本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體屬于一株能夠拮抗黃芪根腐病菌(fusariumacuminatum、fusariumsolani)和具有促進(jìn)植株生長能力的芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)sxkf16-1及其發(fā)酵培養(yǎng)基，以及它們在制備黃芪根腐病生防制劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃芪是我國中藥方劑中的大宗藥材，性溫，味甘，具補氣固表，托瘡生肌等功效，被廣泛用于臨床各科，素有“十藥八芪”之稱。由于黃芪極高的藥用價值，以及其藥理作用研究的不斷深入、藥用范圍的不斷拓寬，國內(nèi)外市場對黃芪的需求量日益增大。

黃芪主產(chǎn)于甘肅、內(nèi)蒙、山西等地。近年來，隨著種植面積的擴(kuò)大，輪作周期縮短，重茬和迎茬面積增加，致使黃芪根腐病在上述主產(chǎn)區(qū)均已普遍發(fā)生，且危害逐年加重，成為制約黃芪產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素。根腐病是一類極具毀滅性的土傳病害，素有“植物癌癥”之稱。在黃芪上，更是因其多年生特性，積重難返、難以防控。黃芪根腐病由多種病原菌混合侵染引起，主要包括腐皮鐮孢菌(fusariumsolani)、銳頂鐮刀菌(fusariumacuminatum)、尖鐮孢菌(fusariumoxysporum)、立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)、鏈鉻孢屬真菌等(alternariaspp.)等，鐮刀菌為最主要的致病菌屬。

目前，化學(xué)防治作為黃芪根腐病最主要的防治方法，雖然見效快、作用強，但化學(xué)農(nóng)藥高毒性、高殘留、高污染的特點，極易導(dǎo)致病菌抗藥性增加、生態(tài)系統(tǒng)破壞。同時，還可導(dǎo)致有效成分含量的降低，嚴(yán)重影響臨床用藥安全和國際市場競爭力。為了避免中藥材病害防治中的農(nóng)藥污染，保證綠色生產(chǎn)，國家制定了一系列的無公害生產(chǎn)條例，并在《中藥材gap栽培技術(shù)》中明確規(guī)定了禁止使用的劇毒農(nóng)藥和部分高毒農(nóng)藥。

與化學(xué)農(nóng)藥相比，生物防治因具有對非靶標(biāo)生物安全，毒副作用小，環(huán)境兼容性好，生產(chǎn)原料來源廣泛等優(yōu)點而越來越受到重視。因此，黃芪根腐病的防控應(yīng)首先立足于生物防治，特別是生物農(nóng)藥的推廣和使用，而獲得高效拮抗菌是生物農(nóng)藥開發(fā)的基礎(chǔ)。芽孢桿菌作為土壤和植物微生態(tài)區(qū)系的優(yōu)勢生物種群，具有很強的抗菌防病及抗逆能力，特別是由于其在定殖力、繁殖力、穩(wěn)定性、以及與化學(xué)農(nóng)藥的相容性等方面，明顯優(yōu)于非芽孢桿菌和真菌，因而在土傳病害的生物防治中更是顯示出了極高的應(yīng)用價值。

目前，國內(nèi)外利用芽孢桿菌防治大田作物根部病害的報道有很多，且不少制劑已商業(yè)化。已報道的生防芽孢桿菌有：枯草芽孢桿菌(b.subtilis)、多粘芽孢桿菌(b.polymyxa)、蠟狀芽孢桿菌(b.cereus)、蠟狀芽孢桿菌蕈狀菌變種(b.cereusvar.mycoides)、巨大芽孢桿菌(b.megaterium)和短小芽孢桿菌(b.pumilus)等。已投放市場并用于大田作物和蔬菜土傳病害防治的芽孢桿菌制劑主要包括：美國的枯草芽孢桿菌制劑gb03、mbi600、qst713和解淀粉枯草芽孢桿菌變種(b.subtilisvar.amyloliquefaciensfzb24)制劑等；國內(nèi)的枯草芽孢桿菌制劑則有“百抗”、“麥豐寧”、“紋曲寧”等，但針對中藥材土傳病害僅有一種芽孢桿菌制劑(登記證號ls2001821)可用于三七根腐病防治。

