本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可特異結(jié)合ck7蛋白的單克隆抗體umab161、產(chǎn)生所述單克隆抗體的細(xì)胞株及應(yīng)用該抗體用于診斷的方法和用途。

背景技術(shù)：

cks(細(xì)胞角蛋白)主要分布于上皮細(xì)胞，是上皮組織分化的基本標(biāo)記物。它是角質(zhì)細(xì)胞中的主要骨架蛋白，主要功能是維持上皮組織的完整性及連續(xù)性。cks家族至少包含20種不同分子，包括酸性角蛋白(i型角蛋白，角蛋白9-23)和堿性角蛋白(ii型角蛋白，角蛋白1至8)，其表達(dá)取決于細(xì)胞類型和分化位置，是一種常用的腫瘤免疫組織化學(xué)標(biāo)記物，在許多上皮腫瘤細(xì)胞的鑒別診斷中扮演重要角色。研究表明，角蛋白基因突變與皮膚病、肝臟和胰腺疾病以及炎性腸道疾病有關(guān)。

ck7又名krt7或scl，是cks家族中的一員，屬于ii型角蛋白。ck7主要表達(dá)在簡單上皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、尿路上皮細(xì)胞和假復(fù)層上皮細(xì)胞，在胃窩、腸和分層鱗狀上皮細(xì)胞中的表達(dá)低或不可檢測。因大多數(shù)上皮癌細(xì)胞均表達(dá)ck7，所以其與ck20的協(xié)調(diào)表達(dá)通常用作各種上皮細(xì)胞癌癥的診斷標(biāo)記。目前臨床上常用免疫組織化學(xué)(ihc)病理實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞中蛋白的表達(dá)狀況，然而ihc實(shí)驗(yàn)的核心為特異性結(jié)合蛋白的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個(gè)檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結(jié)合特異性較高的針對(duì)ck7蛋白的單克隆抗體對(duì)ihc檢測ck7表達(dá)水平具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)合特異性較高的ck7蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測ck7蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱為cgmcc)，保藏日期為2017年4月6日，保藏編號(hào)為cgmccno.13820。

本發(fā)明還提供了一種特異性結(jié)合ck7蛋白的單克隆抗體umab161，由上述雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。

本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下：

(1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)ck7orf核苷酸序列(ck7orf核苷酸序列如seqidno.1所示，1410bp；ck7氨基酸序列如seqidno.2所示)

設(shè)計(jì)引物pcr擴(kuò)增ck7orf第1bp位到第345bp位序列和第1023bp位到第1410bp位序列，基因兩側(cè)分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)sgfi和mlui，插入表達(dá)載體pet23a-n-his，構(gòu)建ck7重組表達(dá)質(zhì)粒pet23a-his-rck7

(2)ck7重組蛋白的表達(dá)與純化：將ck7重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化ecoli，裂解離心獲得可溶性蛋白，鎳親和層析柱純化，獲得純化的ck7重組蛋白；

(3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的ck7重組蛋白免疫balb/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，有限稀釋法獲得單克隆，elisa法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，獲得能分泌抗ck7特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為umab161，亞型鑒定為igg1；通過無血清培養(yǎng)基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得ck7單克隆抗體umab161。分別通過westernblot、免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

本發(fā)明還提供了單克隆抗體umab161在制備用于檢測ck7蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體umab161，可檢測組織細(xì)胞中ck7的表達(dá)狀況。

本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備用于標(biāo)記腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。其中所述腫瘤具體是指腫瘤細(xì)胞的增殖與ck7的表達(dá)密切相關(guān)的腫瘤，包括但不限于腎癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等相關(guān)腫瘤組織。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細(xì)胞株(保藏編號(hào)為cgmccno.13820)，以及由此雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體umab161。本發(fā)明還提供了單克隆抗體umab161在制備用于檢測ck7蛋白的免疫檢測工具中的應(yīng)用，含單克隆抗體umab161的免疫組化試劑盒，以及單克隆抗體umab161在制備用于標(biāo)記腫瘤的試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明所述單克隆抗體可與ck7蛋白特異性結(jié)合，而與細(xì)胞內(nèi)其他蛋白無交叉反應(yīng)，顯著提高了ck7蛋白免疫檢測的特異性、準(zhǔn)確性和可靠性，真實(shí)反映腫瘤浸潤細(xì)胞內(nèi)ck7蛋白表達(dá)水平，可應(yīng)用于腎癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等相關(guān)腫瘤免疫微環(huán)境的檢測。

