本申請是申請?zhí)枮?01280068836.4、國際申請日為2012年12月3日的同名的發(fā)明專利申請的分案申請。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求保護在2011年12月3日提交的臨時專利申請61/566,651的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，該專利申請以引用的方式并入到本文中用于所有目的。

本申請以引用的方式并入了以下臨時專利申請中的每一個：

在2010年7月23日提交的61/367,371

在2010年1月21日提交的61/297,278

在2011年4月1日提交的61/471,103。

本申請涉及在以下申請中的一個或多個中討論的材料，其中的每一個以引用的方式并入到本文中用于所有目的：在2008年3月17日提交的臨時專利申請61/037,297；在2008年1月3日提交的臨時專利申請61/018,882；在2008年8月11日提交的美國申請11/994,997，其為在2006年7月6日提交的pct/us06/26364的國家階段進入并且其要求保護在2006年2月14日提交的臨時專利申請60/773,467和2005年7月7日提交的臨時專利申請60/697,449的優(yōu)先權(quán)；在2008年1月25日提交的美國申請12/019,857，其要求保護在2007年2月8日提交的美國臨時專利申請no.60/900,651的優(yōu)先權(quán)；在2006年12月29日提交的美國申請?zhí)?1/648207，其要求保護在2006年1月4日提交的美國臨時專利申請no.60/756,399的優(yōu)先權(quán)；在2009年1月5日提交的美國申請12/348907。

版權(quán)通知

依照37c.f.r.1.71(e)，申請人指出，本公開的一部分包含要求版權(quán)保護的材料，（例如但不限于圖表、裝置照片、或者本提交物任何其它方面，對這些方面在任何權(quán)限中版權(quán)保護是或者可能是有用的）。本版權(quán)所有人對于任何一個專利文檔或?qū)＠_文本的傳真復(fù)制沒有異議，如出現(xiàn)在專利商標(biāo)局專利文件或記錄中，但所有其它版權(quán)被保留。

本發(fā)明在各種實施例中涉及用于在受控制的環(huán)境中培養(yǎng)細胞或其它生物材料的化驗、系統(tǒng)和/或裝置并且其可適用于通常使用微流體系統(tǒng)的相關(guān)領(lǐng)域。特定實施例涉及可以結(jié)合各種標(biāo)準(zhǔn)自動化處置系統(tǒng)使用的配置，具有主動或被動培養(yǎng)基（medium）加載和灌注，并且提供高處理量的多化驗自動化系統(tǒng)用于培養(yǎng)、查看和分析細胞生長、侵入、移動、趨化性或其它性質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明在具體實施例中涉及用于微流體培養(yǎng)板的熱控制系統(tǒng)和用于培養(yǎng)板的其它自動化系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

在本提交物中任何位置對于任何作品、出版物、銷售或活動的討論，包括隨著本申請?zhí)峤坏娜魏挝臋n，不應(yīng)認為承認任何這樣的作品構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。在本文中對于任何活動、作品或出版物的討論并不以任何特定的權(quán)限承認這樣的活動、作品或出版物存在或已知。

微流體細胞培養(yǎng)為用于在藥物篩選、組織培養(yǎng)、毒性篩選和生物研究中應(yīng)用的重要技術(shù)，并且可以提供改進的生物功能，更高品質(zhì)的基于細胞的數(shù)據(jù)、減少的試劑消耗，和更低成本。高品質(zhì)分子和細胞樣品制備對于各種臨床、研究和其它應(yīng)用而言是重要的。接近地示樣品的體內(nèi)特征的體外樣品（invitrosample）可能受益于很多種分子和細胞應(yīng)用。細胞或其它生物或化學(xué)活性材料（諸如被涂布了各種生物分子的珠粒）的處置、表征、培養(yǎng)和可視化已在藥物發(fā)現(xiàn)、疾病診斷和分析以及很多種其它治療和實驗工作中變得越來越重要/有價值。

涉及微流體系統(tǒng)、裝置、方法和制造的許多方面在上文引用和相關(guān)的專利申請中討論。對那些申請的閱讀不應(yīng)向本文所提出的任何權(quán)利要求施加任何特定限制，這些并入的文檔提供與具體實施例有關(guān)的適用的背景資料。

討論了與使用微流體系統(tǒng)進行細胞培養(yǎng)和相關(guān)活動有關(guān)的各種策略的其它出版物和/或?qū)＠臋n包括以下美國專利申請和非專利文獻，其與本文中所有引文一起通過引用并入到本文中用于所有目的。這里給出的這些引用的列表并不表示這些引用構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。

cytoplex,inc.6,653,124“array-basedmicroenvironmentforcellculturing,cellmonitoringanddrug-targetvalidation?！?/p>

cellomics,inc.6,548,263“miniaturizedcellarraymethodsandapparatusforcell-basedscreening?！?/p>

fluidigm,inc.公開申請20040229349(2004年11月8日)“microfiuidicparticle-analysissystems?！薄?/p>

