本發(fā)明涉及一種生物培養(yǎng)技術(shù)，具體是一種犢牛小腸上皮細胞體外培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

在哺乳動物中，小腸是食物進行消化吸收的主要場所，而小腸黏膜上皮細胞是腸道的功能細胞，參與腸道食糜的消化、吸收、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等，并與腸道的內(nèi)、外分泌功能有密切關(guān)系。因此，體外分離培養(yǎng)小腸上皮細胞對于研究小腸生理功能、營養(yǎng)物質(zhì)吸收機制、藥物作用以及各種致病因素作用下的病理生理改變具有重要意義。一些發(fā)達國家已經(jīng)在醫(yī)藥開發(fā)等領(lǐng)域建立了多種小腸上皮細胞株，但其動物種屬僅限于小鼠、大鼠和人；而對于畜牧業(yè)動物的細胞營養(yǎng)代謝方面的研究才剛剛起步，尤其在牛上的研究報道更為少見，這主要是由于迄今為止還沒有建立成熟的小腸上皮細胞體外培養(yǎng)方法。

目前，牛小腸上皮細胞培養(yǎng)主要存在兩個問題。(1)取樣牛只選擇。研究中發(fā)現(xiàn)，利用成年牛進行小腸上皮細胞體外培養(yǎng)成功率極低，這是因為成年牛腸道內(nèi)存有大量食糜和微生物菌群，即使用大量磷酸鹽緩沖液(pbs)沖洗也有可能殘留細菌，造成原代培養(yǎng)污染；而且成年牛腸道上皮細胞已高度分化，幾乎不能貼壁生長。(2)上皮細胞純度低。原代培養(yǎng)主要采用蛋白酶消化法分離小腸隱窩上皮細胞。操作時將小腸縱向剪開，pbs液沖洗后加入蛋白酶消化液處理，待腸道隱窩從腸壁脫落后加入培養(yǎng)液終止消化，收集液體離心洗滌，最后接種培養(yǎng)(lorets,rusud,eimoualijb,taminiaub,heinene,dandrifosseg,mainilj.preliminarycharacterizationofjejunocyteandcolonocytecelllinesisolatedbyenzymaticdigestionfromadultandyoungcattle.resvetsci.2009,87(1):123-32)。盡管這種方法能分離獲得大量上皮細胞，但缺點也是顯而易見的，因為蛋白酶消化腸道黏膜組織時，不可避免也會將腸管外壁的平滑肌細胞、成纖維細胞分離下來，造成培養(yǎng)的細胞中既有上皮細胞又有成纖維樣細胞，上皮細胞混雜于成纖維樣細胞中生長。(3)分離成纖維細胞和上皮細胞步驟繁瑣且影響細胞活性。為了分離成纖維細胞和上皮細胞，傳統(tǒng)方法一般要加入胰酶消化后觀察有成纖維樣細胞松動脫落但上皮細胞未松動時終止消化，加入培養(yǎng)液后輕輕吹打盡量將脫落的成纖維樣細胞去掉，然后將殘留的細胞傳代培養(yǎng)，待細胞貼壁80-90％后再用胰酶消化處理去掉殘余的成纖維樣細胞，這樣造成純化過程中上皮細胞多次傳代培養(yǎng)，使細胞活性和分泌功能降低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服上述小腸上皮細胞體外培養(yǎng)方法的缺點，本發(fā)明提供了一種新的小腸上皮細胞的體外培養(yǎng)方法。本發(fā)明(1)腸道組織取樣時選擇剛出生、未吸允過母乳或其他任何食物的健康犢牛。由于犢牛的腸道環(huán)境理論上是無菌的，而且犢牛腸道上皮細胞大部分處于未分化狀態(tài)，增殖能力強，易于貼壁生長和傳代培養(yǎng)。(2)不將腸管縱向剪開，而是利用特制的撐開器(圖1)將腸管撐開，充分沖洗腸道內(nèi)胎糞，注入蛋白酶消化液后獲得大量游離的隱窩，接種后貼壁生長即為小腸上皮細胞。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種犢牛小腸上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，其特征是，取犢牛小腸，將腸管撐開器導(dǎo)入腸管并將腸管撐開，用pbs液沖洗腸道胎糞直至流出的液體清亮，然后用止血鉗封閉腸管一端，注滿蛋白酶消化液(每100mldmem液中加入50±5mg膠原蛋白酶，40±4mg中性蛋白酶，充分溶解后經(jīng)0.22μm濾器過濾后使用)后再封閉腸管另一端，置于搖床37℃消化1-1.5小時，收集液體離心洗滌兩次，最后加入培養(yǎng)液接種培養(yǎng)；12-24小時后細胞貼壁生長，3-4天后有約90％細胞貼壁，即為小腸上皮細胞。

