本發(fā)明涉及一種病毒培養(yǎng)用的體外模型，具體地，涉及一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法。
背景技術(shù)：
在病毒學(xué)的發(fā)展史中，常利用易感動(dòng)物如家兔、小白鼠、豚鼠等對(duì)目的病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物模型可以觀察病毒對(duì)機(jī)體的侵害，造成病理變化的部位，但動(dòng)物個(gè)體差異大，價(jià)格昂貴，還需要特殊的動(dòng)物房，因此推廣起來(lái)成本巨大。隨著科學(xué)的發(fā)展，也出現(xiàn)了很多體外培養(yǎng)病毒的模型，但常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)模型往往并不能反應(yīng)病毒在體內(nèi)的致病過(guò)程。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明目的：為了克服以上不足，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，運(yùn)用三維培養(yǎng)技術(shù)，既能避免動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的高成本，又能最大程度的模擬動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)模式，使所培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)立體生長(zhǎng)方式，形成類似體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有助于模擬病毒體內(nèi)的致病過(guò)程，該模型方法簡(jiǎn)便，成本低廉，推廣方便。
技術(shù)方案：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準(zhǔn)備：稱取1-3份的微載體，置于玻璃容器內(nèi)，按照微載體1份：50ml磷酸鹽緩沖液的比例加入磷酸鹽緩沖液，混勻1-3h，然后再用新鮮的清洗液洗滌2-3次，再按照微載體1份：50ml磷酸鹽緩沖液的比例加入新鮮的磷酸鹽緩沖液，高壓滅菌，冷卻后4℃保存；
（2）細(xì)胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細(xì)胞貼壁阻滯劑粉末，加入無(wú)水乙醇，密封后混勻10-30分鐘，4℃保存；
（3）準(zhǔn)備6孔板，將制備好的細(xì)胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風(fēng)干，再將制備好的細(xì)胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括70-90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10-30%的胎牛血清，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖82-88份、碳酸氫鈉12-25份、丙酮酸鈉10-16份、人血白蛋白5-9份、氯化鉀35-45份、無(wú)水硫酸鎂6-10份、氯化鈉70-78份、無(wú)水磷酸二氫鈉10-14份、pha-植物血球凝集素0.4-0.8份、葉酸0.3-0.5份、肌醇0.8-1.2份、煙酰胺0.3-0.6份、無(wú)水氯化鈣25-35份、硝酸鐵0.2-0.4份、丁二酸6-8份、丁二酸鈉12-16份、d-泛酸鈣0.3-0.6份、酒石酸膽堿0.6-0.8份、核黃素0.1-0.3份、鹽酸硫胺0.2-0.4份、鹽酸吡哆辛0.3-0.5份、還原谷胱甘肽0.2-0.6份、膽固醇2-4份、抗壞血酸磷酸酯0.6-1份、聚碳酸酯0.4-0.9份、酚紅鈉1-1.3份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細(xì)胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，3-4天等細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)成型后，即可進(jìn)行病毒接種實(shí)驗(yàn)。
該模型的建立既能避免動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的高成本，又能最大程度的模擬動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)模式，使所培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)立體生長(zhǎng)方式，形成類似體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有助于模擬病毒體內(nèi)的致病過(guò)程，該模型方法簡(jiǎn)便，成本低廉，推廣方便。
進(jìn)一步的，上述的一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，其所述微載體為cytodex3。與cytodex1/2相比，該種微載體實(shí)用性更廣，適合更多類型的細(xì)胞接種，便于多種疾病模型的建立。
進(jìn)一步的，上述的一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，其所述細(xì)胞貼壁阻滯劑為poly-hema。該阻滯劑可以有效的阻止細(xì)胞貼附在培養(yǎng)板底部，進(jìn)而促進(jìn)三維培養(yǎng)模型的順利建立。
進(jìn)一步的，上述的一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，其所述高壓滅菌時(shí)的溫度為120℃-140℃，滅菌時(shí)間30-50分鐘。
進(jìn)一步的，上述的一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計(jì)，
氯化鈉：50-80份
氯化鉀：2-5份
磷酸氫二鈉：10-15份
磷酸二氫鉀：1-5份
氯化鎂：8-10份
葡萄糖：5-10份