如上文所引用的、涉及本發(fā)明者中至少一個的早期工作和專利申請討論了與微流體細胞培養(yǎng)有關(guān)的各種配置、方法和系統(tǒng)并且那些工作和那些公開以引用的方式并入到本文中。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及與改進的微流體細胞培養(yǎng)裝置和系統(tǒng)，特別是用于在受控制的溫度和氣體參數(shù)下培養(yǎng)和/或分析和/或查看細胞的系統(tǒng)有關(guān)的各種部件、系統(tǒng)和方法。在一方面，本發(fā)明涉及新穎的微流體細胞培養(yǎng)裝置、系統(tǒng)和方法，其優(yōu)于先前提出的培養(yǎng)系統(tǒng)，在某些實施例中提供更方便和不明顯/不醒目的加熱和氣體控制并且也提供自動處置。在另一方面，本發(fā)明涉及用于在各種多細胞培養(yǎng)單元系統(tǒng)中集成加熱和氣體控制與多個微流體細胞培養(yǎng)單元的新穎的結(jié)構(gòu)和方法，諸如包括各種標(biāo)準(zhǔn)孔板格式的微量滴定孔板結(jié)構(gòu)，例如96孔sbs培養(yǎng)板、或其它板格式，包括具有6個、12個、24個、96個、384個或1536個樣品孔的板，以及開放底部標(biāo)準(zhǔn)孔板、以及具有用于細胞培養(yǎng)和/或查看的特定區(qū)域的板。

具有氣體和/或溫度控制的可移除的多腔室板歧管

在特定實施例和示例中，設(shè)計特征包括提供呈適宜格式的細胞培養(yǎng)裝置，其允許排除到板本身的管件和連接器并且提供溫度控制和監(jiān)視，大部分或完全容納于可移除的歧管內(nèi)，可移除的歧管利用氣體密封件裝配到板上，從而提供利用在培養(yǎng)平臺中的溫度和/或氣體控制來維持長期細胞培養(yǎng)的能力，培養(yǎng)平臺維持易于觀察細胞的能力并且可容易地從培養(yǎng)板移除。本發(fā)明的系統(tǒng)可以用于在培養(yǎng)板上的多種細胞培養(yǎng)單元，諸如在上文引用的專利申請中所描述的那些，包括用于確定細胞侵入的細胞培養(yǎng)單元、具有凝膠培養(yǎng)基的培養(yǎng)單元和本文和在所并入的相關(guān)申請中所描述的多種其它培養(yǎng)單元。

活細胞通常需要謹慎地控制它們的物理環(huán)境，包括營養(yǎng)物和氣體交換、溫度調(diào)節(jié)和對于應(yīng)力的防護。諸如在上文所引用的專利申請中所描述的先進的微型細胞培養(yǎng)方法能允許進行結(jié)構(gòu)控制（微型制作）、灌注控制（微流體）。

微型培育和微型培育器腔室/在接觸微流體細胞培養(yǎng)腔室中的孔

根據(jù)具體實施例，本發(fā)明針對于這個領(lǐng)域的額外方面，在本文中有時被稱作微型培育，用來提供對溫度和氣氛的控制以用于微型細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中使得相對于觀察裝備而言其并不明顯并且在具體實施例中易于附連到培養(yǎng)板和從培養(yǎng)板移除。

根據(jù)具體實施例，本發(fā)明提供傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)培育器構(gòu)思的微型化以向微流體腔室直接執(zhí)行動態(tài)、連續(xù)溫度和氣體調(diào)節(jié)。在示例實施方式中，通過形成與微流體細胞培養(yǎng)腔室(1ul)接觸的約5ml體積的微型培育器腔室，這是可能的。微型培育器的溫度和氣體含量快速轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)腔室（通過傳導(dǎo)和擴散）。在具體實施例中，利用如本文所描述的新穎歧管設(shè)計來維持微型培育器。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的歧管可以由各種系統(tǒng)和軟件加以控制。

用于對活細胞進行延時顯微鏡檢查的系統(tǒng)

許多產(chǎn)品和方法能允許對活細胞進行延時的（time-lapse）顯微鏡檢查。通常已知的三種方案可通常被理解為：（1）完整的顯微鏡封殼；（2）載物臺上的培育器；以及（3）灌注腔室。

完整的顯微鏡封殼包圍整個顯微鏡，除了某些發(fā)熱或熱敏感部件諸如照相機和照明源之外。在封殼內(nèi)的空氣被循環(huán)并且維持在樣品的所希望的溫度和氣體環(huán)境。這種方法的一種優(yōu)點在于整個顯微鏡的溫度控制大幅減小了由于室溫波動所造成的焦點漂移，但許多缺點包括昂貴并且定制的構(gòu)造、對于接近顯微鏡的阻礙，以及能量與氣體的大量消耗。而且，向濕氣和重復(fù)的溫度變化暴露可能損壞顯微鏡。

