技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種用于對不同樟樹進(jìn)行基因分型的snp引物及檢測方法。
背景技術(shù)：
：樟樹，別名香樟、芳樟、小葉樟等，隸屬于樟科(lauraceae)樟屬(cinnamomum)，在我國具有重要的經(jīng)濟(jì)價值，且廣泛分布于我國亞熱帶地區(qū)，如海南、江西、湖南、浙江、重慶、等省市區(qū)。樟樹具有樹姿雄偉、四季濃綠、滅菌驅(qū)蟲和揮發(fā)香氣等特點，發(fā)揮著重要的材用、藥用、香料、油用和生態(tài)環(huán)境建設(shè)等價值。樟樹因其可以提取天然樟腦和芳香油，而這兩者分別是重要的工業(yè)和醫(yī)藥原料，因此針對樟樹的研究也頗受關(guān)注。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms，snp)主要是指由于單個核苷酸的變異而引起基因組水平上的dna序列多態(tài)性，形式包括單堿基的缺失、插入、轉(zhuǎn)換及顛換等。snp是一種最常見的遺傳變異，具有遺傳穩(wěn)定性高、位點豐富且分布廣泛、富有代表性、檢測快速、易于實現(xiàn)自動化分析等特點。另外，由于snp自身具有密度高、分布廣等特點，又加上先進(jìn)的高通量snp檢測系統(tǒng)的研制，snp標(biāo)記將對未來生命科學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生重大的影響。hrm(high-resolutionmelting)分析技術(shù)是應(yīng)用于snp檢測分析的一項新技術(shù)，是由猶他大學(xué)和idaho科技公司合作開發(fā)的，該技術(shù)主要利用不同雙鏈dna分子的片段長短、gc含量和分布不同，在加熱變性時形成隨溫度變化的特定熔解曲線，進(jìn)而利用飽和熒光染料和高精密度采集熒光信號儀器進(jìn)行檢測。基于hrm技術(shù)的原理，hrm檢測不需要使用針對目標(biāo)位點的特異性等位引物或探針，只需一對引物就可以對等位基因的變化進(jìn)行識別。其靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡單快速、高效、經(jīng)濟(jì)，還具有高通量、閉管操作等優(yōu)點，非常經(jīng)濟(jì)有效。因此，hrm大大簡化了snp檢測的操作步驟，并減少了分析時間，目前該項技術(shù)主要應(yīng)用于突變掃描、snp的發(fā)現(xiàn)、基因分型、小片段的插入和刪除、甲基化研究及混合樣品的突變發(fā)現(xiàn)等方面。樟樹生化類型準(zhǔn)確劃分，是高效開發(fā)有著重要的經(jīng)濟(jì)價值的樟樹精油的基礎(chǔ)，快速、準(zhǔn)確的基因分型對化學(xué)類型的區(qū)分至關(guān)重要，目前關(guān)于此類研究，鮮見報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種用于對不同樟樹進(jìn)行基因分型的snp引物，為29株樟樹建立指紋圖譜。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述snp引物的應(yīng)用。技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種用于對不同樟樹進(jìn)行基因分型的snp引物，由8對引物組成，各引物的核苷酸序列如下表所示：引物名稱上游引物(5’to3’)下游引物(5’to3’)snp1aagctgcaaacccattcgagtgacctgcttggcatacgcsnp2catggctctaatgggcaatctgcgggctctcgtagaaasnp3cgccaggcagggtaagccaacagacagggcactaaagsnp4gcctataagggataagagaatacattttacaaagagattccacatsnp5caaccctctaatcagtgatgagggtggatcttatcttgagatsnp6tgagttgaaactttatgaggccatctacttcagtcccaccttsnp7ctcaaaaggacaagagtgagatgtttgacttcagcagagactsnp8aagcttcttcttcgatatagactacgaaagaagaaagagaagaac應(yīng)用所述的snp引物構(gòu)建樟樹的指紋圖譜，獲得29個樟樹對應(yīng)的指紋圖譜，如下表所示：所述的應(yīng)用snp引物構(gòu)建樟樹的指紋圖譜，采用7對snp引物，名稱分別為：snp1，snp2，snp3，snp4，snp5，snp6，snp7。所述snp引物在不同樟樹基因組dna的snp位點基因分型的檢測中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用，包括以下步驟：1)待測樟樹樣品dna的提??；2)使用相同反應(yīng)體系及程序?qū)φ翗錁颖净蚪Mdna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到待測樟樹的pcr產(chǎn)物；3)對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率溶解曲線分析確定snp位點的基因型；4)sanger測序再次驗證snp基因型。