本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，且特別涉及一種基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法及中空狀血管化心臟。

背景技術(shù)：

心血管疾病具有很高的發(fā)病率與死亡率，嚴重威脅人類健康和生活質(zhì)量，同時也造成了巨大的社會經(jīng)濟負擔。由于成熟心肌細胞屬于終末分化期永久性細胞，不具有再生能力，一旦壞死后，梗死區(qū)域炎性細胞浸潤，細胞基質(zhì)降解，室壁病理性重建形成纖維化的瘢痕組織，使梗死區(qū)室壁變薄，心肌收縮功能減弱，進一步導(dǎo)致心室擴大，最終發(fā)展為心力衰竭，甚至死亡?，F(xiàn)有的治療手段雖然能在一定程度上改善癥狀，但并不能徹底地治愈。因此對于心力衰竭晚期的患者而言，心臟移植仍然是最佳選擇并且具有較好的長期療效。遺憾的是，限于供體器官的缺乏、昂貴的手術(shù)費用、移植的排斥反應(yīng)及移植器官衰竭等因素，心臟移植受到了限制，絕大多數(shù)病人在等待供體的過程中離世。因此，供體不足已成為當前醫(yī)學(xué)界亟待解決的問題之一。而心肌組織工程的興起為人類最終解決這一難題帶來了希望。數(shù)年來，研究人員在心肌組織工程研究方面取得了一系列進展，初步探索出不同的種子細胞、支架材料和體外構(gòu)建方法，并在動物移植實驗中取得初步成績，這些成就為人類最終戰(zhàn)勝缺血性心血管疾病帶來了希望。然而傳統(tǒng)的組織工程化心肌組織存在較多的缺陷，仍不能滿足實際需要。

近年來，3d生物打印技術(shù)已被應(yīng)用到組織工程學(xué)中，希望利用該技術(shù)實現(xiàn)體外組織、器官的復(fù)制，由于該技術(shù)能精確控制生物材料、細胞的位置與分布，能夠個性化構(gòu)建工程化組織器官，同時具有最大仿生性和最小排異性等特點，在很大程度上解決了傳統(tǒng)組織工程的諸多不足，因此其所構(gòu)建的工程化心肌組織、器官更能滿足實際需要。

目前，中空狀血管化一體成型是心臟生物打印技術(shù)的最大挑戰(zhàn)，也是最關(guān)鍵點，難度體現(xiàn)在現(xiàn)有水凝膠力學(xué)支撐效果差，易坍塌，不易成型及功能性血管網(wǎng)不易構(gòu)建，一體化成型難。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法，通過3d生物打印技術(shù)結(jié)合逆向建模技術(shù)有效解決了單純水凝膠易坍塌的問題，故而解決了大尺寸、中空狀血管化一體化打印困難的問題。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種由上述基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟，其細胞活性高。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題是采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。

本發(fā)明提出一種基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法，其包括：

逆向建模構(gòu)建心臟三維網(wǎng)格模型，并將心臟三維網(wǎng)格模型的數(shù)據(jù)導(dǎo)入雙噴頭打印機，雙噴頭打印機的噴頭1裝入犧牲材料用于打印支撐骨架，噴頭2噴出生物墨水，得構(gòu)建體。

將構(gòu)建體交聯(lián)，清洗，三維培養(yǎng)分化形成中空狀血管化心臟。

生物墨水的有效成分包括：水凝膠、富血小板血漿、第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞以及sd大鼠原代心肌細胞。

本發(fā)明提出一種上述方法制得的中空狀血管化心臟。

本發(fā)明實施例提供的基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法及中空狀血管化心臟的有益效果是：

通過三維生物打印技術(shù)、逆向建模技術(shù)以及生物墨水的互相配合，不僅解決了水凝膠力學(xué)支撐效果差，易坍塌，不易成形及功能性血管網(wǎng)不易構(gòu)建，大尺寸、中空狀血管化一體化打印困難的問題?；?d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟細胞存活率在打印后8小時平均大于95％，在第7和14天的細胞存活率分別平均大于為88％、80％。為解決器官移植供體嚴重不足問題提供了新的方法和思路，同時可用于藥物篩查和毒性檢測方面。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1為本發(fā)明提供的心臟重建示意圖；

