本發(fā)明屬于地下水微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及煤層氣田地下水微生物檢測方法。

背景技術(shù)：

煤層氣(coalbedmethane，cbm)俗稱瓦斯，是指以吸附態(tài)為主、游離態(tài)為輔，賦存于煤層中以甲烷為主要成分的一種自生自儲的非常規(guī)天然氣。煤層氣產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，不僅是新能源開發(fā)利用的必然趨勢，能夠改善能源供給結(jié)構(gòu)，有效緩解化石能源供應(yīng)不足的能源危機，同時也是煤礦安全開采和環(huán)境保護的客觀要求，具有重大經(jīng)濟、社會和環(huán)境意義。近年來，世界上各產(chǎn)煤大國相繼加入到煤層氣開發(fā)利用當(dāng)中，美國已實現(xiàn)煤層氣的大規(guī)模商業(yè)化開發(fā)。中國煤層氣的井下抽采和地面開采利用也非常活躍，煤層氣產(chǎn)量逐年增大。煤層氣開發(fā)在山西柳林、山西晉城、河北大城、陜西韓城、鄂南等地都先后取得重大突破，特別是煤層氣勘探的熱點地區(qū)鄂爾多斯盆地和沁水盆地。

煤層氣不僅存在熱成因，同樣存在生物成因。生物成因氣通常被認為是在微生物的作用下，通過降解煤來產(chǎn)生的。生物成因氣的提出對煤層氣開采起到了巨大的推動作用，通過激活煤層原位微生物可以促進煤層氣的再生，從而增加煤層氣儲量，延長煤層氣田的開采年限；同時微生物降解煤能夠增加煤層的滲透性，提高煤層氣的回采率；而且煤層微生物能夠?qū)⒒刈⒌亩趸嫁D(zhuǎn)化為甲烷被再次利用，使得能源循環(huán)利用成為可能。因而，研究、檢測煤層氣田地下水微生物具有很重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種煤層氣田地下水微生物檢測方法，該檢測方法具體包括以下步驟：

(1)采集煤層氣田地下710～800m左右的地下水，盛裝于充滿氮氣的厭氧瓶中，將厭氧瓶放置于-22～-25℃冰盒內(nèi)保存；

(2)在厭氧環(huán)境下，將上述采集到的地下水過濾到0.22μm的濾膜上，提取地下水中的基因組dna；

(3)采用引物對地下水中的細菌進行pcr擴增，并使用16srdnav3區(qū)通用引物進行嵌套pcr擴增，然后使用dgge對擴增產(chǎn)物進行分離；

(4)采用引物對地下水中的古菌進行pcr擴增，并使用16srdnav3區(qū)通用引物進行嵌套pcr擴增，然后使用dgge對擴增產(chǎn)物進行分離；

(5)利用imagej對dgge膠進行數(shù)字化，獲得條帶的位置及其亮度的信息后，使用matlab對數(shù)據(jù)做pca分析，用于解析地下微生物種群信息。

其中，煤層氣田地下水微生物檢測方法步驟(3)中所述引物為27f和1492r。

其中，煤層氣田地下水微生物檢測方法步驟(4)中所述引物為8f和1958r。

其中，煤層氣田地下水微生物檢測方法步驟(3)和(4)中所述的pcr擴增，是指：進行嵌套pcr擴增和pcr擴增，分別得到細菌和古菌的16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物。

其中，煤層氣田地下水微生物檢測方法步驟(3)和(4)中所述的pcr擴增的擴增程序為：a、預(yù)變性96℃4.5min；b、96℃20s、65℃25s、70℃30s，驟循環(huán)40次；c、70℃延伸8min。

其中，煤層氣田地下水微生物檢測方法步驟(3)和(4)中所述的使用dgge對擴增產(chǎn)物進行分離是指：變性劑梯度為45～60％的聚丙烯酰胺膠(濃度為6.8～7.8％)被用于16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物進行分析。

本發(fā)明的有益效果是：本方法利用16srdna基因文庫、引物pcr擴增和dgge相結(jié)合的技術(shù)獲得煤層氣田地下水樣品微生物指紋圖譜，提供了對地下水樣品中存活尚不可培養(yǎng)的微生物的檢測方法，能夠準(zhǔn)確、有效地分析地下水中細菌和古菌的群落結(jié)構(gòu)，為研究煤層氣的生物生成途徑、機理奠定了基礎(chǔ)。