步驟2)中，pcr反應(yīng)體系20μl：30ng模板dna；10μl1xforget-me-nottmqpcrmastermix；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o補齊。步驟2)中，pcr反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃2min；95℃變性5s，45個循環(huán)；60℃復(fù)性30s。步驟3)中，hrm的反應(yīng)程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。本發(fā)明通過實驗證明：本發(fā)明的引物共8對，其中7對snp引物組合可以用于構(gòu)建樟樹的指紋圖譜。本發(fā)明利用樟樹數(shù)據(jù)開發(fā)的snp引物能夠?qū)Σ煌翗溥M(jìn)行基因分型，并且本發(fā)明操作方法簡單，通量高，成本低。此外，本發(fā)明開發(fā)的7對snp引物構(gòu)建了不同樟樹的指紋圖譜，驗證的8個snp位點還可以用來分子標(biāo)記輔助育種，遺傳多樣性研究，基于snp的關(guān)聯(lián)分析，以及用于種質(zhì)資源鑒定與分類等。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢：1)結(jié)果高度準(zhǔn)確、可靠：利用本發(fā)明進(jìn)行檢測與鑒定，檢測結(jié)果100％準(zhǔn)確，檢測結(jié)果提供了高度的可靠性。2)操作快速簡便：進(jìn)行不同個體間的樣本檢測，一般整個試驗過程只需幾小時即可完成，與傳統(tǒng)的測序技術(shù)相比，省時省力，可以實現(xiàn)高通量。3)無需基于凝膠電泳進(jìn)行，減少試劑和耗材的使用，更佳環(huán)保，同時節(jié)省人力和減少人工誤差。4)檢測結(jié)果靈敏度高：對待檢測樣品僅需提供模板dna30ng即可準(zhǔn)確進(jìn)行鑒定。5)效率高：相比于ssr指紋圖譜，雖然snp單位點的理論信息量不如ssr豐富，但是snp在全基因組范圍內(nèi)密度遠(yuǎn)高于ssr，借助hrm分型可以迅速獲取指紋信息，綜合效率上高于ssr指紋。附圖說明圖1是以引物snp7為例，根據(jù)不同樟樹個體表現(xiàn)出的差異溶解曲線峰，對其進(jìn)行基因分型結(jié)果的溶解曲線，紅色為cc，橘色為tt，藍(lán)色為tc；圖2是以引物snp2為例，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的sanger測序結(jié)果圖。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實施例11、初步篩選對樟樹進(jìn)行基因分型的snp引物1)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得從野外獲得多份樟樹樣本，提取次生代謝產(chǎn)物，測定其生化類型，從其中選取芳樟型f-1、f-2以及龍腦型l-1、l-2樟樹葉片樣品，放于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)制造商的說明書使用rneasyplantminikit(qiagen，hilde，germany)進(jìn)行樟樹總rna提取。提取后，在1.0％的瓊脂糖凝膠上檢測rna的降解和污染。使用分光光度計(implen，westlakevillage，ca，usa)檢查rna純度。使用2.0flurometer(lifetechnologies,carlsbad,ca,usa)中的rnaassaykit測定rna的濃度。使用anagilentbioanalyzer2100system(agilenttechnologies,santaclara,ca,usa)中的rnanano6000assaykit評估rna的完整性。每個樣品的總量為3μgrna用作rna樣品制備的輸入材料。按照制造商的說明書，使用ultratmrnalibraryprepkit(neb，usa)生成測序文庫，并將索引代碼添加到每個樣品的屬性序列中。簡而言之，使用poly-toligo附著磁珠從總rna純化mrna。在nebnextfirststrandsynthesisreactionbuffer(5x)中，在高溫下使用二價陽離子打斷成短片段。以mrna為模板，使用六堿基隨機(jī)引物和m-mulv逆轉(zhuǎn)錄酶(rnaseh-)合成第一鏈cdna。隨后使用dna聚合酶i和rna酶h進(jìn)行第二鏈cdna合成。通過外切核酸酶/聚合酶活性將剩余突出部分轉(zhuǎn)化為平端。在dna片段的3'末端腺苷酸化后，連接具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的nebnext適配子以進(jìn)行雜交。為了選擇長度優(yōu)先為150-200bp的cdna片段，文庫片段用ampurexp系統(tǒng)(beckmancoulter，beverly，usa)純化。然后將3μluserenzyme(neb，usa)與大小選擇的接頭連接的cdna在37℃下使用15min，然后在95℃下pcr5min。進(jìn)而使用phusion高保真dna聚合酶，通用pcr引物和index(x)引物進(jìn)行pcr。