本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種菊糖的生產(chǎn)工藝，具體涉及一種聯(lián)合應(yīng)用超聲輔助和微生物發(fā)酵法制備菊芋菊糖的方法。

背景技術(shù)：

菊芋又名洋姜，具有很強(qiáng)的抗寒抗旱抗病能力，特別適合在沿海灘涂、貧瘠山地等不適合糧食種植的地區(qū)種植，已被廣泛用于防沙治沙、水土保持、改良鹽土等生態(tài)環(huán)境治理。菊芋富含菊糖，有低熱量、非胰島素依賴性等特點(diǎn)，具有預(yù)防臼齒、防治糖尿病，調(diào)節(jié)血壓、減肥、預(yù)防心血管疾病、提高免疫力、預(yù)防結(jié)腸癌、防止便秘、腹瀉等保健功能，是被國際組織認(rèn)定的新型果糖替代物和歐盟新作物發(fā)展計(jì)劃的首選作物，具有廣闊的市場(chǎng)開發(fā)前景。

目前菊糖產(chǎn)品在國內(nèi)外市場(chǎng)需求巨大，我國食品界也正逐漸將菊糖應(yīng)用于乳制品、面包、糖果、飲料、調(diào)味料等食品加工領(lǐng)域。但我國的菊糖產(chǎn)業(yè)還是一個(gè)比較新興的行業(yè)，菊糖加工關(guān)鍵技術(shù)壁壘一直難以逾越。傳統(tǒng)的菊糖生產(chǎn)方法要包括去皮、切絲、熱水浸提、石灰乳-磷酸法去雜、活性炭脫色、離子交換、納濾膜濃縮、噴霧干燥等生產(chǎn)工藝，存在提取效率低、純化工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、菊糖損失率高、產(chǎn)品活性低、品質(zhì)差等技術(shù)瓶頸，嚴(yán)重制約著我國以菊芋為原料的菊糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展。蔣玉婷等報(bào)道利用復(fù)合酶酶解可提高菊糖提取效率，但因?yàn)樯锩傅奶砑蛹葘?dǎo)致了菊糖生產(chǎn)成本的提高，又給后續(xù)純化工藝增加了負(fù)擔(dān)而難以實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。(江玉婷，陳靖超，李程程，等.復(fù)合酶法提取菊芋菊糖的工藝優(yōu)化.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017,45(8):98-102)。因此，有必要對(duì)現(xiàn)有菊芋菊糖的提取工藝進(jìn)行改進(jìn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明的目的：本發(fā)明旨在提供一種聯(lián)合應(yīng)用超聲輔助和微生物發(fā)酵法制備菊芋菊糖的方法，該生產(chǎn)工藝操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低，脫色率和蛋白率脫除率高、菊糖的提取率可達(dá)95％以上，純度達(dá)95％以上，產(chǎn)品具有抗氧化、調(diào)節(jié)胃腸功能、預(yù)防便秘等保健功能。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明所述的聯(lián)合應(yīng)用超聲輔助和微生物發(fā)酵法制備菊芋菊糖的方法，包括：

(1)打漿：新鮮菊芋經(jīng)清洗，切片，漂燙后，流水冷卻，撈出瀝干水分，按一定料液比加水打漿；

(2)超聲提?。簩?duì)打漿所得的菊芋漿液進(jìn)行超聲處理，得菊芋超聲提取液；

(3)發(fā)酵：向菊芋超聲提取液中接種酵母菌發(fā)酵一定時(shí)間，得菊芋發(fā)酵液；

(4)二次超聲提?。簩⒕沼蟀l(fā)酵液再進(jìn)行超聲處理，得二次提取液；

(5)純化精制：對(duì)二次提取液進(jìn)行分離純化，得菊芋菊糖。

本發(fā)明聯(lián)合應(yīng)用超聲輔助和微生物發(fā)酵法制備菊芋菊糖的生產(chǎn)工藝，不僅可顯著提高菊糖的提取效率和純度，還省去了石灰乳-磷酸法去雜、活性炭脫色等幾個(gè)關(guān)鍵的傳統(tǒng)生產(chǎn)工序，既簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝、降低了生產(chǎn)成本，提高了菊芋資源的利用率，還能保證所制備的菊糖具有較高的生物活性。