載物臺上的培育器僅包圍計劃用來容納一個或多個培養(yǎng)皿（petridish）、載玻片或其它培養(yǎng)平臺的較小體積。這些提供局部溫度調(diào)節(jié)并且能允許有限的氣體環(huán)境控制。它們是適宜的，但并不提供與顯微鏡封殼相同水平的控制，因為載物臺上培育器必須模仿封殼的機械結(jié)構(gòu)，但呈更小的大小并且適用于顯微鏡。例如，在載物臺上培育器中的均勻溫度控制受到載物臺本身的散熱器限制，并且切口適于提供用于光學(xué)透明度的光路徑，進一步減小了均勻性。此外，載物臺上培育器設(shè)計的復(fù)雜性使得它們較為昂貴。

灌注腔室通常包括封閉著流動液體體積的組件，具有直接穿過腔室壁或者在入口流動路徑的緊鄰上游的加熱元件。需要謹慎地考慮控制元件的設(shè)計，因為諸如熱/質(zhì)量轉(zhuǎn)移這樣的問題可能使得適當(dāng)維持穩(wěn)態(tài)條件較難。目前，流動腔室并不常用于活細胞成像，這歸因于使它們適應(yīng)典型用途的無數(shù)困難。

相比而言，本發(fā)明，經(jīng)由使用密封到微流體板上的歧管而將溫度、流量和氣體控制直接集成到微流體培養(yǎng)板。雖然在某些方面類似的歧管在上文所參考的申請中的某些中被討論以控制微流體板上的灌注，先前的設(shè)計并未合并本文所描述的特征中的所有特征，由于歧管和培養(yǎng)板緊湊的性質(zhì)，這種合并是較難的。本歧管設(shè)計包括通過歧管操作而形成的新穎的溫度或氣體“微型培育器”隔室。這些隔室已被展示為對于活細胞成像需要的適當(dāng)集成提供新穎和關(guān)鍵的優(yōu)點。

本發(fā)明能允許在顯微鏡載物臺上直接進行細胞培養(yǎng)，而不使用外部環(huán)境腔室諸如封殼或載物臺上的加熱器。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的“微型培育器”構(gòu)思提供精確控制、長期細胞培養(yǎng)和容易使條件進行動態(tài)變化，在其它設(shè)計中，就此而言這點是尚難以實現(xiàn)的。

雖然本文詳細地討論的示例中的許多示例被設(shè)計為結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)或定制孔板使用，根據(jù)具體實施例，本文所描述的各種配置的微流體結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)單元和系統(tǒng)和方法也可以獨立于任何孔板而部署，諸如在并不被配置成結(jié)合孔板或各種其它微流體裝置或系統(tǒng)使用的各種集成的芯片實驗室（lab-on-a-chip）系統(tǒng)中。

出于清楚目的，這個討論在具體示例方面參考裝置、方法和構(gòu)思。然而，本發(fā)明和其各方面可以適用于多種類型的裝置和系統(tǒng)。因此，預(yù)期本發(fā)明并不受到除了所附權(quán)利要求和其等效物之外的限制。

而且，在本領(lǐng)域中熟知的是，諸如本文所描述的系統(tǒng)和方法可以用模塊化方式包括多種不同部件和不同功能。本發(fā)明的不同實施例可以包括元件和功能的不同的混合并且可以將各種功能作為各種元件的部分而分組。出于清楚目的，在包括許多不同創(chuàng)新性部件以及創(chuàng)新性部件與已知部件的創(chuàng)新性組合的系統(tǒng)方面描述了本發(fā)明。不應(yīng)得出限制本發(fā)明為包含本說明書中的任何說明性實施例中列出的所有創(chuàng)新性部件的組合的推論。除非在本文中具體地陳述為其它情況，本文所描述的元件的任何組合應(yīng)被理解為包括那些元件的任何子集的每個子組合以及也包括與本文所描述或者本領(lǐng)域從業(yè)人員將會理解的任何其它元件相組合的那些元件的任何子集的任何子組合。

在附圖和下文的詳細描述的某些中，在多部件裝置或系統(tǒng)的重要獨立實施例的方面描述了本發(fā)明。這不應(yīng)認為限制本發(fā)明的各種新穎方面，本發(fā)明的各種新穎方面使用本文所提供的教導(dǎo)內(nèi)容，可以適用于多種其它情形。在附圖和下文的描述中的某些中，在包括與結(jié)構(gòu)尺寸、液體體積或壓力、溫度、電氣值、持續(xù)時間等有關(guān)的具體參數(shù)的多個具體示例實施例的方面描述了本發(fā)明。除非在所附權(quán)利要求中這樣提供，這些參數(shù)作為示例而提供并且不限制本發(fā)明，本發(fā)明涵蓋具有不同尺寸的其它裝置或系統(tǒng)。出于提供更明確闡述描述的目的，作為示例給出特定已知的制作步驟、細胞處置步驟、試劑、化學(xué)或機械過程、和可能被包括以用來制造根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的系統(tǒng)或裝置的其它已知部件。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解除非在上下文中具體地指出為其它情況，在本文所描述的過程中可以做出各種已知的替代。