保藏信息

用于保藏的雜交瘤細(xì)胞株umab161的分類命名為：鼠抗人細(xì)胞角蛋白7(ck7)單克隆雜交瘤細(xì)胞株；

保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；

保藏單位簡稱：cgmcc；

保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所；

保藏日期：2017年4月6日；

保藏編號(hào)：cgmccno.13820。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實(shí)施例1克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)如圖，其中底紋部分為orf區(qū)；

圖2示實(shí)施例2重組ck7蛋白westernblot檢測結(jié)果圖，以anti-his檢測重組ck7蛋白在ecoli裂解液中的表達(dá)，其中左側(cè)泳道為轉(zhuǎn)化空載體的ecoli裂解液為抗原的檢測結(jié)果、右側(cè)泳道為轉(zhuǎn)化pet23a-his-rck7質(zhì)粒的ecoli裂解液抗原的檢測結(jié)果；

圖3示實(shí)施例2重組ck7蛋白sds-page結(jié)果圖，用鎳親和層析柱純化重組ck7蛋白，純化后的蛋白通過sds-page膠電脈、考馬斯亮藍(lán)染色；

圖4示實(shí)施例3以單克隆抗體umab161識(shí)別293t細(xì)胞過表達(dá)的cks家族完整蛋白的westernblot檢測結(jié)果圖。從左到右依次為轉(zhuǎn)染krt5、krt6、krt7、krt8、krt17、krt18、krt19、krt20、krt12、krt15重組表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞裂解液。

圖5示實(shí)施例3以單克隆抗體umab161識(shí)別9種不同腫瘤細(xì)胞系中內(nèi)源ck7蛋白的westernblot檢測結(jié)果圖。從左到右細(xì)胞裂解液依次為1：hepag2，2：hela，3：sv-t2，4：a549，5：cos7，6：jurkat，7：mdck，8：pc12，9：mcf7。

圖6示實(shí)施例3以單克隆抗體umab161識(shí)別10種不同人組織裂解液中內(nèi)源ck7蛋白的westernblot檢測結(jié)果圖。從左到右人組織裂解液分別為1：睪丸，2：網(wǎng)膜，3：子宮，4：乳腺，5：腦，6：肝，7：卵巢，8：甲狀腺，9：結(jié)腸，10：脾。

圖7示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人結(jié)腸免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖8示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人腎臟免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖9示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人腎癌免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖10示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人肝臟免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖11示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人肺臟免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖12示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人肺癌免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖13示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人卵巢癌免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖14示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人胰腺免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖15示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人胰腺癌免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖16示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人甲狀腺免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖17示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人前列腺免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖18示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人前列腺癌免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖19示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人膀胱免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖20示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人膀胱癌免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖21示實(shí)施例4福爾馬林固定、石蠟包埋的人皮膚免疫組化結(jié)果圖(一抗為ck7單克隆抗體umab161)；

圖22示實(shí)施例5人宮頸癌細(xì)胞hela免疫熒光染色結(jié)果圖(左上角為鬼筆環(huán)肽phalloidin標(biāo)記的微絲，右上角一抗為ck7單克隆抗體umab161，左下角為dapi核染，右下角為重疊圖)；

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1、ck7重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以從美國傲銳東源生物科技有限公司獲得的質(zhì)粒rc201124(含ck7orf1410bp)為模板，設(shè)計(jì)引物并分別引入酶切位點(diǎn)sgfi和mlui，克隆入表達(dá)載體pet23a-n-his，建立ck7重組表達(dá)質(zhì)粒。克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)如圖1所示。