最后，將pcr產(chǎn)物純化(ampurexp系統(tǒng))，并在agilentbioanalyzer2100系統(tǒng)上評估文庫質(zhì)量。根據(jù)制造商的說明書，使用truseqpeclusterkitv3-cbot-hs(illumia)在cbot群集生成系統(tǒng)上進(jìn)行索引編碼樣本的聚類。集群生成后，在illuminahiseqtm2500高通量平臺上對其準(zhǔn)備進(jìn)行測序，并生成配對末端讀取。fastq格式的原始數(shù)據(jù)(rawreads)首先通過內(nèi)部perl腳本進(jìn)行處理。在此步驟中，通過刪除包含適配器的讀取，包含poly-n的讀取以及從原始數(shù)據(jù)讀取的低質(zhì)量來獲取干凈的數(shù)據(jù)(cleanreads)。同時，計算了cleandata的q20，q30，gc含量和序列重復(fù)水平。所有的下游分析都是以高質(zhì)量的cleandata為基礎(chǔ)。然后，將所有庫/樣本中的左文件(read1files)合并到一個大的left.fq文件中，將正確的文件(read2files)合并到一個大的right.fq文件中。基于left.fq和right.fq使用trinity完成轉(zhuǎn)錄組組裝，默認(rèn)情況下min_kmer_cov設(shè)置為2，其他所有參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。選擇具有最長長度的每個基因的轉(zhuǎn)錄本作為unigenes。1.snp的識別本實施例通過使用picard-toolsv1.41和samtoolsv0.1.18來排序，刪除重復(fù)讀取，對齊合并獲得每個樣本的bam結(jié)果。采用gatk2v3.2軟件用于執(zhí)行snpcalling(mckennaetal，2010)。原始的vcf文件使用gatk標(biāo)準(zhǔn)方法過濾(參數(shù)為clusterwindowsize:10；mq0>＝4and(mq0/(1.0*dp))>0.1；qual<10；qual<30.0orqd<5.0orhrun>5)，最后僅保留距離大于5的snp。2)snp引物的設(shè)計根據(jù)轉(zhuǎn)錄組unigene序列，挑選60個snp位點，利用oligo6.0軟件設(shè)計60對snp引物。設(shè)計的方法如下：首先確定snp位點所在序列的位置，然后在snp位點的上下游分別設(shè)計正向引物和反向引物，引物設(shè)計的參數(shù)為引物長度18-23bp；tm59℃-61℃，盡可能保證上下游引物的tm值一致，一般不超過2℃；gc含量在40-60％(45-55％最佳)；pcr產(chǎn)物大小為150-400bp；其它還應(yīng)注意引物3'端不應(yīng)出現(xiàn)超過3個的連續(xù)g或c；引物不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即不能有4bp以上的回文序列；引物自身、引物之間盡量不能有連續(xù)4個以上的堿基互補，尤其避免3'端的互補。3)ctab法提取樟樹基因組dna：打開水浴鍋，調(diào)節(jié)至65℃預(yù)熱備用。將50-100mg的樟樹葉片在液氮中充分研磨成粉末，并轉(zhuǎn)移只1.5ml的離心管中。向離心管中加入4mlctab，80μl120％巰基乙醇。放入65℃水浴鍋中預(yù)熱30min后取出，置于冰水中冷卻至室溫。加入4ml氯仿(異戊二醇：氯仿＝1:24)，12000rpm，離心4min。取上清至一干凈離心管中，加入3ml氯仿，抽提第二次，12000rpm，離心4min。將上清分裝在四個離心管中(1個2ml離心管裝備用液、3個1.5ml離心管)，每個1.5ml離心管分裝500μl。向每個離心管中加入2倍體積(1000μl)冰無水乙醇，再加50μl醋酸鈉，放置在-20℃冰箱，2h后取出，若無絮狀物，12000rpm離心5min。準(zhǔn)備一個新的1.5ml離心管，加入1000μl70％乙醇。將三個離心管中的絮狀物全部用槍頭挑出，加入新的離心管中。渦旋，12000rpm離心2min。再取一新的離心管，第二次用70％乙醇漂洗、渦旋、離心。小心的吸出離心管中的酒精，注意不要吸到絮狀物。加熱干燥，使酒精全部蒸發(fā)。向離心管中加入200μlddh2o，溶解1h，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?)snp引物的有效性驗證以樟樹基因組dna為模板，采用待檢測snp引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物；反應(yīng)結(jié)束后，取3μl的pcr產(chǎn)物加入4μlloadingbuffer，再加3μlddh2o，利用8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后采用銀染方法對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。能檢測到目的條帶且無其它雜帶和引物二聚體的，該待檢測引物即為有效引物。10μl的la-taq酶pcr反應(yīng)體系如下：5μl的premixtaq(lataqversion2.0plusdye)；0.2μmol/lsnp引物；40ngdna模版；剩余ddh2o補齊。