在本提交物中所引用的所有參考、出版物、專利和專利申請以它們?nèi)囊玫姆绞讲⑷氲奖疚闹杏糜谒心康摹?/p>

附圖說明

圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的示例微型培育器歧管的側(cè)視圖，其被示出處于具有孔板和顯微鏡查看器的微型培育器系統(tǒng)中的適當(dāng)位置。

圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例帶有熱控制器的歧管的頂視平面圖的一示例。

圖3為根據(jù)本發(fā)明的具體實施例帶有密封到孔板上和安裝到顯微鏡的查看器中的熱控制器的歧管的頂側(cè)視圖的一示例。

圖4示出了放置于96孔標(biāo)準(zhǔn)sbs板上的具有四個培養(yǎng)單元的培養(yǎng)板的一示例。這個示例示出了帶有六個入口孔（標(biāo)記為a1-d6）、放置于較大查看橢圓形下的四個微流體培養(yǎng)區(qū)、和兩個出口孔（7-8）的四個培養(yǎng)單元（對應(yīng)于標(biāo)記為a-d的行）。這只是示例并且各個孔和部件的放置和名稱對于不同實施方式將不同。

圖5a至圖5d為根據(jù)本發(fā)明的具體實施例從各個視角觀察的帶有熱控制器的歧管的示例實施方式的示意圖。

圖6（a）示出根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的熱交換模塊的底部。底部附連到歧管的充氣（pneumatic）部分。圖6（b）示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的熱交換模塊的頂部。

圖7為密封到培養(yǎng)板上的歧管的充氣部分的示意側(cè)視圖并且示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例連接到環(huán)境控制體積的管線中的氣體。

圖8為根據(jù)具體實施例的歧管與微流體板如何形成接口連接的方式的示意圖，其中，通過向所有孔周圍的腔體施加真空而形成可靠密封。加熱元件在附圖中并未示出。

圖9示出了根據(jù)早期歧管設(shè)計的具有額外氣體管線和受熱物鏡的歧管。

圖10a至圖10c為根據(jù)早期設(shè)計的示例充氣歧管的示意圖的頂視圖、側(cè)視圖和平面圖。在此示例中，在右邊的八個管路用于壓縮空氣，并且每個被配置成向微流體陣列中的細胞入口孔的列提供壓力。在附圖中最左邊的管線用于真空并且連接到歧管周圍的外部真空環(huán)。使用本文的教導(dǎo)內(nèi)容來修改這種基本歧管設(shè)計以產(chǎn)生受熱的歧管。

圖11示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的示例微流體灌注系統(tǒng)(onix?)、微型培育器控制器和歧管(mic)。

圖12示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的示例微流體灌注系統(tǒng)(onix?)、微型培育器控制器和歧管(mic)以及計算機控制系統(tǒng)。

圖13示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例使用微型培育器系統(tǒng)在t=0（左）和在15小時（右）之后培養(yǎng)的nih-3t3小鼠成纖維細胞，示出了細胞生長和生存力。當(dāng)不對溫度或co2進行控制時，細胞在2小時內(nèi)快速死亡。

圖14示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的板和培養(yǎng)單元設(shè)計的一個替代方案，其具有填充了藍染料的示例培養(yǎng)單元，從頂部拍攝圖像。

圖15為onix微流體灌注系統(tǒng)與開源顯微鏡檢查應(yīng)用的集成的屏幕截圖。

圖16示出了與用于細胞分析的顯微鏡系統(tǒng)集成的微型培育系統(tǒng)。在具體實施例中歧管的尺寸允許它承座/安放在標(biāo)準(zhǔn)孔板載物臺上，具有并不干擾光顯微鏡檢查的透明的光路徑。這允許對微型培育器中培養(yǎng)的細胞進行延時成像。

圖17為示出代表性示例邏輯裝置的框圖，其中可以實施本發(fā)明的各個方面。

圖18為示出根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的自動化活塞驅(qū)動的系統(tǒng)的框圖。

圖19（表1）示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例可以被評估或者可以用來測試藥物或其它療法的疾病、病癥或狀態(tài)的示例。

圖20a至圖20d為根據(jù)本發(fā)明的具體實施例用于歧管的電子控制電路的示例實施方式的示意圖。

具體實施方式

1.概述

定義

“粒子”指生物細胞，諸如哺乳動物或細菌細胞、病毒粒子或脂質(zhì)體或可以用來根據(jù)本發(fā)明進行化驗的其它粒子。這樣的粒子具有在約50-100nm之間的最小尺寸并且可以如20微米般大或更大。當(dāng)用來根據(jù)本發(fā)明進行細胞化驗時，術(shù)語“粒子”和“細胞”可以互換地使用。

