本發(fā)明涉及的是美容整形技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種體內(nèi)重建毛囊的方法。

背景技術(shù)：

目前有三種常用重建毛囊方法：小室法、注射法和移植法，這些方法都有各自的缺陷，實(shí)用價(jià)值不高。比如小室法是將含有細(xì)胞的小室植入小鼠背部，該方法花費(fèi)的時(shí)間較長，且針對(duì)不同的傷口形態(tài)需要制作不同大小的小室，在傷口愈合之前，被試動(dòng)物需要一直帶著這個(gè)沉重的小室，不適用于臨床大規(guī)模應(yīng)用。注射法是將毛囊混合細(xì)胞注射到小鼠皮內(nèi)或皮下，該方法簡便易操作，但不適合注射團(tuán)塊細(xì)胞和數(shù)量較多的細(xì)胞，而且重建的毛發(fā)生長方向雜亂，不易穿出皮膚，再生毛發(fā)效率較低，因此，該方法將來也不能用于臨床實(shí)踐。移植法是最近改良的一種新的移植方法能，有效再生毛發(fā)，但它跟小室法相似，需要大片切除宿主的皮膚(創(chuàng)傷大)，移植操作比較復(fù)雜，實(shí)際應(yīng)用，特別是開發(fā)臨床治療脫發(fā)的應(yīng)用受限?；诖?，設(shè)計(jì)一種新型的體內(nèi)重建毛囊的打洞法尤為必要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)上存在的不足，本發(fā)明目的是在于提供一種體內(nèi)重建毛囊的方法(孔洞法)，操作簡便，創(chuàng)傷小，毛囊形成效率高，適合注射團(tuán)塊細(xì)胞和數(shù)量較多的細(xì)胞，易于推廣使用，并且可開發(fā)應(yīng)用于臨床或美容領(lǐng)域來解決脫發(fā)問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種體內(nèi)重建毛囊的方法，其步驟為：

(1)細(xì)胞分離：取出生1-3天的c57小鼠，剪去四肢和尾巴，用鑷子把整塊皮剝下，浸泡在含有2.5mg/ml解離酶的pbs中4℃孵育過夜，機(jī)械法將表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞分離。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)：將上步新鮮分離的細(xì)胞按照以下方法培養(yǎng)擴(kuò)增：

①表皮細(xì)胞培養(yǎng)：用含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到事先用包被基質(zhì)處理過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(細(xì)胞數(shù)大約在300萬-500萬每t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶)中，培養(yǎng)三天，之后換成cnt07或其它表皮培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2天換液一次，顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞長滿時(shí)進(jìn)行傳代或后續(xù)研究，表皮按1：3傳代。

②真皮細(xì)胞培養(yǎng)：10%胎牛血清的dmem并帶有fgf生長因子的真皮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種在100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每5天換一次液，細(xì)胞長滿后傳代或直接進(jìn)行第3步，真皮按1：3-10倍傳代。

(3)細(xì)胞球培養(yǎng)：取分離或培養(yǎng)好的真皮和表皮細(xì)胞按一定比例混合，重懸在含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem真皮培養(yǎng)基中，接種到不能貼壁的培養(yǎng)皿(6孔板)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在37度培養(yǎng)箱孵育16-24小時(shí)，形成細(xì)胞球狀。

(4)細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)：取分離或培養(yǎng)好的真皮和表皮細(xì)胞按一定比例混合，重懸在含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem真皮培養(yǎng)基中，接種到薄膜如硅膠膜上，在37度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時(shí)形成細(xì)胞團(tuán)塊。

(5)移植前細(xì)胞準(zhǔn)備：可以直接取步驟(1)中的新鮮分離的皮膚單細(xì)胞，或步驟(2)中的培養(yǎng)擴(kuò)增的表皮和真皮細(xì)胞按一定比例混合的單細(xì)胞，或步驟(3)中的細(xì)胞球，又或步驟(4)中的細(xì)胞團(tuán)塊，將其重懸在5-10ulf12培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)可以控制在1000-100萬/ul的濃度進(jìn)行移植。

(6)在裸鼠皮膚上打洞：將免疫缺陷小鼠(裸鼠)麻醉，用21g針頭或取皮器進(jìn)行皮膚打洞，洞的大小可根據(jù)需要而定。

(7)細(xì)胞移植：將第5步準(zhǔn)備好的細(xì)胞用移液管槍頭轉(zhuǎn)移到打好的洞內(nèi)，轉(zhuǎn)移好所有細(xì)胞，蓋上硅膠膜，必要時(shí)可縫合皮膚與膜片，然后鋪一層凡士林紗布，包扎小鼠。

(8)觀察處理：及時(shí)觀察小鼠，7-10天去掉包扎，3周后可見毛發(fā)生長。

作為優(yōu)選，所述步驟(1)表皮細(xì)胞分離的步驟為：將c57乳鼠的表皮組織切成均勻的粘稠狀，置于含有0.025%胰酶的dpbs中，37℃水浴震蕩消化20-30分鐘，100um過濾器過濾，細(xì)胞懸液用含10%fbs的dmem中和，低速離心，沉淀用f12培養(yǎng)基洗一次，然后再用f12培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

真皮細(xì)胞分離的步驟為：用手術(shù)刀將乳鼠真皮組織切成粘稠狀，用含2.5mg/ml一型膠原酶的dmem在37℃水浴中震蕩消化25min，然后加入dnase繼續(xù)消化5min，100um過濾器過濾，細(xì)胞懸液用含10%fbs的dmem中和，離心，沉淀用f12培養(yǎng)基洗一次，然后再用f12培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中真皮和表皮細(xì)胞的混合比例為真皮：表皮=1-5：1。

