本發(fā)明涉及活性多糖的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種調(diào)血脂活性多糖的制備方法。

背景技術(shù)：

血脂是指血液中的脂類物質(zhì)，包括中性脂肪和類脂類物質(zhì)，其中甘油三酯和膽固醇屬于中性脂肪，磷脂、固醇、類固醇類物質(zhì)屬于類脂。它們均廣泛存在于人體之中，是人體生命細(xì)胞進(jìn)行基礎(chǔ)代謝功能的必須物質(zhì)。高血脂癥是人體脂類代謝或轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)生異常，使得血液中一種或多種脂質(zhì)含量超過正常范圍的一類全身性疾病。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)于高血脂的發(fā)病機(jī)制以及產(chǎn)生的影響都有了更加深入的了解，所以研究實(shí)用有效的降脂方法對(duì)于高血脂癥的預(yù)防和治療極具意義，當(dāng)血脂過高或者已經(jīng)引起某些疾病的時(shí)候，就要適當(dāng)?shù)牟扇∷幬镏委?，來達(dá)到快速降低血脂的目的。目前用于臨床治療的大多數(shù)降低血脂的藥物主要可以分為兩類：他汀類(statins)和貝特類(fibrates)。各種西藥的作用機(jī)理都不盡相同，臨床上針對(duì)患者不同的身體狀態(tài)，通常幾類藥物結(jié)合治療。但西藥的副作用，例如：腹痛、便秘、胃腸脹氣，疲乏無(wú)力，頭痛等逐漸引起人們的注意。所以亟需尋找一種天然的可調(diào)節(jié)血脂的藥物。紅毛藻具有降血糖、降血脂、預(yù)防心腦血管疾病等功效，具有較高的食用和藥用價(jià)值。有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種從紅毛藻中提取調(diào)血脂活性多糖的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種從紅毛藻中提取調(diào)血脂活性多糖的方法，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低，所提取的多糖有較高的降血脂活性。

為了解決上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種從紅毛藻中提取調(diào)血脂活性多糖的方法，包括以下步驟：

步驟一、抽提：將新鮮紅毛藻清洗、烘干、粉碎，得到藻粉，加入15～20倍體積量的蒸餾水，于90℃下水浴抽提1～3次，每次2h～3h，離心、合并上清液，將上清液蒸發(fā)濃縮得到濃縮液；

步驟二、醇沉：向所述濃縮液中緩慢滴加乙醇，至乙醇終濃度體積分?jǐn)?shù)為75％，靜置過夜后，10000r/min離心10min，取沉淀完全溶解于適量蒸餾水中，冷凍干燥，制得粗多糖；

步驟三、凝膠層析：將所述粗多糖溶解于蒸餾水中，上樣于經(jīng)0.1mnacl溶液平衡的凝膠層析柱上，用0.1mnacl溶液洗脫，苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)，收集洗脫峰，透析脫鹽，冷凍干燥，獲得初步純化多糖；

步驟四、離子交換層析：將所述初步純化多糖溶解于蒸餾水中，上樣于陰離子交換層析柱，依次采用0.1m、0.3m、0.5m濃度的nacl溶液梯度洗脫，苯酚-硫酸法跟蹤監(jiān)測(cè)，分別收集不同濃度下的洗脫峰，透析脫鹽，冷凍干燥，獲得純化多糖，即制得調(diào)血脂活性多糖。

優(yōu)選地，所述步驟一中，還包括脫色：在抽提前，向所得藻粉加入3～5倍體積量的甲醇溶液，反復(fù)清洗三次，浸泡過夜，浸泡后4000r/min，離心15分鐘，所得沉淀再進(jìn)行抽提。

優(yōu)選地，所述步驟一中，烘干溫度為50℃。

優(yōu)選地，所述步驟一中，加入蒸餾水，于90℃水浴抽提2小時(shí)，4000r/min離心20分鐘后取上清液，沉淀重復(fù)熱水抽提2小時(shí)，再離心，合并兩次離心的上清液后進(jìn)行蒸發(fā)濃縮。

優(yōu)選地，所述步驟一及步驟二之間，還包括sevage法除蛋白：將三氯甲烷與正丁醇按照體積比4：1的比例混合配制成sevage試劑，再將粗多糖濃縮液與sevage試劑按照體積比5：1的比例混合后，劇烈振蕩40分鐘，8000r/min離心除去蛋白質(zhì)沉淀層，將上清液回收按照同樣方法，重復(fù)三次，分離取出上清液，備用。

優(yōu)選地，所述步驟三中，采用sephadexg75凝膠柱對(duì)所述粗多糖進(jìn)行純化，具體操作如下：上樣粗多糖液濃度5mg/ml，上樣量為3ml，用0.1mnacl溶液洗脫；采用自動(dòng)收集器接收，接收50管，每管5ml；用苯酚硫酸法于490nm跟蹤檢測(cè)洗脫情況，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，做洗脫圖；合并洗脫峰，透析脫鹽，冷凍干燥，制得初步純化多糖。