圖2為本發(fā)明提供的心臟打印的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法及中空狀血管化心臟進行具體說明。

本發(fā)明提供一種基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法，該方法操作便捷，有效提高構(gòu)建中空狀血管化心臟的成功率，同時解決水凝膠力學(xué)支撐效果差，易坍塌，不易成型及功能性血管網(wǎng)不易構(gòu)建的問題。

具體地，該方法包括：

a.逆向建模構(gòu)建心臟三維網(wǎng)格模型，并將心臟三維網(wǎng)格模型的數(shù)據(jù)導(dǎo)入雙噴頭打印機。其中，雙噴頭打印機為生物雙噴頭打印機。

具體地，逆向建模前，將志愿者心臟薄層ct掃描數(shù)據(jù)以dicom格式導(dǎo)入mimics軟件，例如mimics10.0軟件中進行三維重建，然后通過逆向建模技術(shù)重新設(shè)計，將其設(shè)計為可雙噴頭打印的心臟三維網(wǎng)格模型，生成stl格式數(shù)據(jù)，然后將其stl格式數(shù)據(jù)載入到3d生物打印機應(yīng)用軟件中進行處理，對心臟三維模型進行分層切片，獲得多層切片的cad數(shù)據(jù)模型。

請參閱圖1，其中a為心臟的cad模型，b為經(jīng)逆向重建后的cad模型剖面圖，其中b中，淺色為pva打印的內(nèi)、外支撐骨架，深色填充部分為生物墨水，其中，c為內(nèi)層與外層。

其中，薄層ct掃描過程中，例如以薄層厚度為1mm的形式進行掃描，使逆向建模得到的多層切片的cad數(shù)據(jù)模型更為精準，其中逆向建模軟件可以采用geomagc和catia軟件等，在此不做具體限定。

b.請參閱圖2，雙噴頭打印機的噴頭1裝入犧牲材料用于打印支撐骨架，噴頭2噴出生物墨水，得構(gòu)建體。

其中圖2中，1為噴頭1，用于打印內(nèi)外支持骨架。2是指噴頭2，用于噴出生物墨水，其中3是生物墨水的放大示意圖，4為心臟。

優(yōu)選地，犧牲材料為經(jīng)預(yù)先滅菌處理的水溶性pva，通過先添加后犧牲的方法實現(xiàn)中空狀血管化心臟的中空結(jié)構(gòu)。

噴頭1的打印溫度為160～170℃。具體地，生物墨水裝入生物打印機的37℃恒溫料盒中并與噴頭2相連接，其中恒溫料盒的底板溫度＜20℃。其中，噴頭1用于打印內(nèi)外部的支撐骨架，噴頭2將生物墨水打印在內(nèi)部骨架的間隙處，優(yōu)選地，打印于無菌環(huán)境中進行，防止雜菌污染。

更優(yōu)選地，噴嘴1的直徑分別是400μm-800μm，例如噴嘴1的直徑是400μm、600μm、800μm等，更優(yōu)選地，噴嘴1的直徑是800μm，噴嘴2的直徑為1000μm-2000μm，例如噴嘴2的直徑為1000μm、1200μm、1400μm、1600μm或2000μm等，優(yōu)化打印效果。

優(yōu)選地，本發(fā)明較佳的實施例中，生物墨水的有效成分包括：水凝膠、富血小板血漿、第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞以及sd大鼠原代心肌細胞，其中水凝膠包括藻酸鹽和瓊脂糖，生物相容性好，降解產(chǎn)物安全無毒，不存在過敏反應(yīng)或者毒性反應(yīng)的潛在危險。富血小板血漿能釋放多種生長因子，促進細胞增殖、生長、分化和組織的形成，提高生物墨水中目標細胞的成活率。第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞以及sd大鼠原代心肌細胞與水凝膠、富血小板血漿的相容性佳，可實現(xiàn)活性打印。