實(shí)施例2、ck7重組蛋白的表達(dá)與純化

1、轉(zhuǎn)化e.coli細(xì)胞：將100ul感受態(tài)細(xì)胞置于冰上融化后加入質(zhì)粒dna輕混勻，冰浴30min后42℃熱激90s，然后將其繼續(xù)冰浴1-2min。在超凈臺(tái)內(nèi)加入500ul新鮮無抗生素lb培養(yǎng)基，于37℃搖床孵育45min后取適量菌液均勻涂布于含抗生素的平板上，將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

2、裂解細(xì)胞：挑取單克隆于新鮮培養(yǎng)基中，37℃、200rpm培養(yǎng)至od值達(dá)到0.4～0.6時(shí)加入iptg(終濃度1mm)誘導(dǎo)培養(yǎng)7h。離心收集菌體，然后用裂解緩沖液重懸菌體，超聲破碎20min后于4℃下12000rpm離心20min，收集上清。取少量上清蛋白用anti-his抗體wb驗(yàn)證ck7蛋白的表達(dá)，見圖2。

3、鎳親和層析柱純化：用緩沖液平衡鎳柱，將上清用0.45μm濾膜過濾后上樣并收集流出，用緩沖液淋洗去除未結(jié)合的蛋白，最后用含不同濃度咪唑的洗脫液洗脫，分別收集后進(jìn)行sds-page鑒定，將符合要求的洗脫蛋白合并并加入10％甘油，純化后的重組ck7蛋白用sds-page鑒定，見圖3。

由圖2結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染pet23a-his-rck7質(zhì)粒的e.coli裂解液中wb檢測后在27kd處有明顯的特異條帶，分子量與預(yù)期分子量大小一致。表明細(xì)胞中重組ck7蛋白特異表達(dá)。

由圖3結(jié)果可見，純化的蛋白在sds-page膠27kd處有明顯的特異條帶，分子量與預(yù)期分子量大小一致。表明已獲得了純度較好的ck7重組蛋白。

實(shí)施例3、ck7單克隆抗體的制備與篩選

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法用重組產(chǎn)生的純化的ck7蛋白片段對(duì)balb/c小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)進(jìn)行免疫。具體方法如下：

1、動(dòng)物免疫：經(jīng)過純化的ck7抗原以完全弗氏佐劑乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周齡balb/c小鼠，免疫劑量為30μg/只，間隔兩周后進(jìn)行第二次免疫，以不完全弗氏佐劑乳化，免疫劑量為30μg/只。免疫兩次后取尾血以elisa法梯度稀釋測定血清效價(jià)；根據(jù)結(jié)果確定是否加強(qiáng)免疫，選取抗體效價(jià)最高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

2、細(xì)胞融合：骨髓瘤細(xì)胞采用balb/c來源的sp2/0，融合時(shí)處于對(duì)數(shù)生長期；取已免疫小鼠脾臟，制成淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸液；小鼠脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞以1:5-1:10混合，滴加37℃的50％peg(ph8.0)1ml，加入不完全培養(yǎng)基及其余終止液，離心棄上清后加入hat培養(yǎng)基懸浮混勻，mc定容到50ml，分裝到3.5cm培養(yǎng)皿中，放于濕盒中，置于37℃、5％co2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

3、篩選和克?。喝诤?-10天內(nèi)挑選細(xì)胞克隆，使用ck7純化重組蛋白進(jìn)行elisa測試。標(biāo)記細(xì)胞株號(hào)。對(duì)陽性孔細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋，每次有限稀釋后5-6天測定elisa值，挑取od280陽性值較高的單克隆孔進(jìn)行有限稀釋，直至elisa測定96孔板全板結(jié)果為陽性。挑取陽性值高的單克隆定株。其對(duì)應(yīng)融合板細(xì)胞株為umab161。