優(yōu)選地，所述步驟四中，采用deaecellulose52凝膠柱對(duì)所述初步純化多糖進(jìn)一步純化，具體操作如下：將樣品配制成3mg/ml溶液，上樣量為5ml，分別用0.1m、0.3m、0.5m濃度的nacl溶液梯度洗脫，每個(gè)洗脫液，收集40管，每管收集5ml；用苯酚硫酸法跟蹤監(jiān)測(cè)，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，做洗脫圖；合并各洗脫峰，透析脫鹽，冷凍干燥，制得調(diào)血脂活性多糖。

本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明從紅毛藻中提取出了一種調(diào)血脂活性多糖，該活性多糖是一種天然的物質(zhì)，具有明顯調(diào)血脂的效果。本法得到的純化的紅毛藻多糖片段sf3，藥理證明其具有抑制胰脂肪酶、降低甘油三酯(tg)和膽固醇(tc)作用，即具有調(diào)節(jié)血脂活性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例中提取的活性多糖的凝膠過濾洗脫圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例中初步純化的活性多糖的陰離子交換層析柱洗脫圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例中最終純化的紅毛藻多糖對(duì)胰脂肪酶活性的抑制作用圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例中最終純化的紅毛藻多糖片段sf3對(duì)加入膽固醇的hepg2細(xì)胞中甘油三酯(tg)含量的影響圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例中最終純化的紅毛藻多糖片段sf3對(duì)加入膽固醇的hepg2細(xì)胞中總膽固醇(tc)含量的影響圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：抑制劑的提取

所述新鮮紅毛藻采購(gòu)于福建莆田。利用水提醇沉法進(jìn)行提取，具體操作如下：將新鮮紅毛藻清洗干凈，置于烘箱內(nèi)50℃烘干，之后用粉碎機(jī)粉碎。干藻粉加入3～5倍體積量的甲醇，持續(xù)的攪拌，反復(fù)清洗三次，以保證脫色的充分，浸泡過夜。浸泡后4000r/min離心15分鐘，沉淀取出加入蒸餾水90℃水浴加熱2小時(shí)，4000r/min離心20分鐘后取上清液，沉淀重復(fù)熱水抽提2小時(shí)再離心，合并兩次離心的上清液，蒸發(fā)濃縮，工作溫度為50℃，將提取液濃縮至原體積的1/10。加入乙醇至終濃度75％(v/v)，靜置過夜。10000r/min離心10分鐘，取沉淀完全溶解于少量蒸餾水中，冷凍干燥，制得粗多糖。

sevage法除蛋白：將三氯甲烷與正丁醇按照體積比4：1的比例混合配制成sevage試劑，再將粗多糖濃縮溶液與sevage試劑按照體積比5：1的比例混合后，劇烈振蕩40分鐘，8000r/min離心除去蛋白質(zhì)沉淀層，將上清液回收按照同樣方法，重復(fù)三次，分離取出上清液，除蛋白。

實(shí)施例2：多糖的凝膠過濾純化

采用sephadexg75凝膠柱(c16/100)對(duì)粗多糖進(jìn)行純化，具體操作如下：上樣糖液濃度5mg/ml，上樣量為3ml，用0.1mnacl溶液洗脫。采用自動(dòng)收集器接收，接收50管，每管5ml。用苯酚硫酸法于490nm跟蹤檢測(cè)洗脫情況，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，做洗脫圖。合并洗脫峰，透析脫鹽，冷凍干燥，制得初步純化多糖f。結(jié)果如圖1所示，紅毛藻粗多糖的洗脫曲線得到單一對(duì)稱峰，由于在純化之前對(duì)粗多糖進(jìn)行了蛋白質(zhì)脫除，所以洗脫得到一個(gè)單一組分，將其命名為f，說明f組分中是分子量較為均一的多糖。

實(shí)施例3：抑制劑f的陰離子交換層析

采用deaecellulose52凝膠柱對(duì)初步純化多糖f進(jìn)行進(jìn)一步純化，具體操作如下：將樣品配制成3mg/ml溶液，上樣量為5ml，分別用0m(蒸餾水)、0.1m、0.3m、0.5m濃度的nacl溶液梯度洗脫，每個(gè)洗脫液，收集40管，每管收集5ml。同樣用苯酚硫酸法跟蹤監(jiān)測(cè)，以管號(hào)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，做洗脫圖。合并各洗脫峰，透析脫鹽，冷凍干燥，制得純化多糖sf1，sf2，sf3。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)用蒸餾水洗脫時(shí)，未見有洗脫峰出現(xiàn)，而在nacl溶液濃度為0.1、0.3、0.5m下，各有一個(gè)洗脫峰出現(xiàn)，分別命名為sf1、sf2和sf3。