因此，根據(jù)黃芪產(chǎn)業(yè)發(fā)展和根腐病防治的實際需要，篩選獲得對黃芪根腐病具顯著抑制作用，且兼具促生功能的芽孢桿菌，對開發(fā)黃芪根腐病專用芽孢桿菌生防制劑，實現(xiàn)中藥材土傳病害的生物防治，具有十分重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是針對黃芪根腐病的兩種優(yōu)勢致病鐮刀菌(fusariumsolani和fusariumacuminatum)，提供一株抑菌效果良好，且兼具促進(jìn)植物生長能力的多功能芽孢桿菌菌株。該菌株可用于黃芪根腐病生防制劑的開發(fā)，緩解黃芪根腐病的發(fā)生蔓延和化學(xué)農(nóng)藥施用帶來的不良影響。

本發(fā)明目的之二是提供多功能拮抗促生芽孢桿菌菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，用于黃芪根腐病生防制劑的制備和生產(chǎn)。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明所提供的多功能拮抗促生細(xì)菌為菌株sxkf16-1，該菌株經(jīng)鑒定，其分類命名為萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)，其微生物保藏號是：cgmccno.14083；保藏時間：2017年4月27號；保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc)。

本發(fā)明所述的萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)sxkf16-1對黃芪根腐病的優(yōu)勢病原菌(fusariumsolani、fusariumacuminatum)具有很強的拮抗作用，其無菌發(fā)酵液在離體防病試驗中，在不同的處理組下(保護(hù)性、治療性和拮抗性)，均具有顯著的防病效果。

本發(fā)明所述的萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)sxkf16-1主要通過其發(fā)酵液中的抗菌物質(zhì)顯著抑制fusariumsolani與fusariumacuminatum的菌絲生長和孢子萌發(fā)，從而起到抑菌防病作用。

本發(fā)明所述的萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)sxkf16-1具有多種促生性能，分別為：溶磷、解淀粉酶活性、產(chǎn)iaa能力。

本發(fā)明提供的萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)sxkf16-1的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖15.0～25.0g/l、牛肉膏15.0～20.0g/l、花生餅粉15.0～30.0g/l，caco32.0～2.2g/l、nacl0.7～0.8％。發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比為：葡萄糖21.16g/l、牛肉膏17.31g/l、花生餅粉20.64g/l，caco32.0g/l，nacl0.7％。

本發(fā)明所述的多功能拮抗菌——萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)sxkf16-1有以下幾個優(yōu)點：

本說明所述的多功能拮抗菌sxkf16-1分離自山西黃芪主產(chǎn)區(qū)(渾源)健康黃芪植株根際土壤，并非源自其他生境，根際定殖效果較好，安全可靠，對黃芪無致病侵染能力。

本發(fā)明所述的多功能拮抗菌sxkf16-1是通過活體拮抗、發(fā)酵液抑菌、離體防病試驗等大量篩選工作獲得的，對黃芪根腐病的2種優(yōu)勢病原菌(fusariumsolani和fusariumacuminatum)均具有顯著的抑制作用，且在離體防病試驗中，對黃芪根腐病顯示出了保護(hù)、治療和拮抗等多種防病效果。

本說明所述的多功能拮抗菌sxkf16-1兼具溶磷、產(chǎn)解淀粉酶和iaa促生性能。

本說明所述的多功能拮抗菌sxkf16-1的發(fā)酵液對高溫、紫外線和強酸/強堿等不良環(huán)境具有很高的耐受性，能夠滿足在黃芪適生地土壤和氣候條件下保持良好防病效果的要求。

附圖說明

圖1為萎縮芽孢桿菌sxkf16-1無菌發(fā)酵液的抑菌效果圖，圖中：左圖靶標(biāo)菌為fusariumsolani；右圖靶標(biāo)菌為fusariumacuminatum。

圖2為萎縮芽孢桿菌sxkf16-1無菌發(fā)酵濾液對菌絲生長的抑制作用，圖中：左圖靶標(biāo)菌為fusariumsolani；右圖靶標(biāo)菌為fusariumacuminatum；不同小寫英文字母表示5％水平差異顯著性。