步驟(1)中，打漿原料選擇新鮮、無病變、無霉變的鮮菊芋，打漿前，將菊芋洗凈，切片，片厚1～2cm，95～100℃下漂燙護(hù)色1～2min。

所述打漿的料液比(質(zhì)量體積比，g/ml)為1:5～7，優(yōu)選為1:6。

步驟(2)中，所述超聲處理的條件為：超聲功率為500～700w、超聲時(shí)間為30～90min，溫度為50～60℃；優(yōu)選的，超聲功率為550～650w，超聲時(shí)間為55～65min；更優(yōu)選的，超聲功率為600w，超聲時(shí)間為60min。

在確定上述菊糖提取條件時(shí)，首先設(shè)計(jì)了料液比、超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度的單因素試驗(yàn)，確定了各因素適宜的變化范圍，在此基礎(chǔ)上，以料液比、超聲功率、超聲時(shí)間為試驗(yàn)因素，采用box-benhnken中心組合試驗(yàn)法，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化了最佳的菊糖提取工藝。得到的以菊糖提取率為響應(yīng)值的回歸方程為：

提取率

(％)＝96.35-1.10a-0.57b-0.48c+1.97ab-0.18ac+1.81bc-6.44a²-7.10b²-5.77c²。

通過方差分析和顯著性檢驗(yàn)以及響應(yīng)面分析，發(fā)現(xiàn)該模型顯著，菊芋菊糖最佳提取工藝條件為：料液比1:6、超聲功率600w、超聲時(shí)間60min。在此條件下，菊糖提取率達(dá)96.43％。其中試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2，響應(yīng)面分析結(jié)果見圖1～圖3。

表1試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2方差分析與顯著性檢驗(yàn)

步驟(3)中，所述的酵母菌一般為活性干酵母，具體為釀酒酵母。

所述發(fā)酵的條件為：按0.02％～0.05％的質(zhì)量百分比接種酵母菌發(fā)酵劑。

所述發(fā)酵的溫度為25～28℃，時(shí)間為2～3天。

步驟(4)中，通過二次超聲以使菊糖提取完全，所述超聲處理?xiàng)l件為：超聲功率為500～700w、超聲時(shí)間為15～20min，溫度為50～60℃。

步驟(5)中，所述的純化精制包括：將所述的二次提取液過濾，濾液濃縮至1/4～1/5倍體積后調(diào)整濃度，然后用大孔樹脂進(jìn)行吸附，洗脫后得菊糖液，菊糖液濃縮干燥，得所述的菊芋菊糖。

所述調(diào)整濃度是指用蒸餾水將菊糖濃縮濾液的濃度調(diào)整至0.01～0.02g/ml。

所述的大孔樹脂優(yōu)選為s-8或d301-g大孔樹脂。樹脂在使用前需進(jìn)行預(yù)處理，再采用濕法裝柱，此為本領(lǐng)域常規(guī)操作。

進(jìn)行精制時(shí)，精選了型號(hào)為d3520、s-8、d201、d301-g共4種樹脂，采用靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)解析試驗(yàn)，通過比較其對(duì)菊糖的保留和脫色的效果，優(yōu)選出s-8大孔樹脂和d301-g作為精制適宜樹脂，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3四種樹脂對(duì)菊芋菊糖溶液的脫色效果比較

洗脫時(shí)用純凈水進(jìn)行，待洗脫液中蛋白質(zhì)脫除率和脫色率均達(dá)到90％以上時(shí)停止洗脫。濃縮干燥時(shí)，先將洗脫后的菊糖液于55～65℃下濃縮至1/5～1/10倍體積，再置于真空干燥箱中于40～55℃條件下進(jìn)行真空干燥。

本發(fā)明所制備的菊芋菊糖純度達(dá)95％以上，其相對(duì)分子量為2784，聚合度為17；結(jié)構(gòu)是gfn型結(jié)構(gòu)，即由16個(gè)呋喃型的果糖以β-(1→2)糖苷鍵相連，末端的1個(gè)吡喃型葡萄糖以α-(1→2)糖苷鍵連接到果糖上的線性直鏈結(jié)構(gòu)。

可利用菊糖的功能如預(yù)防臼齒、防治糖尿病、調(diào)節(jié)血壓、減肥、預(yù)防心血管疾病、提高免疫力、預(yù)防結(jié)腸癌、防止便秘、腹瀉等，將本發(fā)明所述的菊芋菊糖添加于食品、保健品或藥品中。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