實(shí)施例4：

4.1紅毛藻多糖胰脂肪酶抑制活性

4.1.1材料與方法

材料及紅毛藻多糖的制備：

胰脂肪酶(20000u/mg，源于豬胰腺，西格瑪奧德里奇(上海)有限公司)；對(duì)硝基苯酚(pnp,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；4-硝基苯棕櫚酸酯(pnpp,br,西格瑪奧德里奇(上海)有限公司)；其余化學(xué)試劑均為分析純。

多糖溶液：精密稱取純化多糖片段sf1、sf2和sf3并溶解于tris-hcl緩沖液中，反應(yīng)體系中多糖終濃度為0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，1.0mg/ml。

方法：

各取50μl多糖溶液和脂肪酶液混合，置于37℃水浴鍋中溫育10min，再向其中添加100μl底物溶液起始反應(yīng)，在37℃下反應(yīng)10min后，于405nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。以?shī)W利司他(orlistat)作為陽(yáng)性對(duì)照，以同樣體積tris-hcl代替多糖作為空白對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)體系設(shè)定3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)體系如下表1：

表1實(shí)驗(yàn)體系設(shè)計(jì)

4.1.2結(jié)果

由圖3所示，純化得到的三個(gè)多糖片段sf1，sf2和sf3對(duì)胰脂肪酶均有抑制作用。

4.2紅毛藻多糖片段對(duì)hepg2細(xì)胞脂代謝的調(diào)節(jié)作用

4.2.1油酸誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞模型的構(gòu)建

材料：

dmem培養(yǎng)基(500mldmem培養(yǎng)基添加1％雙抗和15％胎牛血清)；0.25％胰蛋白酶；磷酸鹽緩沖液(pbs)；含油酸培養(yǎng)基(油酸與bsa按50：1的比例混合溶解，然后與含10％胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合，使油酸終濃度為100μmol/l，bsa濃度不超過2μmol/l)。

方法：

造模：使用油酸來誘導(dǎo)hepg2細(xì)胞，模擬構(gòu)建肝臟細(xì)胞脂類變性的模型，研究紅毛藻多糖對(duì)hepg2細(xì)胞中總甘油三酯合成的影響。實(shí)驗(yàn)分為三組：

(1)空白組：用正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞；

(2)試驗(yàn)組：先用多糖樣品預(yù)先孵育后，再加入油酸誘導(dǎo)的細(xì)胞；

(3)對(duì)照組：不用多糖處理，只用含油酸培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞。

首先同步化細(xì)胞，然后將試驗(yàn)組細(xì)胞用不同濃度多糖樣品處理12h，之后，試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞換成含油酸的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，空白組不做任何處理。檢測(cè)各組細(xì)胞中總甘油三酯的含量。

4.2.2高膽固醇hepg2細(xì)胞模型的構(gòu)建

材料：

dmem培養(yǎng)基(500mldmem培養(yǎng)基添加1％雙抗和15％胎牛血清)；0.25％胰蛋白酶；磷酸鹽緩沖液(pbs)；含膽固醇培養(yǎng)基(將膽固醇和25-羥膽固醇與含有10％fbs的生長(zhǎng)培養(yǎng)基混合，使膽固醇終濃度為15μg/ml，bsa濃度不超過2μg/ml)。

方法：

造模：實(shí)驗(yàn)分為三組：

(1)模型組：在正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入膽固醇；

(2)加樣組：用不同濃度多糖樣品處理后的細(xì)胞；

(3)對(duì)照組：在用含膽固醇培養(yǎng)基培養(yǎng)狀態(tài)下加入0.2μg/ml辛伐他汀(sim)。

實(shí)驗(yàn)前，用無(wú)血清的dmem培養(yǎng)基孵育hepg2細(xì)胞約12h，使其生長(zhǎng)同步化。首先將加樣組細(xì)胞，用添加了不同濃度多糖樣品的生長(zhǎng)培養(yǎng)基處理24h，然后模型組、加樣組和對(duì)照組均加入終濃度相同的含膽固醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，其中對(duì)照組加入辛伐他汀。孵育結(jié)束后，將培養(yǎng)基移除，用pbs小心漂洗三次，置于冰上裂解細(xì)胞，測(cè)定各組細(xì)胞內(nèi)總甘油三酯含量及總脂類分泌情況。

4.2.3結(jié)果

由圖4和圖5可知，較少量的辛伐他汀對(duì)誘導(dǎo)后的hepg2細(xì)胞模型中tg和tc產(chǎn)生均有明顯的抑制作用，同樣的，紅毛藻多糖片段sf3也表現(xiàn)出一定的抑制作用，并且抑制活性隨著多糖濃度的降低而減弱，呈劑量依賴性。由此得知紅毛藻多糖sf3片段具有明顯的調(diào)節(jié)血脂活性。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。