生物墨水的制備方法如下：將第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞、sd大鼠原代心肌細胞與富血小板血漿混合后，接著與水凝膠混合，即得，由于富血小板血漿的流動性相比于水凝膠更佳，因此采用先與富血小板血漿混合，再與水凝膠混合的方式，可以使第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞、sd大鼠原代心肌細胞均勻分散于該生物墨水內(nèi)，不發(fā)生細胞團聚現(xiàn)象，提高生物墨水的質(zhì)量。

優(yōu)選地，本發(fā)明較佳的實施例提供的藻酸鹽在生物墨水中的含量為2-3wt％，優(yōu)選地，瓊脂糖在生物墨水中的含量為0.8-1.3wt％，優(yōu)選地，第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞在生物墨水中的密度為1×10⁶個/ml，優(yōu)選地，sd大鼠原代心肌細胞在生物墨水中的密度為1×10⁶個/ml，優(yōu)選地，富血小板血漿在生物墨水中的體積分數(shù)為10-25％。

生物墨水的溶劑為pbs溶液或去離子水，其中pbs可以有效平衡細胞滲透壓、維持離子強度和ph，使細胞生長環(huán)境維持穩(wěn)定。

更優(yōu)選地，藻酸鹽在生物墨水中的含量為2.5wt％，瓊脂糖在生物墨水中的含量為1wt％，第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞在生物墨水中的密度為1×10⁶個/ml，sd大鼠原代心肌細胞在生物墨水中的密度為1×10⁶個/ml，富血小板血漿在生物墨水中的體積分數(shù)為20％，此比例條件下，細胞成活率更高，同時保證內(nèi)部微網(wǎng)絡(luò)流體通道的保真度也有利于心肌細胞搏動的力學(xué)環(huán)境。

上述生物墨水例如可以由以下方式制備：

制備水凝膠：由于水凝膠的使用需要提前配置，使用時按需添加即可。例如稱取2.5g生物級的藻酸鹽溶解于50mlpbs溶液中，室溫下磁力攪拌至完全溶解，高壓滅菌后37℃培養(yǎng)箱過夜，得藻酸鹽溶液；稱取1g生物級低熔點瓊脂糖粉末溶解于50mlpbs溶液中，加熱至完全溶解，高壓滅菌后37℃培養(yǎng)箱過夜，得瓊脂糖溶液；需要使用水凝膠時，將藻酸鹽溶液、瓊脂糖溶液混合，磁力攪拌，混合均勻，即得水凝膠。本發(fā)明中，瓊脂糖均指低熔點瓊脂糖。

其中，水凝膠中，藻酸鹽的終濃度分別為2-4％(w/v)，例如藻酸鹽的終濃度分別為2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)或4％(w/v)，瓊脂糖的終濃度為1-4％(w/v)，例如瓊脂糖的終濃度為1％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)或4％(w/v)等。

接著，第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞、sd大鼠原代心肌細胞與富血小板血漿混合后，制得生物墨水。

其中，富血小板血漿的制備為現(xiàn)采現(xiàn)用，促生長效果佳。例如根據(jù)實際需要取所需量，無菌收集外科手術(shù)中的廢棄血，例如10～100ml等制備富血小板血漿。其中，富血小板血漿在生物墨水中的體積分數(shù)為10-25％，例如富血小板血漿在生物墨水中的體積分數(shù)為10％、15％、20％或25％等。

c.將構(gòu)建體交聯(lián)，清洗，三維培養(yǎng)形成中空狀血管化心臟。

具體地，將制得的構(gòu)建體與交聯(lián)劑混合，進行交聯(lián)5-15分鐘后，例如進行交聯(lián)5分鐘、7分鐘、10分鐘或15分鐘后使用pbs清洗，使殘留于構(gòu)建體表面的交聯(lián)劑徹底清除。例如用pbs清洗三次，每次3-5分鐘等。

本實施例中，優(yōu)選交聯(lián)劑為含有凝血酶和氯化鈣的pbs溶液，具體地，氯化鈣在交聯(lián)劑中的濃度為8-12wt％，凝血酶在交聯(lián)劑中的密度為9-11u/ml，交聯(lián)效果優(yōu)異。