圖3為萎縮芽孢桿菌sxkf16-1的促生長性能測定結(jié)果

圖4為萎縮芽孢桿菌sxkf16-1菌落形態(tài)圖

圖5為萎縮芽孢桿菌sxkf16-1革蘭氏染色圖

圖6為萎縮芽孢桿菌sxkf16-1芽孢染色圖

圖7為萎縮芽孢桿菌sxkf16-1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖8為萎縮芽孢桿菌sxkf16-1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后抑菌效果

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明技術(shù)方案的限制。

實施例1：芽孢桿菌的來源和分離

在2014年7月，從山西(渾源)黃芪主產(chǎn)區(qū)，采集健康黃芪植株根際土壤用于芽孢桿菌的分離。分離方法：取10g黃芪根際土壤，60℃預(yù)處理10min后，溶于90ml無菌水中，充分震蕩搖勻，梯度稀釋得10^-3稀釋液，吸取100μl均勻涂布于pda平板，37℃恒溫培養(yǎng)48h后，挑選清晰可辨且生長均勻的單菌落，轉(zhuǎn)接至pda斜面，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h后，4℃保存?zhèn)溆?。獲得的菌株經(jīng)多次劃線法純化后，得最終純化的菌株用于后續(xù)拮抗菌篩選。

實施例2：多功能拮抗促生萎縮芽孢桿菌sxkf16-1的抑菌防病效果

對峙—異步培養(yǎng)法測定活體抑菌效果。菌株sxkf16-1的培養(yǎng)：保存于4℃的菌株轉(zhuǎn)接至pda斜面上，28℃活化48h；靶標(biāo)菌培養(yǎng)：靶標(biāo)病原菌接入pda平板，25℃培養(yǎng)5d后，打取直徑5mm菌塊?；铙w抑菌：挑取活化后的sxkf16-1菌株在pda平板中央劃長約9cm的細(xì)線，28℃溫箱培養(yǎng)24h后，于距劃線兩側(cè)2cm處對稱接種病原菌菌塊，25℃繼續(xù)培養(yǎng)72h后測量抑菌帶寬度及病原菌菌落的長短半徑，并計算抑菌率。結(jié)果表明：以fusariumsolani和fusariumacuminatum為靶標(biāo)時，72h時抑菌帶寬度和抑菌率分別為6.83±0.68mm、46.51±2.91％和4.83±1.25mm、39.08±6.97％。

牛津杯法測定發(fā)酵液的抑菌活性。菌株sxkf16-1無菌發(fā)酵液的制備：菌株活化后，用無菌水制備種子液，血球計數(shù)板計數(shù)并使其終濃度為1.5×10⁷-2.0×10⁸cfu/ml。種子液按體積比4％(v/v)接種至(50ml/250ml三角瓶)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基：馬鈴薯20％，葡萄糖1.5％，kh2po40.1％、nacl0.2％；自然ph)，28-30℃，180r/min搖床振蕩培養(yǎng)48h，8000r/min離心20min，取上清液，用細(xì)菌過濾器(φ＝0.22μm)過濾，得無菌發(fā)酵濾液，置4℃冰箱備用。靶標(biāo)菌菌塊及孢子懸液的制備：如上所述制備菌塊。將5個菌塊接入pd培養(yǎng)液(50ml/250ml三角瓶)，搖床振蕩培養(yǎng)(25℃、180r/min)72h，無菌紗布過濾去除菌絲，孢子稀釋至20-30個/視野(10×15倍)。抑菌活性測定：將靶標(biāo)菌孢子懸液(f.acuminatum與f.solani與pda培養(yǎng)基的比例分別為400μl/300ml和240μl/300ml)加入到熔融狀態(tài)的培養(yǎng)基中，制備混菌平板(20ml/皿，9cm平皿)，待平板凝固后，放入3個無菌牛津杯，各加入200μl無菌發(fā)酵液，25℃培養(yǎng)72h，十字交叉法測量抑菌圈直徑。試驗設(shè)3次重復(fù)。結(jié)果表明：以fusariumsolani和fusariumacuminatum為靶標(biāo)時，無菌發(fā)酵液的抑菌圈直徑分別為：21.08±1.56mm和19.92±1.88mm(圖1)。