4、腹水單抗的制備與純化：10-12周齡的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml降植烷，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射經(jīng)pbs洗滌重懸的單克隆細(xì)胞懸液，細(xì)胞用量為5×10⁶/只，每株抗體打2只小鼠。待小鼠腹水積聚后收集腹水，離心取上清，親和層析法進(jìn)行腹水純化，根據(jù)抗體亞型選擇相應(yīng)柱料，細(xì)胞株umab161產(chǎn)生的單抗為igg1，采用proteing進(jìn)行純化。純化后的單抗?jié)舛葴y定、wb檢測、分裝、凍存在-20℃。其中wb檢測結(jié)果見圖4——圖6。

由圖4結(jié)果可見，umab161能夠很好的識(shí)別ck7全長蛋白，弱交叉識(shí)別krt12、krt15及krt19全長蛋白；由圖5結(jié)果可見，umab161特異識(shí)別hela及a549細(xì)胞中的內(nèi)源ck7蛋白；由圖6結(jié)果可見，umab161特異識(shí)別網(wǎng)膜組織中的內(nèi)源ck7蛋白，分子量與預(yù)期分子量大小一致，表明單克隆抗體umab161能特異地westernblot檢測完整的ck7蛋白。

實(shí)施例4、單克隆抗體umab161為一抗的免疫組化檢測

(1)、實(shí)驗(yàn)方法：

1、取福爾馬林固定的人腎癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等組織進(jìn)行石蠟包埋，使用finesse組織切片機(jī)進(jìn)行切片，組織厚度為6μm。

2、脫蠟與水化：分析純二甲苯3×10min，無水乙醇3×10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min，去離子水浸泡3min×3次。

3、加入抗原修復(fù)液(0.01m，ph6.0枸櫞酸鈉緩沖液)高壓鍋高壓熱修復(fù)3min，待高壓鍋溫度降至約90℃時(shí)，打開高壓鍋，取出標(biāo)本，然后自然冷卻至室溫。去離子水浸泡3min×3次。

4、使用3％過氧化氫滅活組織內(nèi)源性過氧化物酶，室溫靜置10min。去離子水浸泡5min×3次。

5、加上封閉液(pbs+5％脫脂奶粉+5％正常山羊血清)，37℃孵育60min。

6、去除封閉液，勿沖洗，加入ck7單抗(umab161)，稀釋比：1:200，使用封閉液進(jìn)行稀釋。置于濕盒中，37℃孵育60min。pbst(0.1％tween-20)洗滌2次，每次洗滌5min。pbst(0.02％tween-20)洗滌1次，每次洗滌5min。

7、滴加polink-試劑盒2(catlogno.d37-15)試劑1，37℃孵育10-20分鐘。使用pbs洗滌3次，每次5min。滴加polink-2試劑盒(catlogno.d37-15)試劑2，37℃孵育10-20分鐘，使用pbs洗滌3次，每次5min。

8、應(yīng)用dab溶液(中杉金橋zli-9019)顯色，顯色3～10min。蒸餾水洗滌。

9、蘇木精復(fù)染細(xì)胞核2min，蒸餾水漂洗，1％鹽酸分化。蒸餾水漂洗3次，室溫靜置1min。

10、脫水和透明：75％乙醇5min，100％乙醇5minx3次，85％乙醇5min，95％乙醇5min，100％乙醇3×5min；二甲苯3×5min，中性樹膠封片。

11、鏡檢，見圖7——圖21。

(2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

由圖7——圖21結(jié)果可見，人腎癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌及膀胱癌等組織中可見到特異性細(xì)胞質(zhì)染色。結(jié)果與ck7在細(xì)胞內(nèi)的定位及組織表達(dá)特異性一致，表明單克隆抗體umab161可用于免疫組織化學(xué)檢測ck7蛋白的水平。

實(shí)施例5、單克隆抗體umab161為一抗的免疫熒光檢測

1)、實(shí)驗(yàn)方法：

1、細(xì)胞鋪版：取體外培養(yǎng)的人宮頸癌細(xì)胞hela平鋪到24孔板中，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。