“微通道”或“通道”或“流動通道”通常指用于流體地連接根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的系統(tǒng)和裝置的各個部件的微米級通道。微通道通常具有矩形，例如正方形或圓形截面，在優(yōu)選實施例中，分別具有介于10微米與500微米之間和10微米與500微米之間的側(cè)部和深度尺寸。在微通道中流動的流體可以表現(xiàn)出微流體行為。當(dāng)用來指本發(fā)明的微孔陣列裝置內(nèi)的微通道時，術(shù)語“微通道”和“通道”互換地使用?！傲鲃油ǖ馈蓖ǔ１硎颈辉O(shè)計用于傳遞培養(yǎng)基、試劑或其它流體或凝膠和在某些實施例中細胞的通路?！芭囵B(yǎng)通道”或者“細胞培養(yǎng)通道”大體上表示在細胞培養(yǎng)期間細胞被設(shè)計流過并且也保留于其中的細胞培養(yǎng)結(jié)構(gòu)的一部分（但在某些實施例中細胞可以定位于培養(yǎng)通道的特定培養(yǎng)區(qū)中）。“空氣通道”通常表示用來允許氣體諸如空氣、富含氧氣的混合物等傳遞到流動通道或培養(yǎng)區(qū)附近的大致微米級通道?！肮嘧⑼ǖ馈庇袝r用來指示允許培養(yǎng)基灌注到培養(yǎng)區(qū)的流動通道和任何灌注通路或結(jié)構(gòu)。

“灌注屏障”指大體上分隔流動通道與細胞培養(yǎng)區(qū)或腔室的堅實結(jié)構(gòu)和灌注通路的組合。灌注通路通常小于微通道高度和/或?qū)挾龋ɡ?，大約5至50%或者大約10%）并且被設(shè)計成防止細胞、其它培養(yǎng)物和在某些實施例中凝膠遷移到流動通道內(nèi)，同時允許具有比流動通道中的流體流動高很多的流體阻力的某些流體流動。在一示例實施例中，灌注屏障具有4微米高并且原本沿著微通道的大部分長度延伸的灌注通路。在其它實施例中，灌注屏障具有與微流體通道大約一樣高但約4微米寬的許多灌注通路。

“微流體裝置”指具有由微米級微通道連接的各種工位或孔的裝置，其中，流體將在它們通過通道流動時表現(xiàn)出微流體行為。

“微孔陣列”指形成于基板上的兩個或更多個微孔的陣列。

“裝置”為在本領(lǐng)域中廣泛地使用并且涵蓋很多種意義的術(shù)語。例如，在其最基本并且最不詳細水平上，“裝置”可簡單地表示具有諸如通道、腔室和端口這樣的特征的基板。在增加的詳細水平，“裝置”還可包括封閉所述特征的基板，或者具有協(xié)同地或者獨立地操作的微流體特征的其它層。以其最詳細水平，“裝置”可包括全功能基板，其與便于在外部世界與基板的微流體特征之間相互作用的物體相配合。這種物體可以以不同地被稱作保持器、封殼、外殼或類似術(shù)語，如下文所討論。如本文所用的術(shù)語“裝置”指這些實施例中的任何實施例或者上下文可指示的詳細水平中的任一個。

微流體系統(tǒng)提供一種強力工具來執(zhí)行生物實驗。近來，基于彈性體的微流體特別地已變得越來越流行，這歸因于其光學(xué)透明性、透氣性和簡單的制作方法。本發(fā)明涉及用于各種培養(yǎng)和化驗應(yīng)用和系統(tǒng)的集成的微流體，其用于對培養(yǎng)板提供加熱控制和自動化的各種處置。具體實施例的優(yōu)點包括使用標(biāo)準(zhǔn)大小的微量滴定板格式，管自由板和容易地并且有效地使得板與歧管配合以提供氣體再循環(huán)和加熱控制。

根據(jù)本發(fā)明的另一實施例，如先前已描述，一種新穎的細胞加載系統(tǒng)使用充氣歧管和充氣壓力來將細胞放置到微型培養(yǎng)區(qū)內(nèi)。通過添加這種細胞加載系統(tǒng)，微流體細胞培養(yǎng)和分析可以使用現(xiàn)有的用于處置標(biāo)準(zhǔn)滴定板的其它自動化裝備而全自動化。在本發(fā)明中，加熱和氣體循環(huán)元件合并到歧管內(nèi)以提供微型培育器系統(tǒng)。

在另一實施例中，重力驅(qū)動的流動培養(yǎng)配置利用在入口與出口孔之間的培養(yǎng)基高度差以及將流體阻力設(shè)計成實現(xiàn)在nl/min單位體系（regime）中的所希望的流率，可以用于使培養(yǎng)基長時間（例如，多達4天）“被動地”流動而無需在諸如培育器的環(huán)境中使用龐大的外泵或管來控制溫度并且如本文所提供的熱控制的歧管可以用來在觀察期間控制細胞培養(yǎng)。

在某些實施例中，定制的充氣流動控制器可以附連到歧管中的氣體和電連接器并且因此用于將細胞加載到培養(yǎng)區(qū)域內(nèi)，在不同的暴露溶液之間切換，并且控制所述培養(yǎng)區(qū)域的溫度。數(shù)字軟件界面可以用來允許使用者隨著時間編程具體輸入（脈沖、斜坡等）以使細胞在延時成像期間向復(fù)雜功能暴露，同時根據(jù)需要維持或者改變溫度和氣體暴露。