離體水培法測定防病效果。黃芪預(yù)處理：將生長5個月的黃芪幼苗清水洗凈根部泥土，75％酒精涮根2-3次后，再用無菌水沖洗3-4次，待根部不再滴水時用無菌針輕刺根部表皮，每株5點。病原菌孢子懸液制備：如上所述培養(yǎng)靶標(biāo)病原菌，并制備孢子懸液，使其終濃度為1.5×10⁶-2.5×10⁷cfu/ml。離體防病試驗：選取長勢一致的健康黃芪分成6組，分別作如下處理：a、黃芪直接浸入已裝有含2.5％pd培養(yǎng)液的無菌水中；b、將黃芪在病菌孢子懸浮液中浸泡30min，取出晾至無水滴滴下，再浸入無菌水中，6h后重復(fù)1次；c、將黃芪直接浸入已裝有含2.5％拮抗菌發(fā)酵液的無菌水中；d、先將黃芪在含2.5％拮抗菌發(fā)酵液的無菌水中培養(yǎng)3d后，再同b進(jìn)行病原菌接種；e、先同b進(jìn)行病原菌接種后，再放入含2.5％拮抗菌發(fā)酵液的無菌水中培養(yǎng)3d；f、將黃芪浸入同時含有拮抗菌發(fā)酵液和病原菌孢子懸液的無菌水中，濃度同上述處理。以上試驗溶液總體積均為60ml，處理后試管保鮮膜封口，于人工氣候箱培養(yǎng)。分別在7d和15d記錄各處理的發(fā)病情況，并計算病情指數(shù)。結(jié)果見表1。

表1菌株sxkf16-1無菌發(fā)酵液對黃芪根腐病的離體防病效果

注：不同小寫英文字母表示5％水平差異顯著性。

實施例3：多功能拮抗促生萎縮芽孢桿菌sxkf16-1的抑菌特性

無菌發(fā)酵液對靶標(biāo)菌菌絲生長的抑制作用：無菌發(fā)酵濾液制備和靶標(biāo)菌孢子懸液制備均同前所述。含藥平板法測定拮抗菌株發(fā)酵液對菌絲生長的抑制效果：將無菌發(fā)酵液按比例均勻加入熔融態(tài)的pda培養(yǎng)基中，使其稀釋10、20、40、80和160倍，并制備平板(20ml/皿)，然后將靶標(biāo)菌菌塊接入平板中央，培養(yǎng)72、120和168h時測量菌落直徑并計算抑制率。抑制率＝(對照菌落凈生長直徑-處理菌落凈生長直徑))/對照菌落凈生長直徑×100％。結(jié)果見圖2。

無菌發(fā)酵液對靶標(biāo)菌孢子萌發(fā)的抑制作用：同前所述制備孢子懸液及拮抗菌無菌發(fā)酵濾液。用無菌水將無菌濾液稀釋至20、40、80倍，然后將無菌濾液和孢子懸液在平皿中等量混合(2ml+2ml)；混勻后，置25-28℃下培養(yǎng)，24h后鏡檢觀察孢子萌發(fā)和畸變情況，并計算孢子萌發(fā)率和致畸率。萌發(fā)率/％＝(萌發(fā)的孢子數(shù)/總孢子數(shù))×100％；孢子萌發(fā)抑制率/％＝[(對照萌發(fā)率-處理萌發(fā)率)/對照萌發(fā)率]×100％。(注：畸形但萌發(fā)的孢子計入萌發(fā)數(shù))；致畸率/％＝(畸形孢子數(shù)/總孢子數(shù))×100％。結(jié)果見表2。

表2菌株sxkf16-1對黃芪根腐病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

實施例4：多功能拮抗促生萎縮芽孢桿菌sxkf16-1的促生性能

溶磷性能測試：菌株點接于pikovaskaia's培養(yǎng)基中，每皿接種4點，每個菌株3皿，30℃培養(yǎng)120h，觀察接種菌株周圍有無溶磷圈形成；淀粉酶活性測定：菌株接種于含有0.2％可溶性淀粉的nb牛肉膏蛋白胨固體平板上，30℃靜置培養(yǎng)72h，形成明顯菌落后，在平板上滴加碘液，觀察菌落周圍變色情況并測量酶解圈大??；分泌iaa能力的測定：菌株接種于含有l(wèi)-色氨酸(100mg/l)的lb液體培養(yǎng)基中，30℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h后，取50μl菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入等體積salkowski比色液(50ml35％hclo4+1ml0.5mol/lfecl3)，將白色陶瓷板于室溫避光放置30min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌iaa。以加入50μl未接菌的lb液體培養(yǎng)基與等體積比色液的混合溶液為對照。結(jié)果見圖3。

