggccggagagcatcaatg498<210>5<211>588<212>dna<213>羊干擾素τ<400>5atggccttcgtgctctctctactgatggccctggtgctggtcagctatggcccaggagga60tctctgggttgttacctatctcagagactcatgctggatgccagggagaacctcaagctc120ctggaccgaatgaacagactctcccctcattcctgtctgcaggacagaaaagactttggt180cttccccaggagatggtggagggcgaccagctccagaaggaccaggccttccctgtgctc240tacgagatgctccagcagagcttcaacctcttctacacagagcactcctctgctgcctgg300gacaccaccctcctggaccagctctgcactggactccaacagcagctggaccacctggac360acctgcagggatcaagtgatgggagagaaagactctgaactgggtaacatggaccccatt420gtgaccgtgaagaagtacttccagggcatccatgactacctgcaagagaagggatacagc480gactgcgcctgggaaatcgtcagagtcgagatgatgagagccctcactgtatcaaccacc540ttgcaaaaaaggttaacaaagatgggtggagatctgaactcaccttga588<210>6<211>498<212>dna<213>羊干擾素γ<400>6atgaaatacacctcttctttcctggctctgctgctgtgcgttctgctgggtttctctggt60tcttacggtcagggtccgttcttcaaagaaatcgaaaacctgaaagaatacttcaacgct120tctaacccggacgttgctaaaggtggtccgctgttctctgaaatcctgaaaaactggaaa180gaagaatctgacaaaaaaatcatccagtctcagatcgtttctttctacttcaaactgttc240gaaaacctgaaagacaaccaggttatccagcgttctatggacatcatcaaacaggacatg300ttccagaaattcctgaacggttcttctgaaaaactggaagacttcaaacgtctgatccag360atcccggttgacgacctgcagatccagcgtaaagctatcaacgaactgatcaaagttatg420aacgacctgtctccgaaatctaacctgcgtaaacgtaaacgttctcagaacctgttccgt480ggtcgtcgtgcttctatg498<210>7<211>588<212>dna<213>羊干擾素τ<400>7atggctttcgttctgtctctgctgatggctctggttctggtttcttacggtccgggtggt60tctctgggttgctacctgtctcagcgtctgatgctggacgctcgtgaaaacctgaaactg120ctggaccgtatgaaccgtctgtctccgcactcttgcctgcaggaccgtaaagacttcggt180ctgccgcaggaaatggttgaaggtgaccagctgcagaaagaccaggctttcccggttctg240tacgaaatgctgcagcagtctttcaacctgttctacaccgaacactcttctgctgcttgg300gacaccaccctgctggaccagctgtgcaccggtctgcagcagcagctggaccacctggac360acctgccgtgaccaggttatgggtgaaaaagactctgaactgggtaacatggacccgatc420gttaccgttaaaaaatacttccagggtatccacgactacctgcaggaaaaaggttactct480gactgcgcttgggaaatcgttcgtgttgaaatgatgcgtgctctgaccgtttctaccacc540ctgcagaaacgtctgaccaaaatgggtggtgacctgaactctccgtaa588當前第1頁12