具體包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)液配制

每450-500ml細胞培養(yǎng)液(dmem/f12)中加入50-60ml胎牛血清(fbs)、5-10ml青鏈霉素混合液、0.1-0.2g的谷胱甘肽、0.2-0.5mg的胰島素、0.01-0.05mg的胰島素樣生長因子和0.01-0.05g的丁酸鈉；然后經(jīng)0.22微米濾膜過濾后分裝到滅菌的離心管中，每管40-45毫升，放置4℃保存，兩周內(nèi)用完。細胞培養(yǎng)前0.5-1小時將培養(yǎng)液放在37℃水浴鍋中預(yù)熱。

(2)小腸上皮細胞培養(yǎng)

從屠宰場內(nèi)采集剛出生、未吸允過母乳及其他任何食物的健康犢牛的小腸，放在含1％青鏈霉素混合液的pbs液中帶回實驗室。在超凈臺內(nèi)用剪刀去除腸系膜、脂肪組織，然后用鑷子夾住腸管一端，手持撐開器緩緩導(dǎo)入腸管直至將腸管完全撐開，用10-20ml注射器抽取pbs液沖洗腸管，待流出的液體清亮后用止血鉗封閉腸管一端，用注射器注滿蛋白酶消化液(每100mldmem液中加入50±5mg膠原蛋白酶，40±4mg中性蛋白酶，充分溶解后經(jīng)0.22μm濾器過濾后使用)，再用止血鉗將腸管另一端封閉，置于搖床37℃消化1-1.5小時。收集液體并加入等體積的培養(yǎng)液終止消化，置于50ml離心管中離心(150-200×g、5分鐘)，之后去掉上清液加入含2％山梨糖醇的培養(yǎng)液離心洗滌兩次，最后加入培養(yǎng)液重懸離心管底部沉淀物，按800-1000個隱窩/ml接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。12-24小時后細胞貼壁生長，3-4天后有約90％細胞貼壁。

本發(fā)明的腸管撐開器，它包括前置環(huán)、螺旋鋼圈、后置環(huán)和手柄依次連接；其中手柄與后置環(huán)的連接為可拆卸連接。使用時，將前置環(huán)放入小腸的一端，轉(zhuǎn)動手柄使螺旋鋼圈旋轉(zhuǎn)緩緩進入小腸，將后置環(huán)留在小腸的另一端。注入蛋白酶消化液后取下手柄，用止血鉗封閉腸管。

本發(fā)明的有益效果是：(1)本發(fā)明采用專用的腸道撐開器將腸管撐開，注入pbs液后能快速將腸道內(nèi)胎糞沖洗干凈；而且在加入蛋白酶消化液后，消化液與腸道黏膜充分接觸，能快速、均勻地將隱窩消化下來，獲得大量游離的隱窩，接種后貼壁生長即為小腸上皮細胞。由于本發(fā)明中蛋白酶消化液直接注入腸腔內(nèi)，不與腸道外壁接觸，所以不會將腸道外壁的成纖維細胞和肌肉細胞消化下來，最大程度地保證了上皮細胞的純度，也省略了分離成纖維細胞和上皮細胞的步驟，大大簡化了方法。(2)本發(fā)明在培養(yǎng)液中添加對上皮細胞增殖有明顯促進作用的能量物質(zhì)谷胱甘肽、促進細胞分化的胰島素、胰島素樣生長因子和丁酸鈉，使培養(yǎng)環(huán)境更利于上皮細胞增殖、分化，因此在接種后3-4天即可獲得90％左右細胞貼壁。(3)本發(fā)明采用腸管撐開器具有以下好處：將腸道全部撐開，使腸道內(nèi)胎糞沖洗和蛋白酶消化這兩個步驟進行地比較徹底，不容易留死角，且能獲得大量游離的隱窩；同時沖洗和消化的速度快，不影響細胞活性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明專用的腸管撐開器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為犢牛小腸上皮細胞采用實施例1的方法培養(yǎng)3天后的100×照片；