去離子水：40-50份。
進(jìn)一步的，上述的一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，其所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時(shí)稀釋10倍，調(diào)整ph=7.3。
進(jìn)一步的，上述的一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，其所述的玻璃容器，為清潔干凈并滅菌后的帶蓋玻璃瓶。
各種配方組成組分合理，操作步驟簡(jiǎn)便易行，并且生產(chǎn)成本低，適合推廣。
有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明所述的一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法既能避免動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)的高成本，又能最大程度的模擬動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)模式，使所培養(yǎng)的細(xì)胞呈現(xiàn)立體生長(zhǎng)方式，形成類似體內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有助于模擬病毒體內(nèi)的致病過(guò)程，該模型方法簡(jiǎn)便，成本低廉，推廣方便。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明所述的一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法示意圖。
具體實(shí)施方式
下面將通過(guò)幾個(gè)具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實(shí)施例只是為了說(shuō)明問(wèn)題，并不是一種限制。
實(shí)施例1
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準(zhǔn)備：稱取1份的微載體，置于玻璃容器內(nèi)，加入50ml磷酸鹽緩沖液，混勻1h，然后再用新鮮的清洗液洗滌2次，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計(jì)，氯化鈉：50份、氯化鉀：2份、磷酸氫二鈉：10份、磷酸二氫鉀：1份、氯化鎂：8份、葡萄糖：5份和去離子水：40份。再加入50ml新鮮的磷酸鹽緩沖液，120℃高壓滅菌30分鐘，冷卻后4℃保存；
（2）細(xì)胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細(xì)胞貼壁阻滯劑粉末，加入無(wú)水乙醇，密封后混勻10分鐘，4℃保存；
（3）準(zhǔn)備6孔板，將制備好的細(xì)胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風(fēng)干，再將制備好的細(xì)胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括70%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖82份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉10份、人血白蛋白5份、氯化鉀35份、無(wú)水硫酸鎂6份、氯化鈉70份、無(wú)水磷酸二氫鈉10份、pha-植物血球凝集素0.4份、葉酸0.3份、肌醇0.8份、煙酰胺0.3份、無(wú)水氯化鈣25份、硝酸鐵0.2份、丁二酸6份、丁二酸鈉12份、d-泛酸鈣0.3份、酒石酸膽堿0.6份、核黃素0.1份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.3份、還原谷胱甘肽0.2份、膽固醇2份、抗壞血酸磷酸酯0.6份、聚碳酸酯0.4份、酚紅鈉1份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細(xì)胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，3天等細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)成型后，即可進(jìn)行病毒接種實(shí)驗(yàn)。
其中，所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時(shí)稀釋10倍，調(diào)整ph=7.3。
實(shí)施例2
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準(zhǔn)備：稱取2份的微載體，置于玻璃容器內(nèi)，加入100ml磷酸鹽緩沖液，混勻2h，然后再用新鮮的清洗液洗滌2次，其所述清洗液包括如下組份：按重量組份計(jì)，氯化鈉：60份、氯化鉀：3份、磷酸氫二鈉：12份、磷酸二氫鉀：3份、氯化鎂：9份、葡萄糖：6份和去離子水：40份。再加入100ml新鮮的磷酸鹽緩沖液，120℃高壓滅菌，冷卻后4℃保存；
（2）細(xì)胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細(xì)胞貼壁阻滯劑粉末，加入無(wú)水乙醇，密封后混勻15分鐘35分鐘，4℃保存；
（3）準(zhǔn)備6孔板，將制備好的細(xì)胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風(fēng)干，再將制備好的細(xì)胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括90%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及10%的胎牛血清，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉25份、丙酮酸鈉16份、人血白蛋白9份、氯化鉀45份、無(wú)水硫酸鎂10份、氯化鈉78份、無(wú)水磷酸二氫鈉14份、pha-植物血球凝集素0.8份、葉酸0.5份、肌醇1.2份、煙酰胺0.6份、無(wú)水氯化鈣35份、硝酸鐵0.4份、丁二酸8份、丁二酸鈉16份、d-泛酸鈣0.6份、酒石酸膽堿0.8份、核黃素0.3份、鹽酸硫胺0.4份、鹽酸吡哆辛0.5份、還原谷胱甘肽0.6份、膽固醇4份、抗壞血酸磷酸酯1份、聚碳酸酯0.9份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細(xì)胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，3天等細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)成型后，即可進(jìn)行病毒接種實(shí)驗(yàn)。