2.微流體培養(yǎng)系統(tǒng)和陣列

上文所引用的應(yīng)用討論了多種不同的細胞培養(yǎng)配置和制作技術(shù)。細胞培養(yǎng)區(qū)的操作和材料的部分適用作本文討論的背景。在本文的示例中，一個或多個微型培養(yǎng)區(qū)經(jīng)由流體通路的網(wǎng)格（或者擴散入口或管道）連接到培養(yǎng)基或試劑通道，其中網(wǎng)格包括多個相交的高流體阻力灌注通路。在一個討論的示例中，在網(wǎng)格中的通路具有約1至4μm的高度，25至50μm的長度和5至10μm的寬度，網(wǎng)格允許在培養(yǎng)基或試劑通道與培養(yǎng)區(qū)之間更均勻擴散并且允許更易于制造和更均勻擴散。早期的申請還討論了在微型腔室與灌注/擴散通路或網(wǎng)格之間的高流體阻力比（例如，在約10:1、20:1至30:1范圍的比例）提供用于細胞培養(yǎng)的許多優(yōu)點，諸如：(1)細胞的大小排除；（2）將細胞定位于微型腔室內(nèi)；(3)促進用于細胞生長的均勻的流體環(huán)境；（4）配置微型腔室或培養(yǎng)區(qū)的陣列的能力；（4）易于制作；以及（5）操縱試劑而無需大量的閥網(wǎng)絡(luò)。示出了其中根據(jù)本發(fā)明的具體實施例一種網(wǎng)格狀灌注屏障可能比培養(yǎng)區(qū)更短得多或者可能靠近相同高度或者在相同高度的示例，并且另外示出了用于培養(yǎng)裝置的各種配置的示例。

3.具有熱控制的充氣歧管

如上文所討論，在多種培養(yǎng)系統(tǒng)中的一個困難在于如何控制培養(yǎng)區(qū)的加熱和溫度而同時允許觀察細胞過程。先前的解決方案已依靠于施加到孔板上的加熱源，例如，從顯微鏡查看器（例如，參看圖11），或者在受控制的環(huán)境中容納整個系統(tǒng)。

本發(fā)明通過將所有或幾乎所有熱和氣體控件放置于典型可移除的歧管中或者將所有熱和氣體控件附連到典型可移除的歧管來提供改進的培養(yǎng)系統(tǒng)，典型可移除的歧管被配置成操作，而不干擾觀察裝備。參考圖示的具體示例，將更易于理解本發(fā)明，但這些示例預(yù)期為說明性的而非限制性的。圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的示例微型培育器歧管的側(cè)視圖，其被示出處于具有孔板和顯微鏡查看器的微型培育器系統(tǒng)中的適當(dāng)位置。圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的具有熱控制器的歧管的頂視平面圖的一示例。圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例具有密封到孔板上并且安裝到顯微鏡查看器中的熱控制器的歧管的頂側(cè)視圖的一示例。圖4示出了放置到96孔標(biāo)準(zhǔn)sbs板上具有四個培養(yǎng)單元的培養(yǎng)板的一示例。這個示例示出了帶有六個入口孔（標(biāo)記為a1至d6）、放置于較大查看橢圓形下方的四個微流體培養(yǎng)區(qū)、和兩個出口孔（7-8）的四個培養(yǎng)單元（對應(yīng)于標(biāo)記為a-d的行）。

因此，根據(jù)具體實施例，微型培育器歧管可以與多種微流體板形成接口連接并且提供細胞加載、灌注、溫度和氣態(tài)環(huán)境控制中的一個或多個。對流熱交換器使用珀爾貼熱電裝置向氣體混合物添加熱或者從氣體混合物移除熱。通過來自溫?zé)釟怏w混合物傳導(dǎo)的熱來保持細胞溫?zé)岵⑶宜Ｍ臍怏w濃度通過在微流體板上的透氣膜在細胞周圍的培養(yǎng)基中擴散。

如從圖1可以看出，當(dāng)根據(jù)具體實施例的歧管放置于培養(yǎng)板上的適當(dāng)位置時，從熱交換器，在歧管下方并且向培養(yǎng)微流體上方的區(qū)域內(nèi)形成密封氣體腔室。被引入到微流體上方區(qū)域中的氣體由熱交換器中的風(fēng)扇或其它氣體循環(huán)器件循環(huán)，從而使用歧管對于培養(yǎng)區(qū)上方的氣體環(huán)境和溫度進行控制。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，這種設(shè)計解決了在較小空間中提供有效加熱以向細胞本身遞送受控制的溫度同時也控制氣體組成的問題。根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，微型培育器歧管包括氣體輸入和再循環(huán)風(fēng)扇二者以控制氣體組成。