實施例5：多功能拮抗促生萎縮芽孢桿菌sxkf16-1的鑒定

菌株形態(tài)、生理生化特征鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，觀察并測定拮抗菌的生長情況、菌落形態(tài)與顏色、革蘭氏染色和芽孢染色等形態(tài)與生理生化特征。結(jié)果表明：本發(fā)明所述菌株sxkf16-1的主要生物學(xué)特征為：在pda平板表面生長的菌落為圓形，淡黃色，表面中間褶皺，邊緣規(guī)則，有光澤，不透明(圖4)；菌體桿狀，大小為(0.6-0.9)μm×(3.5-4.5)μm，革蘭氏染色陰性(圖5)，芽孢染色陽性(圖6)，芽孢一般在菌體中間。生理生化特性具體見表3。根據(jù)文獻(xiàn)資料，可初步確定該菌株為萎縮芽孢桿菌(bacillusatrophaeus)。

表3菌株sxkf16-1的生理生化特性

16srdna分子鑒定：pcr擴(kuò)增16srdna，采用通用引物27f和1495r擴(kuò)增，序列如下：27f：5′-agagtttgatcctggctcag-3′；1495r：5′-ctacggctaccttgttacga-3′。pcr反應(yīng)體系25μl：10×pcrbuffer2.5μl，引物(25pmol/l)各1μl，dntpmixture2.5μl，taqdnapolymerase(5u/μl)0.5μl，ddh2o15.5μl，dna模板2μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，95℃變性lmin，55℃退火40s，72℃延伸2min，共30個循環(huán)；然后72℃保持7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海sangon生物股份有限公司測序。將測序結(jié)果(見序列表sqdidno：1)提交到genbank中進(jìn)行同源性比較，并選取與其同源性高的菌株序列，用mega5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用bootstrap進(jìn)行自舉檢驗，1000次重復(fù)。結(jié)果表明：菌株sxkf16-1與萎縮芽孢桿菌形成一個族群(圖7)，同源性達(dá)99％。

實施例6：多功能拮抗促生萎縮芽孢桿菌sxkf16-1發(fā)酵液對不良環(huán)境的耐受性

熱穩(wěn)定性：取菌株sxkf16-1的無菌發(fā)酵濾液，分裝于4支無菌小管(3ml/管)，分別在30、50、70、90、100℃下加熱處理30min后，迅速冷卻至室溫，然后測定其抑菌活性。結(jié)果表明：以fusariumsolani和fusariumacuminatum為靶標(biāo)時，發(fā)酵液在100℃下處理30min后，與對照相比，抑菌活性保持率分別達(dá)80.58％、77.34％(表4)。

表4不同溫度下處理30min對發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響

酸堿穩(wěn)定性：取菌株sxkf16-1的無菌發(fā)酵濾液，分裝于6支無菌小管(3ml/管)，分別用1mol/lhcl和1mol/l的naoh調(diào)節(jié)，使最終ph為4、5、6、7、8、9，然后測定發(fā)酵液抑菌活性。結(jié)果表明：以fusariumsolani和fusariumacuminatum為靶標(biāo)時，在ph為4.0和9.0時，抑菌活性保持率分別為74.22、82.70％和72.12、75.25％(表5)。

表5不同ph處理對發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響

光穩(wěn)定性：將20ml無菌濾液加入到無菌平皿中(直徑9mm)，在20w紫外燈(距光源40cm)下照射1、2、4、8h，然后補加無菌蒸餾水到原體積量，測定發(fā)酵液抑菌活性。結(jié)果表明：以fusariumsolani和fusariumacuminatum為靶標(biāo)時，紫外照射8h后，抑菌活性保持率分別達(dá)82.70％、77.34％(表6)。