同時，上述交聯(lián)劑可以由以下方法制備，例如：

稱取15g無水氯化鈣溶解于150ml的pbs溶液中，高壓滅菌，得氯化鈣溶液，優(yōu)選在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取2000u的凝血酶充分溶解于50ml含有10wt％的氯化鈣的pbs溶液中，經(jīng)0.22目過濾除菌后，得凝血酶溶液，優(yōu)選在4℃保存，使用時將氯化鈣溶液與凝血酶溶液混勻便是交聯(lián)劑。

d.三維培養(yǎng)形成中空狀血管化心臟。

具體地，將清洗后的構(gòu)建體加入細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，至犧牲材料完全溶解后每24h-48h更換一次培養(yǎng)液。為了加快犧牲材料的溶解速度及微管的快速通暢，因而在構(gòu)建體加入細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)至犧牲材料完全溶解期間，優(yōu)選每30分鐘更換一次培養(yǎng)液，保證生物墨水中細胞的活性。至犧牲材料完全溶解后，構(gòu)建體內(nèi)便形成縱橫交錯的微流體通道及心臟的中空結(jié)構(gòu)。細胞培養(yǎng)基可以為m199或/和dmem/f12完全培養(yǎng)基，優(yōu)選地，細胞培養(yǎng)基為含15％胎牛血清、1％雙抗的dmem/f12完全培養(yǎng)基。

優(yōu)選地，本發(fā)明較佳的實施例中，犧牲材料為水溶性pva，具有良好的生物相容性及可降解性，同時作為支撐材料便于去除，有效提高生產(chǎn)效率。

本發(fā)明還提供一種如上述基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟。

其中，支撐骨架包括內(nèi)層、外層以及內(nèi)部骨架，內(nèi)部骨架分別與內(nèi)層、外層連接，生物墨水填充于內(nèi)部骨架與內(nèi)層、外層的間隙處，其中，外層設(shè)置有多個微孔，優(yōu)選地，每個微孔的孔徑為0.07-0.1mm，例如0.07mm、0.08mm、0.09mm或0.1mm等，相鄰的任意兩個微孔之間的孔間距為2-5mm，例如2mm、3mm、4mm或5mm等，使生物墨水與交聯(lián)劑充分反應(yīng)，促進生物墨水成形效率，同時由于微孔的孔徑較小，因此有效防止生物墨水流出。優(yōu)選地，中空狀血管化心臟位于內(nèi)層部分也具有多個上述微孔。

犧牲材料完全溶解后，中空狀血管化心臟具有內(nèi)部pva骨架溶解后留下的微管道，優(yōu)選地，每個微管道的孔徑為0.1mm，相鄰的任意兩個微管道之間的孔間距為4mm。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

一種基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟，其由以下方法制得：

(1)心臟建模：將志愿者心臟薄層ct掃描數(shù)據(jù)的dicom格式導(dǎo)入mimics10.0軟件中進行三維重建，然后通過逆向建模技術(shù)重新設(shè)計，將其設(shè)計為可雙噴頭打印的三維網(wǎng)格模型，生成stl格式數(shù)據(jù)，然后將其導(dǎo)入生物打印控制軟件中，設(shè)置好相關(guān)參數(shù)進行切片以形成g代碼。

(2)水凝膠制備：稱取2.5g生物級的藻酸鹽溶解于50mlpbs溶液中，室溫下磁力攪拌至完全溶解，高壓滅菌后37℃培養(yǎng)箱過夜；取1g生物級低熔點瓊脂糖粉末溶解于50mlpbs溶液中，加熱至完全溶解，高壓滅菌后37℃培養(yǎng)箱過夜。

(3)交聯(lián)劑制備：稱取15g無水氯化鈣溶解于150ml的pbs溶液中，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?，然后?000u的凝血酶充分溶解于50ml含10wt％的氯化鈣的pbs溶液中，經(jīng)0.22目濾器過濾除菌后4℃保存，用時將兩者混勻便是交聯(lián)劑。

(4)生物墨水制備：無菌收集外科手術(shù)中的廢棄血100ml以制備富血小板血漿，將預(yù)先培養(yǎng)好的第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞、sd大鼠(1-3天新生)原代心肌細胞分別以1×10⁶個/ml和3×10⁷個/ml的密度與步驟(2)中的富血小板血漿充分混勻后，接著與藻酸鹽溶液、瓊脂糖溶液混勻，最終制得的藻酸鹽、瓊脂糖的濃度分別為2.5％(w/v)、1％(w/v)，富血小板血漿添加量為20％(v/v)。