在圖1所示的示例實施方式中，受控制并且經(jīng)加壓的氣體通過氣體管線5進入歧管。在此示例中，為了方便起見，歧管的充氣部分被示出為呈兩件，頂件10a和底件10b，底件10b包括用于緊密裝配到板20上的墊片，板容納多個孔22。歧管的充氣操作和到孔板上的裝配如在本文引用的專利申請中所描述。歧管還包括熱交換模塊40，其具有內(nèi)部熱交換翅片42和透明蓋板（例如，玻璃或丙烯酸）44。當(dāng)歧管放置于板10上時，在培養(yǎng)區(qū)上方的開放區(qū)域與加熱元件相連接以形成氣體循環(huán)區(qū)域30。為了示出在背景下的裝置，顯微鏡和照明元件102和104被圖示為它們將會通常在操作中使用?？装蹇梢允侨绫疚乃枋龅娜魏螛?biāo)準(zhǔn)或定制孔板。從本文所提供的教導(dǎo)內(nèi)容將了解歧管40的不同配置被構(gòu)建為用以適應(yīng)不同的孔板設(shè)計。

在歧管上的再循環(huán)

在此示例設(shè)計中，氣體和加熱控件和元件完全容納于歧管中并且歧管可以與任意數(shù)目的不同配置的微孔板配合，包括并不具有具體修改以允許它們接納熱源的微孔板。

根據(jù)一具體實施例，兩個風(fēng)扇用于熱交換元件中，一個用來循環(huán)在氣體區(qū)中的密封氣體，一個用于與熱交換器相互作用。

圖5a至圖5d示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例從各個視角觀察的具有熱控制器的歧管的示例實施方式的示意圖。歧管的充氣部分類似于先前所公開的設(shè)計那樣操作。熱交換模塊在下文中更詳細描述。

歧管熱交換模塊

在一示例實施例中的熱交換模塊通過使得處于所希望溫度的空氣進行循環(huán)來控制在腔室內(nèi)的溫度。在具體實施例中，由熱電珀爾貼模塊來提供溫度控制，熱電珀爾貼模塊為熟知的裝置，其將電流轉(zhuǎn)變?yōu)闇囟忍荻炔⑶乙部梢杂米鳒囟瓤刂破鳎瑴囟瓤刂破骷訜峄蚶鋮s。雖然其它加熱源可以用于本發(fā)明的歧管中，珀爾貼模塊是目前優(yōu)選的機構(gòu)，因為其可以完全合并到熱交換模塊和歧管內(nèi)。

在示例實施例中，熱交換模塊具有三個主要外部件：（1）金屬頂部封殼；（2）塑料底部封殼；以及，（3）具有橢圓形切口的歧管，橢圓形切口允許空氣流入到板的細胞培養(yǎng)腔室內(nèi)并且往回循環(huán)出來。

塑料底部封殼

圖6（a）示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的熱交換模塊的底部。底部附連到歧管的充氣部分，圖6（b）示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的熱交換模塊的頂部。在具體實施例中，底部的塑料封殼附連到歧管頂部（例如利用螺釘或膠或其它手段）。這種封殼的底部具有兩個2mm深流動路徑的切口。這些路徑在成像腔室上合并為一個。當(dāng)它們合并時，路徑的深度升高到3mm。圍繞著流動路徑的外裙部的是o形環(huán)，o形環(huán)防止在流動路徑與環(huán)境之間進行空氣交換。流動路徑的大小必須足夠?qū)捯栽试S所希望量值的流量循環(huán)到細胞培養(yǎng)腔室內(nèi)。這減小了在板細胞培養(yǎng)區(qū)域與熱交換器模塊之間（在溫度探針的位置處）的溫差。

立式/豎直擠出部位于/安放于路徑上方。其包含3個腔室。在一個流動路徑上方是散熱器并且在另一個上方安放著風(fēng)扇。第三腔室連接到金屬頂部封殼中的另一腔室以留出空間用于pcb板，pcb板連接著珀爾貼模塊的線、小溫度探針、繼電器、到微型培育器控制器的連接件和2個熱斷路器（cutoff）（每一個散熱器對應(yīng)一個熱斷路器）。溫度探針從電子腔室通過在風(fēng)扇上的螺紋孔發(fā)送到其流動路徑頂部內(nèi)以測量循環(huán)經(jīng)過的空氣的溫度。

塑料封殼還具有從頂部的切口，其形成用于2mm玻璃片的框架，這個玻璃片安放于細胞培養(yǎng)腔室正上方以形成用于顯微鏡成像的最佳條件而不破壞加熱。

金屬頂部封殼

金屬頂部封殼（圖6b）具有翅片擠出特征，這允許它充當(dāng)用于珀爾貼模塊的另一側(cè)的散熱器。此外，其可選地包含/容納了用于第二風(fēng)扇的腔室以加速冷卻過程，以及包含用于熱斷路器的空間，熱斷路器連接到塑料底部封殼的電子腔室。

在風(fēng)扇放置于封殼內(nèi)側(cè)并且熱斷路器附連到較小腔室之后，將熱油脂施加到珀爾貼模塊頂部上以便使之附連到金屬頂部封殼。在一具體示例中，塑料封殼的底部牢固地緊固到頂部封殼，例如使用螺釘或膠。