1)該技術(shù)方案采用超聲波輔助法提取菊芋菊糖，利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)加速了細(xì)胞壁的破碎和菊糖的快速溶出，屬于中溫提取技術(shù)，與酶法輔助提取技術(shù)和傳統(tǒng)高溫提取技術(shù)相比，既克服了傳統(tǒng)高溫提取導(dǎo)致的菊糖活性降低以及應(yīng)用酶法提取引起的生產(chǎn)成本提高、后續(xù)純化工藝復(fù)雜等弊端，還極大地提高了菊糖的提取效率，提取率可高達(dá)95％以上。

2)在超聲輔助提取基礎(chǔ)上，利用酵母菌發(fā)酵時(shí)消耗還原糖、蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素等成分的特性，達(dá)到初步純化菊糖的目的，免去了傳統(tǒng)菊糖制備采用的石灰乳-磷酸脫蛋白、活性炭脫色等主要加工工序，極大的簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝、降低了生產(chǎn)成本、避免了繁瑣的工藝步驟造成的菊糖生物活性降低，保證了菊糖產(chǎn)品的營養(yǎng)保健功能。

3)只采用1種大孔樹脂進(jìn)行精制，克服了傳統(tǒng)生產(chǎn)中需依次通過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂、弱堿性陰離子交換樹脂引起的操作復(fù)雜、不利于工業(yè)化生產(chǎn)等缺點(diǎn)，具有效率高、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，具有極大的商業(yè)開發(fā)價(jià)值。

4)與傳統(tǒng)菊糖生產(chǎn)工藝相比，本發(fā)明具有高效經(jīng)濟(jì)、成本低、提取和精制條件溫和(不超過60℃)、對(duì)菊芋資源的利用率高、質(zhì)量穩(wěn)定、生物活性高等優(yōu)點(diǎn)，且產(chǎn)品純度高達(dá)95％以上。

附圖說明

圖1為料液比和超聲功率對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖；

圖2為料液比和超聲時(shí)間對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖；

圖3為超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖；

圖4為菊芋菊糖紅外吸收光譜圖；

圖5為菊芋菊糖的^1hnmr譜圖；

圖6為菊芋菊糖的^13cnmr譜圖；

圖7為菊芋菊糖分子結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

下面詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施例，需要說明的是，本實(shí)施例是敘述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

挑選新鮮、無病變、無霉變的鮮菊芋100kg，流水清洗干凈、切成厚度為1～2cm的薄片，95～100℃下漂燙1～2min，再加入500l的純凈水混合、打漿，漿液置于超聲設(shè)備中，在500w超聲功率、溫度50℃條件下超聲處理30min，所得菊芋超聲處理液放入1噸發(fā)酵罐，發(fā)酵罐中按0.05％的質(zhì)量百分比接種活性干酵母菌(釀酒酵母)發(fā)酵劑，25℃下恒溫發(fā)酵3天，得菊芋發(fā)酵液；菊芋發(fā)酵液置于超聲設(shè)備中，在500w超聲功率、溫度50℃條件下超聲處理20min，得菊芋二次提取液；菊芋二次提取液用8層紗布粗濾，濾液再通過管式離心機(jī)，于離心力3500g條件下離心15min，所得離心液經(jīng)真空濃縮至1/4倍體積后，用蒸餾水將濃縮液濃度調(diào)整至0.01g/ml，以2ml/min的流速通過s-8大孔樹脂柱，結(jié)束后再用純凈水進(jìn)行洗脫，待洗脫液中蛋白質(zhì)脫除率和脫色率均達(dá)到90％以上時(shí)，停止洗脫，洗脫液于55℃溫度下濃縮至1/10倍體積，再置于55℃真空干燥箱中進(jìn)行干燥，即可得到白色菊芋菊糖，其提取率為95.12％，純度為95.5％、灰分0.11％。

實(shí)施例2

挑選新鮮、無病變、無霉變的鮮菊芋100kg，流水清洗干凈、切成厚度為1～2cm的薄片，95～100℃下漂燙1～2min，再加入700l的純凈水混合、打漿，漿液置于超聲設(shè)備中，在700w超聲功率、溫度55℃條件下超聲處理50min，所得菊芋超聲處理液放入1噸發(fā)酵罐，發(fā)酵罐中按0.03％的質(zhì)量百分比接種活性干酵母菌(釀酒酵母)發(fā)酵劑，28℃下恒溫發(fā)酵2天，得菊芋發(fā)酵液；菊芋發(fā)酵液置于超聲設(shè)備中，在700w超聲功率、溫度55℃條件下超聲處理15min，得菊芋二次提取液；菊芋二次提取液用8層紗布粗濾，所得濾液再通過管式離心機(jī)，于離心力3500g條件下離心20min，所得離心液經(jīng)真空濃縮至1/5倍體積后，用純凈水將濃縮液濃度調(diào)整至0.02g/ml，以2ml/min的流速通過s-8大孔樹脂柱，結(jié)束后再用蒸餾水進(jìn)行洗脫，待洗脫液中蛋白質(zhì)脫除率和脫色率均達(dá)到90％以上時(shí)，停止洗脫，洗脫液于60℃溫度下濃縮至1/8倍體積，再置于50℃真空干燥箱中進(jìn)行干燥，即可得到白色菊芋菊糖，其提取率為96.67％，純度96.2％，灰分0.22％。