具體實施方式

本發(fā)明提供了煤層氣田地下水微生物檢測方法，該檢測方法具體包括以下步驟：

(1)采集煤層氣田地下710～800m左右的地下水，盛裝于充滿氮氣的厭氧瓶中，將厭氧瓶放置于-22～-25℃冰盒內(nèi)保存；

(2)在厭氧環(huán)境下，將上述采集到的地下水過濾到0.22μm的濾膜上，提取地下水中的基因組dna；

(3)采用27f、1492r引物對地下水中的細菌進行pcr擴增，并使用16srdnav3區(qū)通用引物進行嵌套pcr擴增，得到細菌的16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物，然后使用dgge對擴增產(chǎn)物進行分離；

(4)采用8f、1958r引物對地下水中的古菌進行pcr擴增，并使用16srdnav3區(qū)通用引物進行嵌套pcr擴增，得到古菌的16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物，然后使用dgge對擴增產(chǎn)物進行分離；

(5)利用imagej對dgge膠進行數(shù)字化，獲得條帶的位置及其亮度的信息后，使用matlab對數(shù)據(jù)做pca分析，用于解析地下微生物種群信息。

其中，煤層氣田地下水微生物檢測方法步驟(3)和(4)中所述的pcr擴增的擴增程序為：a、預(yù)變性96℃4.5min；b、96℃20s、65℃25s、70℃30s，驟循環(huán)40次；c、70℃延伸8min。

其中，煤層氣田地下水微生物檢測方法步驟(3)和(4)中所述的使用dgge對擴增產(chǎn)物進行分離是指：變性劑梯度為45～60％的聚丙烯酰胺膠(濃度為6.8～7.8％)被用于16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物進行分析。

以下結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的解釋和說明，但并不因此限制本發(fā)明的保護范圍。

實施例

煤層氣田地下水微生物檢測方法，該檢測方法具體包括以下步驟：

(1)以湖北宜昌五峰煤礦為例，采集煤層氣田地下750m左右的地下水，盛裝于充滿氮氣的厭氧瓶中，將厭氧瓶放置于-25℃冰盒內(nèi)保存；

(2)在厭氧環(huán)境下，將上述采集到的地下水過濾到0.22μm的濾膜上，提取地下水中的基因組dna；

(3)采用27f、1492r引物對地下水中的細菌進行pcr擴增，并使用16srdnav3區(qū)通用引物進行嵌套pcr擴增，pcr擴增程序為：a、預(yù)變性96℃4.5min；b、96℃20s、65℃25s、70℃30s，驟循環(huán)40次；c、70℃延伸8min；得到細菌的16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物，然后使用dgge對擴增產(chǎn)物進行分離：變性劑梯度為55％的聚丙烯酰胺膠(濃度為7.0％)被用于16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物進行分析；

(4)采用8f、1958r引物對地下水中的古菌進行pcr擴增，并使用16srdnav3區(qū)通用引物進行嵌套pcr擴增，pcr擴增程序為：a、預(yù)變性96℃4.5min；b、96℃20s、65℃25s、70℃30s，驟循環(huán)40次；c、70℃延伸8min；得到古菌的16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物，然后使用dgge對擴增產(chǎn)物進行分離：變性劑梯度為55％的聚丙烯酰胺膠(濃度為7.0％)被用于16srdnav3片段和pcr擴增產(chǎn)物進行分析；

(5)利用imagej對dgge膠進行數(shù)字化，獲得條帶的位置及其亮度的信息后，使用matlab對數(shù)據(jù)做pca分析，用于解析地下微生物種群信息。

結(jié)果顯示，五峰煤層氣田的古菌只有產(chǎn)甲烷古菌，以methanosaeta和methanosarcina為主；同時檢測到豐富的細菌，以rheinheimera和hydrogenophaga為主。methanosaeta和methanosarcina是自然界中常見的兩種產(chǎn)甲烷菌，能夠利用多種簡單底物產(chǎn)生甲烷，如乙酸鹽、甲酸鹽、甲醇、h2等。煤層氣田地下厭氧的環(huán)境為產(chǎn)甲烷菌的生存提供了有利條件。同時，細菌中還檢測到豐富的發(fā)酵類細菌，能夠?qū)⒚簩又械拇蠓肿踊衔锝到鉃楹唵涡》肿樱瑸楫a(chǎn)甲烷菌的代謝提供底物。

以上所述為本發(fā)明的優(yōu)選實施例，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明結(jié)構(gòu)的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些也應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和本專利的實用性。