作為優(yōu)選，所述步驟(4)中真皮和表皮細(xì)胞的混合比例為真皮：表皮=1-5：1。

作為優(yōu)選，所述步驟(6)中洞的大小在0.1-2mm之間，洞的數(shù)量根據(jù)洞的大小決定，洞與洞之間距離在0.5-1mm左右。

本發(fā)明的有益效果：

(1)操作簡單方便；

(2)創(chuàng)傷小，洞可大可小，靈活性好；

(3)毛囊形成效率高；

(4)可以注射的細(xì)胞數(shù)目范圍大；

(5)可以注射單細(xì)胞，也可用細(xì)胞團(tuán)塊；

(6)可以形成正常的皮膚結(jié)構(gòu)；

(7)符合美容要求，實(shí)際應(yīng)用前景廣。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施方式，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

本具體實(shí)施方式采用以下技術(shù)方案：一種體內(nèi)重建毛囊的方法，其步驟為：

(1)細(xì)胞分離：取出生1-3天的c57小鼠，剪去四肢和尾巴，用鑷子把整塊皮剝下，浸泡在含有2.5mg/ml解離酶的pbs中4℃孵育過夜，機(jī)械法將表皮細(xì)胞和真皮細(xì)胞分離。

①表皮細(xì)胞分離的步驟為：將c57乳鼠的表皮組織切成均勻的粘稠狀，置于含有0.025%胰酶的dpbs中，37℃水浴震蕩消化20-30分鐘，100um過濾器過濾，細(xì)胞懸液用含10%fbs的dmem中和，低速離心，沉淀用f12培養(yǎng)基洗一次，然后再用f12培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

②真皮細(xì)胞分離的步驟為：用手術(shù)刀將乳鼠真皮組織切成粘稠狀，用含2.5mg/ml一型膠原酶的dmem在37℃水浴中震蕩消化25min，然后加入dnase繼續(xù)消化5min，100um過濾器過濾，細(xì)胞懸液用含10%fbs的dmem中和，離心，沉淀用f12培養(yǎng)基洗一次，然后再用f12培養(yǎng)基重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)。

(2)細(xì)胞培養(yǎng)：上步新鮮分離的細(xì)胞可以直接進(jìn)行第五步細(xì)胞的移植前準(zhǔn)備，也可按照以下方法培養(yǎng)擴(kuò)增：

①表皮細(xì)胞培養(yǎng)：用含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到事先用包被基質(zhì)處理過的細(xì)胞培養(yǎng)瓶(細(xì)胞數(shù)大約在300萬-500萬每t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶)中，培養(yǎng)三天，之后換成cnt07或其它表皮培養(yǎng)基培養(yǎng)，每2天換液一次，顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞長滿時(shí)進(jìn)行傳代或后續(xù)研究，表皮按1：3傳代。

②真皮細(xì)胞培養(yǎng)：10%胎牛血清的dmem并帶有fgf生長因子的真皮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種在100mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每5天換一次液，細(xì)胞長滿后傳代或直接進(jìn)行第3步，真皮按1：3-10倍傳代。

(3)細(xì)胞球培養(yǎng)：取分離或培養(yǎng)好的真皮和表皮細(xì)胞按一定比例混合(真皮：表皮=1-5：1)，重懸在含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem真皮培養(yǎng)基中，接種到不能貼壁的培養(yǎng)皿(6孔板)進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，在37度培養(yǎng)箱孵育16-24小時(shí)，形成細(xì)胞球狀。

(4)細(xì)胞團(tuán)塊培養(yǎng)：取分離或培養(yǎng)好的真皮和表皮細(xì)胞按一定比例混合(真皮：表皮=1-5：1)，重懸在含10mmrock蛋白激酶抑制劑的含10%胎牛血清的dmem真皮培養(yǎng)基中，接種到薄膜如硅膠膜上，在37度培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)形成細(xì)胞團(tuán)塊。

(5)移植前細(xì)胞準(zhǔn)備：可以直接取步驟(1)中的新鮮分離的皮膚單細(xì)胞，或步驟(2)中的培養(yǎng)擴(kuò)增的表皮和真皮細(xì)胞按一定比例混合的單細(xì)胞，或步驟(3)中的細(xì)胞球，又或步驟(4)中的細(xì)胞團(tuán)塊，將其重懸在5-10ulf12培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)可以控制在1000-100萬/ul的濃度進(jìn)行移植。

(6)在裸鼠皮膚上打洞：將免疫缺陷小鼠(裸鼠)麻醉，用21g針頭或取皮器進(jìn)行皮膚打洞，洞的大小在0.1-2mm之間，洞的數(shù)量根據(jù)洞的大小決定，洞與洞之間距離在0.5-1mm左右。

(7)細(xì)胞移植：將第5步準(zhǔn)備好的細(xì)胞用移液管槍頭轉(zhuǎn)移到打好的洞內(nèi)，轉(zhuǎn)移好所有細(xì)胞，蓋上硅膠膜，必要時(shí)可縫合皮膚與膜片，然后鋪一層凡士林紗布，包扎小鼠。

(8)觀察處理：及時(shí)觀察小鼠，7-10天去掉包扎，3周后可見毛發(fā)生長。

本具體實(shí)施方式通過先在皮膚上打洞，然后再把單細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)塊用移液管或注射器打到洞內(nèi)來達(dá)到重建毛囊的目的，該方法簡稱孔洞法，相比傳統(tǒng)的小室法、注射法和移植法，不僅操作簡便，創(chuàng)傷小，而且可以注射的細(xì)胞數(shù)目范圍大，可以形成正常的皮膚結(jié)構(gòu)，毛囊形成效率高，符合現(xiàn)代美容要求，適合開發(fā)應(yīng)用于臨床上或醫(yī)美上治療脫發(fā)疾病，具有廣闊的應(yīng)用前景。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。