pcr的反應(yīng)程序為：預(yù)變性94℃3min；35循環(huán)的94℃30s，最佳tm55℃30s，72℃30s；延伸72℃1min，最終4℃保存。結(jié)果表明：挑選的60對snp引物中，有45對引物能夠擴(kuò)增出條帶，但其中的35對引物擴(kuò)增出的條帶不單一，可能存在多個snp位點，暫不考慮進(jìn)行hrm分析，另外10對引物(見下表)擴(kuò)增條帶單一且產(chǎn)物大小與預(yù)期一致，暫為有效snp引物，用于hrm分析。1對引物對應(yīng)1個目標(biāo)snp位點，1對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物為含有對應(yīng)snp位點的dna片段。2、再次篩選對樟樹進(jìn)行基因分型的snp引物1)pcr擴(kuò)增及高分辨率溶解曲線(hrm)分析進(jìn)行基因分型以33個樟樹個體(其中4個樟樹個體為轉(zhuǎn)錄組測序的樟樹，芳樟型f-1、f-2和龍腦型l-1、l-2；其余29棵樟樹來源見表1)的基因組dna為模板，分別采用上述10對snp有效性引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到每個個體的10個引物對應(yīng)的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，每個引物對的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為含有某個snp位點的dna片段。pcr反應(yīng)體系20μl：30ng模板dna；1xforget-me-nottmqpcrmastermix10μl；0.1μmol/lsnp引物；剩余ddh2o補齊。采用viia7中的highresolutionmelt進(jìn)行pcr及基因分型。第一步，10μl的pcr反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃2min；45個循環(huán)的95℃變性5s，60℃復(fù)性30s；第二步，hrm的反應(yīng)程序：95℃10s，60℃1min，95℃15s，60℃15s。結(jié)果表明：有8對引物能夠進(jìn)行基因分型，其余2對引物因有雜峰(snp9，snp10)，所以被淘汰。采用appliedhrmsoftwarev2.0進(jìn)行溶解曲線分析。8對引物對應(yīng)的snp位點得到hrm驗證，其中，高分辨率溶解曲線部分結(jié)果如下：圖1為以snp引物7為例，根據(jù)不同樟樹個體表現(xiàn)出的差異溶解曲線峰，對其進(jìn)行基因分型結(jié)果的溶解曲線，紅色為cc，橘色為tt，藍(lán)色為tc。8對snp引物對樟樹個體的基因分型結(jié)果如表2所示：表1樟樹材料來源樟樹樣品號采集地樟樹樣品號采集地y-1江西崇義y-16江西崇義y-2江西安福y-17湖南郴州y-3江西龍南y-18四川宜賓y-4江西分宜y-19四川達(dá)州y-5江西資溪y-20四川成都y-6江西廣豐y-21四川廣元y-7江西廣昌y-22湖北黃岡y-8江西瑞昌y-23湖北襄陽y-9江西瑞金y-24江蘇南通y-10江西信豐y-25江蘇連云港y-11江西樂安y-26江蘇徐州y-12江西贛縣y-27江蘇鹽城y-13江西豐城y-29福建龍巖y-14湖南長沙y-29福建廈門y-15湖南長沙表2樟樹樣本分型結(jié)果其中，7對snp引物組合(snp1-7)構(gòu)建樟樹指紋代碼，獲得29個香樟對應(yīng)的指紋圖譜，如表3所示。表329個香樟對應(yīng)的指紋圖譜樣品號snp指紋代碼樣品號snp指紋代碼y-15221543y-163515254y-23515553y-171511245y-33551545y-185211243y-45511553y-193521435y-53255543y-201521253y-63521243y-215213253y-75555253y-221115253y-83551543y-235155253y-93525243y-245511253y-105525254y-255555543y-111221233y-265255253y-125211233y-271523243y-133215243y-281551545y-141215233y-291551535y-151515243注：純合型aa，gg，tt，cc對應(yīng)1，2，3，4，突變型對應(yīng)5。實施例2高分辨率溶解曲線分析結(jié)果的驗證通過pcr產(chǎn)物測序?qū)Ω叻直媛嗜芙馇€分析得到的基因分型的結(jié)果進(jìn)行驗證。具體步驟如下：挑選snp的不同分型的pcr產(chǎn)物20μl，進(jìn)行sanger測序，根據(jù)測序峰圖和等位基因出現(xiàn)的頻率確定基因型，并與hrm基因分型結(jié)果進(jìn)行比較，以驗證引物基因分型的準(zhǔn)確性。經(jīng)過sanger測序驗證本發(fā)明的引物通過hmr分析對銀杏進(jìn)行基因分型的結(jié)果是可靠的。測序結(jié)果如下：通過測序獲得基因峰圖，以snp2引物為例(圖2的a，b)，其擴(kuò)增片段的snp位點為g/a突變，圖2a基因型為a/t，圖2b基因型為a/a，均符合hrm基因分型結(jié)果，認(rèn)為snp為陽性snp位點且hrm基因分型結(jié)果準(zhǔn)確。當(dāng)前第1頁12