(5)心臟打印：將預(yù)先滅菌的水溶性pva裝入雙噴頭打印機噴頭1內(nèi)，pva打印溫度為160～170℃，生物墨水裝入生物打印機37℃恒溫料盒中并與噴頭2相連接，底板溫度＜20℃，噴頭2打印生物墨水，其中噴頭1打印內(nèi)外部的支撐骨架，噴頭2將生物墨水打印在內(nèi)部骨架的間隙處，整個過程均在無菌環(huán)境中進行。

(6)將打印好的構(gòu)建體與預(yù)先準備好的交聯(lián)劑進行交聯(lián)10分鐘，接著用pbs清洗三次每次5分鐘，然后加入含15％胎牛血清、1％雙抗的dmem/f12完全培養(yǎng)基于生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，每30分鐘換培養(yǎng)液直到pva完全溶解后改為每24h換一次。

本實施例提供的基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟，長寬高分別為：50mmx40mmx60mm,其內(nèi)部微管道直徑約1mm，細胞存活率在打印后8小時為98.2％，在第7和14天的細胞存活率分別為90.4％、84.6％；打印后第二天可見少數(shù)單個細胞搏動，頻率30次/分，第7天可大量細胞搏動，頻率40次/分。

實施例2

一種基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟，其由以下方法制得：

(1)心臟建模：將志愿者心臟薄層ct掃描數(shù)據(jù)以dicom格式導(dǎo)入mimics10.0軟件中進行三維重建，然后通過逆向建模技術(shù)重新設(shè)計，將其設(shè)計為可雙噴頭打印的三維網(wǎng)格模型，生成stl格式數(shù)據(jù)，然后將其導(dǎo)入生物打印控制軟件中，設(shè)置好相關(guān)參數(shù)進行切片以形成g代碼。

(2)水凝膠制備：稱取2g生物級的藻酸鹽溶解于50mlpbs溶液中，室溫下磁力攪拌至完全溶解，高壓滅菌后37℃培養(yǎng)箱過夜；取2g生物級低熔點瓊脂糖粉末溶解于50mlpbs溶液中，加熱至完全溶解，高壓滅菌后37℃培養(yǎng)箱過夜。

(3)交聯(lián)劑制備：稱取15g無水氯化鈣溶解于150ml的pbs溶液中，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆茫缓笕?000u的凝血酶充分溶解于50ml含10wt％的氯化鈣的pbs溶液中，經(jīng)0.22目濾器過濾除菌后4℃保存，用時將兩者混勻便是交聯(lián)劑。

(4)生物墨水制備：無菌收集外科手術(shù)中的廢棄血100ml以制備富血小板血漿，將預(yù)先培養(yǎng)好的第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞、sd大鼠(1-3天新生)原代心肌細胞分別以1×10⁶個/ml和3×10⁷個/ml的密度與富血小板血漿混合，再與步驟(2)中制得的藻酸鹽溶液、瓊脂糖溶液充分混勻，最終制得的生物墨水中藻酸鹽、瓊脂糖濃度分別為2％(w/v)、2％(w/v)，富血小板血漿添加量為20％(v/v)。

(5)心臟打?。簩㈩A(yù)先滅菌的pva裝入雙噴頭打印機噴頭1內(nèi)，pva打印溫度為160～170℃，生物墨水裝入生物打印機37℃恒溫料盒中并與噴頭2相連接，底板溫度＜20℃，噴頭2打印生物墨水，其中噴頭1打印內(nèi)外部的支撐骨架，噴頭2將生物墨水打印在內(nèi)部骨架的間隙處，整個過程均在無菌環(huán)境中進行。

(6)將打印好的構(gòu)建體與預(yù)先準備好的交聯(lián)劑進行交聯(lián)7分鐘，接著用pbs清洗三次每次5分鐘，然后加入含15％胎牛血清、1％雙抗的dmem/f12完全培養(yǎng)基于生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，每30分鐘換培養(yǎng)液直到pva完全溶解后改為每48h換一次。