表6紫外照射不同時間對發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性的影響

以上試驗均以f.acuminatum和f.solani作為指示菌，如前所述用牛津杯法測定發(fā)酵液抑菌活性，以發(fā)酵液原液為對照。每個處理重復(fù)3次。

實施例7：多功能拮抗促生萎縮芽孢桿菌sxkf16-1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇：根據(jù)萎縮芽孢桿菌sxkf16-1的特點選出6種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，比較發(fā)酵液的抑菌活性后，選擇配方蛋白胨14.29g/l、淀粉14.07g/l、豆餅粉6.49g/l、caco32.0g/l、mgso41.0g/l為優(yōu)化前的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。后續(xù)抑菌測定均以f.solani為靶標(biāo)。

發(fā)酵培養(yǎng)基碳源優(yōu)化：將原始培養(yǎng)基中的淀粉分別等量用蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、玉米粉、糊精代替，配制成8種培養(yǎng)基，制備無菌發(fā)酵濾液，進(jìn)行抑菌能力測定，并以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，確定最佳碳源為葡萄糖。

發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)碳源濃度的優(yōu)化：在最優(yōu)碳源的基礎(chǔ)上，分別配置濃度為5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l的發(fā)酵培養(yǎng)基，制備無菌發(fā)酵濾液，抑菌能力測定結(jié)果表明，葡萄糖為碳源，濃度在15～25g/l，時，發(fā)酵液抑菌效果最好。

發(fā)酵培養(yǎng)基氮源優(yōu)化。氮源1選擇：將原始培養(yǎng)基中的氮源1(蛋白胨)分別用等量有機氮源(胰蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、尿素、硫酸銨)和無機氮源(kno3、氯化銨)代替，配制成8種培養(yǎng)基，制備無菌發(fā)酵濾液，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，抑菌能力測定結(jié)果表明，最佳氮源1為牛肉膏。氮源2選擇：將原始培養(yǎng)基中的氮源2(豆餅粉)分別用等量氮源(玉米粉、黃米面、高粱面、花生餅粉、麩皮)代替，配制成6種培養(yǎng)基，制備無菌發(fā)酵濾液，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，抑菌能力測定結(jié)果表明，最佳氮源2為花生餅粉。

發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)氮源濃度的優(yōu)化：在最優(yōu)氮源的基礎(chǔ)上，分別配置氮源1和氮源2的濃度為5g/l、10g/l、15g/l、20g/l、25g/l和30g/l的發(fā)酵培養(yǎng)基，制備無菌發(fā)酵液，抑菌能力測定表明，氮源1為牛肉膏且濃度15～20g/l、氮源2為花生餅粉且濃度15～30g/l時，發(fā)酵液抑菌效果最好。

發(fā)酵培養(yǎng)基無機鹽優(yōu)化：以碳源和氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，根據(jù)微生物對大量元素與微量元素的利用情況不同，將無機鹽1caco3用等量cacl2、mgso4、kh2po4和mnso4·h2o替換；將無機鹽2mgso4分別按0.7％的氯化鈉(nacl)和磷酸氫二鉀(k2hpo4)替換、按0.0005％的量用mnso4·h2o和硫酸亞鐵(feso4)替換，制備成含不同無機鹽的培養(yǎng)基。同碳氮源優(yōu)化的方法，最終確定最佳無機鹽1仍為caco3，無機鹽2為nacl。

發(fā)酵培養(yǎng)基最優(yōu)無機鹽濃度的優(yōu)化：在最優(yōu)無機鹽的基礎(chǔ)上，配置含1.6g/l、1.8g/l、2.0g/l、2.2g/l和2.4g/l無機鹽1caco3的發(fā)酵培養(yǎng)基；濃度分別為0.5％、0.6％、0.7％、0.8％和0.9％的無機鹽2nacl的發(fā)酵培養(yǎng)基，并制備無菌發(fā)酵液；抑菌能力測定表明，無機鹽1caco3濃度為2.0～2.2g/l、無機鹽2nacl濃度0.7～0.8％時，發(fā)酵液抑菌效果最好?？紤]到經(jīng)濟(jì)成本的因素，選擇caco3的最優(yōu)濃度為2.0g/l，nacl的最優(yōu)濃度為0.7％。