2、去除培養(yǎng)基，用預(yù)熱的pbs洗滌一次，制作細(xì)胞單層培養(yǎng)物。

3、固定：4％的多聚甲醛(pbs配制)室溫固定10分鐘。

4、去除固定液，pbs洗滌3次。若不立刻使用，浸泡在nan3/pbs中保存于4℃。

5、穿透：室溫下用0.1％triton-x-100(pbs配制)穿透打孔5分鐘，pbs洗滌3次。

6、加上封閉液(pbs+2％bsa)，37℃孵育60分鐘。

7、加入ck7單抗(umab161)，稀釋比：1:50，使用封閉液進(jìn)行稀釋，37℃孵育60分鐘。pbs洗滌3次。

8、加入alexaaffinipuregoatanti-mouseigg(h+l)(jacksonimmunoresearch115-545-003)，稀釋比：1:500，使用封閉液進(jìn)行稀釋，室溫避光孵育60分鐘。pbs洗滌3次。

9、加入alexa594-phalloidin(鬼筆環(huán)肽)標(biāo)記微絲。

10、dapi(hh3342)復(fù)染細(xì)胞核3分鐘，鏡檢。

(2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

結(jié)果如圖8所示，在hela細(xì)胞中可見到特異性胞質(zhì)染色，表明單克隆抗體umab161可用于免疫熒光檢測ck7蛋白的水平。

sequencelisting

<110>無錫傲銳東源生物科技有限公司

<120>抗ck7蛋白單克隆抗體及其用途

<210>1

<211>1410

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atgtccatccacttcagctccccggtattcacctcgcgctcagccgccttctcgggccgcggcgcccaggtgcgcctgagctccgctcgccccggcggccttggcagcagcagcctctacggcctcggcgcctcgcggccgcgcgtggccgtgcgctctgcctatgggggcccggtgggcgccggcatccgcgaggtcaccattaaccagagcctgctggccccgctgcggctggacgccgacccctccctccagcgggtgcgccaggaggagagcgagcagatcaagaccctcaacaacaagtttgcctccttcatcgacaaggtgcggtttctggagcagcagaacaagctgctggagaccaagtggacgctgctgcaggagcagaagtcggccaagagcagccgcctcccagacatctttgaggcccagattgctggccttcggggtcagcttgaggcactgcaggtggatgggggccgcctggaggcggagctgcggagcatgcaggatgtggtggaggacttcaagaataagtacgaagatgaaattaaccgccgcacagctgctgagaatgagtttgtggtgctgaagaaggatgtggatgctgcctacatgagcaaggtggagctggaggccaaggtggatgccctgaatgatgagatcaacttcctcaggaccctcaatgagacggagttgacagagctgcagtcccagatctccgacacatctgtggtgctgtccatggacaacagtcgctccctggacctggacggcatcatcgctgaggtcaaggcacagtatgaggagatggccaaatgcagccgggctgaggctgaagcctggtaccagaccaagtttgagaccctccaggcccaggctgggaagcatggggacgacctccggaatacccggaatgagatttcagagatgaaccgggccatccagaggctgcaggctgagatcgacaacatcaagaaccagcgtgccaagttggaggccgccattgccgaggctgaggagcgtggggagctggcgctcaaggatgctcgtgccaagcaggaggagctggaagccgccctgcagcgggccaagcaggatatggcacggcagctgcgtgagtaccaggaactcatgagcgtgaagctggccctggacatcgagatcgccacctaccgcaagctgctggagggcgaggagagccggttggctggagatggagtgggagccgtgaatatctctgtgatgaattccactggtggcagtagcagtggcggtggcattgggctgaccctcgggggaaccatgggcagcaatgccctgagcttctccagcagtgcgggtcctgggctcctgaaggcttattccatccggaccgcatccgccagtcgcaggagtgcccgcgactga

//

<210>2

<211>469

<212>prt

<213>人工序列

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