本實施例提供的基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟，長寬高分別為：50mmx40mmx60mm,內(nèi)部微管道直徑約1mm，細胞存活率在打印后8小時為96.2％，在第7和14天的細胞存活率分別為89.4％、82.6％；打印后第二天可見少數(shù)單個細胞搏動，頻率25次/分，第7天可見大量細胞搏動，頻率35次/分。

實施例3

一種基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟，其由以下方法制得：

(1)心臟建模：將志愿者心臟薄層ct掃描數(shù)據(jù)的dicom格式導(dǎo)入mimics10.0軟件中進行三維重建，然后通過逆向建模技術(shù)重新設(shè)計，將其設(shè)計為可雙噴頭打印的三維網(wǎng)格模型，生成stl格式數(shù)據(jù)，然后將其導(dǎo)入生物打印控制軟件中，設(shè)置好相關(guān)參數(shù)進行切片以形成g代碼。

(2)水凝膠制備：稱取3g生物級的藻酸鹽溶解于50mlpbs溶液中，室溫下磁力攪拌至完全溶解，高壓滅菌后37℃培養(yǎng)箱過夜；取3g生物級低熔點瓊脂糖粉末瓊脂糖溶解于50mlpbs溶液中，加熱至完全溶解，高壓滅菌后37℃培養(yǎng)箱過夜。

(3)交聯(lián)劑制備：稱取15g無水氯化鈣溶解于150ml的pbs溶液中，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?，然后?000u的凝血酶充分溶解于50ml含10％氯化鈣的pbs溶液中，經(jīng)0.22目濾器過濾除菌后4℃保存，用時將兩者混勻便是交聯(lián)劑。

(4)生物墨水制備：無菌收集外科手術(shù)中的廢棄血100ml以制備富血小板血漿，將預(yù)先培養(yǎng)好的第三代人臍靜脈內(nèi)皮細胞、sd大鼠(1-3天新生)原代心肌細胞分別以1×10⁶個/ml和3×10⁷個/ml的密度與富血小板血漿混合，再與步驟(2)中制得的藻酸鹽溶液和瓊脂糖溶液充分混勻，最終制得的藻酸鹽和瓊脂糖濃度分別為3％(w/v)、3％(w/v)，富血小板血漿添加量為20％(v/v)。

(5)心臟打?。簩㈩A(yù)先滅菌的pva裝入雙噴頭打印機噴頭1內(nèi)，pva打印溫度為160～170℃，生物墨水裝入生物打印機37℃恒溫料盒中并與噴頭2相連接，底板溫度＜20℃，噴頭2打印生物墨水，其中噴頭1打印內(nèi)外部的支撐骨架，噴頭2將生物墨水打印在內(nèi)部骨架的間隙處，整個過程均在無菌環(huán)境中進行。

(6)將打印好的構(gòu)建體與預(yù)先準備好的交聯(lián)劑進行交聯(lián)10分鐘，接著用pbs清洗三次每次5分鐘，然后加入含15％胎牛血清、1％雙抗的dmem/f12完全培養(yǎng)基于生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，每30分鐘換培養(yǎng)液直到pva完全溶解后改為每48h換一次。

本實施例提供的基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法制得的中空狀血管化心臟，長寬高分別為：50mmx40mmx60mm，內(nèi)部微管道直徑約1mm，細胞存活率在打印后8小時為95.2％，在第7和14天的細胞存活率分別為88.4％、80.6％；打印后第二天可見少量單個細胞搏動，頻率20次/分，第14天可見大量細胞搏動，頻率35次/分

綜上，本發(fā)明實施例的基于3d生物打印技術(shù)構(gòu)建中空狀血管化心臟的方法及中空狀血管化心臟，解決了大尺寸、中空狀血管化一體化打印困難的問題，同時本發(fā)明將進一步推動了三維生物打印技術(shù)在心臟再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景，給等待心臟或其他組織器官移植的患者帶來了巨大的希望，這為解決器官移植供體嚴重不足問題提供了新的方法和思路，同時還可用于藥物篩查和毒性檢測，具有優(yōu)異的經(jīng)濟推廣價值。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。