由上述試驗得出，多功能拮抗促生萎縮芽孢桿菌sxkf16-1發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖15.0～25.0g/l、牛肉膏15.0～20.0g/l、花生餅粉15.0～30.0g/l，caco32.0～2.2g/l、nacl0.7～0.8％。

發(fā)酵培養(yǎng)基中碳氮源濃度的正交優(yōu)化：在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對拮抗芽孢桿菌sxkf16-1進(jìn)行l(wèi)93⁴的正交試驗，在濃度為20g/l的葡萄糖左右選取三個值，分別為17g/l，20g/l，23g/l；濃度為20g/l的牛肉膏左右選取三個值，分別為16g/l，19g/l，22g/l；濃度為20g/l的花生餅粉左右選取三個值，分別為16g/l，18g/l，20g/l。試驗結(jié)果分別進(jìn)行極差分析與方差分析，確定碳源和氮源1、氮源2對發(fā)酵液抑菌活性影響的大小及其各自的濃度范圍。極差分析表明：對抑菌活性影響最大的是牛肉膏，其次是花生餅粉，最后是葡萄糖，最優(yōu)組合為葡萄糖20g/l，牛肉膏16g/l，花生餅粉20g/l。方差分析與極差分析結(jié)果一致，因此最終確定培養(yǎng)基中碳氮源組合為：葡萄糖20g/l，牛肉膏16g/l，花生餅粉20g/l。

響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基：在以上試驗基礎(chǔ)上，采用designexpert8.0.5box-behnken中心組合設(shè)計原理，選擇發(fā)酵培養(yǎng)基中對抑菌活性影響較大的3個因素a(輔助碳源)、b(輔助氮源)、c(輔助氮源)，進(jìn)行三因素三水平中心試驗。采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程優(yōu)化培養(yǎng)基成分，預(yù)測響應(yīng)值，并對影響實驗過程的因子及其交互作用進(jìn)行評價，確定最佳培養(yǎng)基配方。

響應(yīng)面法結(jié)果分析：對試驗結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到的二次多元回歸方程如下：

y＝26.75+0.94a+0.24b+0.39c+0.73ab+0.08ac+0.21bc-1.24a2-0.56b2-0.89c2

該回歸方程由designexpert8.0.5軟件得出，并計算得到最佳響應(yīng)變量y。發(fā)酵培養(yǎng)基中對f.solani的抑菌能力進(jìn)行方差分析，結(jié)果可以看出，p＜0.0001，表明二次多元回歸模型的效果極顯著，失擬項p＝0.1384>0.05即不顯著。相關(guān)系數(shù)r2＝99.96％，r2adj＝0.9992，說明模型與實驗擬合度較好，實驗失擬小，因此可以用此模型來進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基中抑菌能力分析和預(yù)測。三個因素的交互作用對f.solani的抑菌效果影響顯著，隨著數(shù)值的變化響應(yīng)值也在變化，響應(yīng)面在中心有一個最大值(抑菌圈直徑最大)。對響應(yīng)面和回歸方程進(jìn)行分析后，得到抑菌效果最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基，即在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加21.16g/l葡萄糖、17.31g/l牛肉膏、20.64g/l花生餅粉時，菌株sxkf16-1的發(fā)酵液抑菌效果最好。

發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后效價比較：對優(yōu)化前后的培養(yǎng)基進(jìn)行抑菌效果對比，結(jié)果顯示，原始培養(yǎng)基發(fā)酵液的抑菌圈直徑為(20.86±0.76)mm，而優(yōu)化后可達(dá)(26.67±2.10mm)mm，抑菌活性提高了21.8％，且抑菌圈邊緣清晰，抑菌效果徹底(圖8)，表明優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基更利于sxkf16-1菌株發(fā)揮抑菌效果。試驗設(shè)3次重復(fù)。

因此，菌株sxkf16-1的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖21.16g/l、牛肉膏17.31g/l、花生餅粉20.64g/l，caco32.0g/l、nacl0.7％，此配方可作為生防制劑生產(chǎn)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

sequencelisting

<110>山西大學(xué)

<120>一種抗黃芪根腐病的芽孢桿菌菌株及其發(fā)酵培養(yǎng)基

<130>.

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1455

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<213>bacillusatrophaeus

<400>1

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