實(shí)施例3

挑選新鮮、無病變、無霉變的鮮菊芋100kg，流水清洗干凈、切成厚度為1～2cm的薄片，95～100℃下漂燙1～2min，再加入600l純凈水混合、打漿，漿液置于超聲設(shè)備中，在600w超聲功率、溫度60℃條件下超聲處理60min，所得菊芋超聲處理液放入1噸發(fā)酵罐，發(fā)酵罐中按0.02％的質(zhì)量百分比接種活性干酵母菌(釀酒酵母)發(fā)酵劑，28℃下恒溫發(fā)酵3天，得菊芋發(fā)酵液；菊芋發(fā)酵液置于超聲設(shè)備中，在600w超聲功率、溫度50℃條件下超聲處理20min，得菊芋二次提取液；菊芋二次提取液用8層紗布粗濾，所得濾液再通過管式離心機(jī)，于離心力3500g條件下離心15min，所得離心液經(jīng)真空濃縮至1/4倍體積后，用蒸餾水將濃縮液濃度調(diào)整至0.015g/ml，以2ml/min的流速通過d301-g大孔樹脂柱，結(jié)束后再用純凈水進(jìn)行洗脫，待洗脫液中蛋白質(zhì)脫除率和脫色率均達(dá)到90％以上時(shí)，停止洗脫，洗脫液于65℃溫度下濃縮至1/5倍體積。再置于55℃真空干燥箱中進(jìn)行干燥，即可得到白色菊芋菊糖。其提取率為97.12％，純度為97.1％，灰分0.15％。

分析所提取的菊糖的結(jié)構(gòu)。

其中，菊糖純度和相對(duì)分子量分析采用高效凝膠滲透色譜法進(jìn)行：將10mg/ml樣品溶液經(jīng)高效凝膠色譜分離，可根據(jù)峰型判斷樣品純度。分析條件為：ultrahydrogeltmlinear，300mm×7.8mmid色譜柱；流動(dòng)相0.1mol/l硝酸鈉溶液，流速0.9ml/min；柱溫45℃，進(jìn)樣量2μl，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)。以標(biāo)準(zhǔn)dextrant系列葡聚糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

菊糖結(jié)構(gòu)分析采用紅外光譜和1h及13cnmr波譜分析法。

紅外光譜分析：準(zhǔn)確取純化菊芋菊糖2mg，加入50mg的溴化鉀粉末，用壓片機(jī)壓成薄片，在4000cm-1-500cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，記錄紅外光譜圖。

¹hnmr核磁共振譜在頻率為400.13mhz下于bmkeravance400核磁共振儀上進(jìn)行。樣品于60℃以重水(d2o)溶解后，置于5mm內(nèi)徑的管中進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)取與me4si相距2.1ppm的丙酮的甲基(ch3)氫；^13cnmr(全氫去偶)在頻率為100.57mhz下于同一核磁共振儀上進(jìn)行，樣品于60℃以重水(d2o)溶解后，置于5mm內(nèi)徑的管中進(jìn)行檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)取與me4si相距31.5ppm的丙酮的甲基(ch3)碳。

紅外光譜圖見圖4，^1hnmr譜圖及^13cnmr譜圖見圖5和圖6，分子量測(cè)定結(jié)果見表4，分子結(jié)構(gòu)見圖7。

表4菊糖相對(duì)分子量測(cè)定結(jié)果

由上，本發(fā)明菊芋菊糖相對(duì)分子量為2784，聚合度為17，結(jié)構(gòu)是gfn型結(jié)構(gòu)，即由16個(gè)呋喃型的果糖以β-(1→2)糖苷鍵相連，末端的1個(gè)吡喃型葡萄糖以α-(1→2)糖苷鍵連接到果糖上的線性直鏈結(jié)構(gòu)。