圖中：1、前置環(huán)，2、螺旋鋼圈，3、后置環(huán)，4、手柄。

具體實施方式

如圖1所示，本發(fā)明的腸管撐開器包括前置環(huán)1、螺旋鋼圈2、后置環(huán)3和手柄4依次連接，其中前置環(huán)1、螺旋鋼圈(類似彈簧，圖1中設(shè)有4節(jié)螺旋鋼圈)2和后置環(huán)為固定連接；手柄4通過可拆卸的方式(如螺紋連接、卡扣連接等)與后置環(huán)3可拆卸連接在一起。

使用時，將前置環(huán)放入小腸的一端，螺旋鋼圈旋轉(zhuǎn)緩緩進入小腸，將后置環(huán)留在小腸的另一端。上述腸管撐開器的兩端采用圓環(huán)形式便于將腸管撐到最大。由于小腸具有扁、彎曲的特點，腸管撐開器中間采用螺旋鋼圈形式，便于采用旋轉(zhuǎn)形式相對容易地進入小腸，同時螺旋鋼圈形式可以提高腸管撐開器的可伸縮性，使之適用于不同長度的小腸，也便于小腸兩端扎口。手柄采用可拆卸形式便于在注入蛋白酶消化液后取下手柄，用止血鉗封閉腸管。

實施例1

(1)培養(yǎng)液配制

每500ml細胞培養(yǎng)液(dmem/f12)中加入55ml胎牛血清(fbs)、5ml青鏈霉素混合液[青霉素-鏈霉素混合液(100x)，青霉素含量為10000u/ml，鏈霉素的含量為10mg/ml]、0.1g的谷胱甘肽、0.3mg胰島素、0.05mg的胰島素樣生長因子溶液和0.05g的丁酸鈉；然后經(jīng)0.22微米濾膜過濾后分裝到滅菌的離心管中，每管40毫升，放置4℃保存，兩周內(nèi)用完。細胞培養(yǎng)前1小時將培養(yǎng)液放在37℃水浴鍋中預(yù)熱。

(2)小腸上皮細胞培養(yǎng)

從屠宰場內(nèi)采集剛出生、未吸允過母乳或其他任何食物的健康犢牛的小腸，放在含1％青鏈霉素混合液的pbs中帶回實驗室。在超凈臺內(nèi)用剪刀去除腸系膜、脂肪組織，然后用鑷子夾住腸管一端，手持腸管撐開器緩緩導(dǎo)入腸管直至將腸管完全撐開，用20ml注射器抽取pbs液沖洗腸管(沖洗過程中緩緩移動一下腸管撐開器，使與腸管撐開器接觸的地方也得到充分沖洗)。待流出的液體清亮后用止血鉗封閉腸管一端，用注射器注滿蛋白酶消化液(每100mldmem液中加入50mg膠原蛋白酶，40mg中性蛋白酶，充分溶解后經(jīng)0.22μm濾器過濾后使用)，再用止血鉗將腸管另一端封閉，置于搖床37℃消化1.5小時。收集液體并加入等體積的培養(yǎng)液終止消化，置于50ml離心管中離心(200×g、5分鐘)，之后去掉上清液加入含2％山梨糖醇的培養(yǎng)液離心洗滌兩次，最后加入培養(yǎng)液重懸離心管底部沉淀物，按1000個隱窩/ml接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％co2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。18小時后細胞貼壁生長，3天后有約90％細胞貼壁(圖2)。在倒置顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)呈不規(guī)則多角形，猶如鵝卵石狀，而且邊界清楚、成簇生長，這些都是上皮細胞的典型特征。小腸上皮細胞純度達98％以上。