其中，所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時(shí)稀釋10倍，調(diào)整ph=7.3。
實(shí)施例3
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準(zhǔn)備：稱取2份的微載體，置于玻璃容器內(nèi)，加入100ml磷酸鹽緩沖液，混勻2h，然后再用新鮮的清洗液洗滌3次，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計(jì)，氯化鈉：70份、氯化鉀：4份、磷酸氫二鈉：12份、磷酸二氫鉀：4份、氯化鎂：9份、葡萄糖：8份和去離子水：50份。再加入100ml新鮮的磷酸鹽緩沖液，140℃高壓滅菌40分鐘，冷卻后4℃保存；
（2）細(xì)胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細(xì)胞貼壁阻滯劑粉末，加入無(wú)水乙醇，密封后混勻20分鐘，4℃保存；
（3）準(zhǔn)備6孔板，將制備好的細(xì)胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風(fēng)干，再將制備好的細(xì)胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括80%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及20%的胎牛血清，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖86份、碳酸氫鈉18份、丙酮酸鈉12份、人血白蛋白6份、氯化鉀40份、無(wú)水硫酸鎂8份、氯化鈉75份、無(wú)水磷酸二氫鈉12份、pha-植物血球凝集素0.5份、葉酸0.4份、肌醇1份、煙酰胺0.5份、無(wú)水氯化鈣30份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.3份、鹽酸吡哆辛0.4份、還原谷胱甘肽0.5份、膽固醇3份、抗壞血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.8份、酚紅鈉1.2份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細(xì)胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，4天等細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)成型后，即可進(jìn)行病毒接種實(shí)驗(yàn)。
其中，所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時(shí)稀釋10倍，調(diào)整ph=7.3。
實(shí)施例4
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)便的病毒體外三維培養(yǎng)模型的建立方法，包括以下操作步驟：
（1）微載體混懸液的準(zhǔn)備：稱取3份的微載體，置于玻璃容器內(nèi)，加入150ml磷酸鹽緩沖液，混勻3h，然后再用新鮮的清洗液洗滌3次，所述清洗液包括如下組份：按重量組份計(jì)，氯化鈉：80份、氯化鉀：5份、磷酸氫二鈉：15份、磷酸二氫鉀：5份、氯化鎂：10份、葡萄糖：10份和去離子水：50份。再加入150ml新鮮的磷酸鹽緩沖液，140℃高壓滅菌50分鐘，冷卻后4℃保存；
（2）細(xì)胞貼壁阻滯劑制備：按照2.5%的濃度制備，稱取細(xì)胞貼壁阻滯劑粉末，加入無(wú)水乙醇，密封后混勻30分鐘，4℃保存；
（3）準(zhǔn)備6孔板，將制備好的細(xì)胞貼壁阻滯劑均勻鋪在6孔板里，靜置風(fēng)干，再將制備好的細(xì)胞以105/ml的濃度接種于6孔板中，所述細(xì)胞培養(yǎng)基包括70%的基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及30%的胎牛血清，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基以重量組分計(jì)，包括以下組分：葡萄糖88份、碳酸氫鈉12份、丙酮酸鈉12份、人血白蛋白6份、氯化鉀35份、無(wú)水硫酸鎂10份、氯化鈉70份、無(wú)水磷酸二氫鈉14份、pha-植物血球凝集素0.4份、葉酸0.4份、肌醇0.9份、煙酰胺0.5份、無(wú)水氯化鈣28份、硝酸鐵0.3份、丁二酸7份、丁二酸鈉14份、d-泛酸鈣0.5份、酒石酸膽堿0.7份、核黃素0.2份、鹽酸硫胺0.2份、鹽酸吡哆辛0.5份、還原谷胱甘肽0.6份、膽固醇3份、抗壞血酸磷酸酯0.8份、聚碳酸酯0.4份、酚紅鈉1.3份和去離子水100份；再加入制備好的微載體混懸液，細(xì)胞液與微載體混懸液比例為4:1，混勻后，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，4天等細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)成型后，即可進(jìn)行病毒接種實(shí)驗(yàn)。
其中，所述磷酸鹽緩沖液的制備方法包括如下步驟，
（1）精確稱取氯化鈉80g，氯化鉀2g，磷酸氫二鈉13.96g，磷酸二氫鉀2g，放入同一玻璃容器中；
（2）向上述玻璃容器中加去離子水至800ml，攪拌30分鐘使鹽溶解；
（3）再定容至1000ml，得到10x的磷酸鹽緩沖液，臨用時(shí)稀釋10倍，調(diào)整ph=7.3。
以上所述僅是發(fā)明的幾個(gè)實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。