當(dāng)細胞培養(yǎng)區(qū)域中的溫度必須升高時，珀爾貼模塊通過冷卻所述頂部散熱器來加熱底部散熱器。底部風(fēng)扇吹送熱空氣跨越過底部散熱器到其下方的流動路徑內(nèi)。在更冷的空氣往回循環(huán)到風(fēng)扇時，受熱的空氣進入細胞培養(yǎng)腔室。當(dāng)在培養(yǎng)區(qū)域中的溫度降低時，珀爾貼模塊通過升高在頂部上的溫度（直到周圍溫度）來冷卻底部散熱器。

圖7為密封到培養(yǎng)板上的歧管的充氣部分的示意側(cè)視圖并且示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例連接到環(huán)境控制體積的管線中的氣體。

圖8示出了根據(jù)具體實施例的歧管與微流體板如何形成接口連接的方式的示意圖，其中，通過向所有孔周圍的腔體施加真空而形成可靠密封。加熱單元在此附圖中并未示出。

4.早期的充氣歧管

雖然重力或被動加載對于某些微流體細胞培養(yǎng)裝置而言是有效的并且在某些實施例中是合乎需要的，專有的充氣歧管是在上文引用的申請中在先前描述的。其可以與板配合并且充氣壓力被施加到細胞入口區(qū)用于在侵入化驗期間的細胞加載和培養(yǎng)。圖10a至圖10c示出了根據(jù)早期設(shè)計的示例充氣歧管的頂視圖、側(cè)視圖和平面圖。在此示例中，右邊的八個管路用于壓縮空氣，并且每個被配置成向微流體陣列中的細胞入口孔的列提供壓力。在附圖中最左邊的管線用于真空并且連接到歧管周圍的外真空環(huán)。歧管放置于標(biāo)準(zhǔn)孔板的頂部上。橡膠墊片位于板與歧管之間，具有匹配著歧管（未圖示）的孔。真空管線在孔之間的腔體中形成真空，保持著板和歧管在一起。壓力被施加到孔以將液體驅(qū)動到微流體通道（未圖示）內(nèi)。使用1psi的典型壓力，因此真空強度足以維持氣密密封。在一示例中存在通往壓力控制器的9個管路，8個管線用于壓縮空氣并且1個管線用于真空（最左邊）。在具體示例實施例中，每個列連接到單個壓力管線。跳過在細胞成像區(qū)域上方的列。

已發(fā)現(xiàn)加壓細胞加載在制備培養(yǎng)凝集細胞（例如，實體腫瘤、肝、肌肉等）方面是特別有效的。加壓細胞加載也允許具有細長培養(yǎng)區(qū)域的結(jié)構(gòu)被有效地加載。將加壓歧管用于細胞加載和將被動流動用于灌注操作允許了本發(fā)明利用相當(dāng)簡單的兩個入口設(shè)計，而無需如在其它設(shè)計中所用的額外的入口孔和/或閥。

雖然這種歧管有效地用于細胞加載和某些灌注任務(wù)，歧管并不有效地提供氣體在培養(yǎng)區(qū)上的再循環(huán)或者用于任何熱控制。如圖所示，當(dāng)需要時，從培養(yǎng)板的相反側(cè)，例如從顯微鏡查看器的附近提供加熱。

板歧管可選地還包括額外“氣體管線”，其用于使細胞浸泡在具有規(guī)定氣體環(huán)境（例如，5%co2）的微流體裝置中。其它示例包括氧氣和氮氣控制，但任何氣態(tài)混合物可以發(fā)送到細胞。氣體通過歧管流動到細胞培養(yǎng)區(qū)上方的密封孔的內(nèi)并且在微流體裝置中的孔能允許氣體流入到規(guī)定的微流體空氣通道內(nèi)，如上文所描述。透氣裝置層（pdms）允許氣體擴散到培養(yǎng)基內(nèi)，之后暴露細胞。通過使氣體持續(xù)地穿過微流體板流動，維持了穩(wěn)定的氣體環(huán)境。這提供了用于控制氣體環(huán)境以將微流體版放置于培育器內(nèi)的可選的手段。

圖12示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的示例微流體灌注系統(tǒng)(onix?)、微型培育器控制器和歧管(mic)和計算機控制系統(tǒng)。

僅作為一示例，圖14示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，板和培養(yǎng)單元設(shè)計的一個替代方案，其具有填充了藍色染料的示例培養(yǎng)單元，從頂部拍攝圖像。然而，在培養(yǎng)板的任何配置中的任何培養(yǎng)單元可以用于根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的正確尺寸的歧管。其包括開放的頂部單元、侵入單元、肝模仿單元、凝膠單元等，如在上文引用的申請中所描述。

細胞化驗和/或觀察

可以使用標(biāo)準(zhǔn)的基于光學(xué)的試劑套件（例如，熒光、吸收度、發(fā)光等）來在微流體細胞培養(yǎng)上直接執(zhí)行細胞化驗。例如，已展示了利用活細胞而運用基板至熒光分子的轉(zhuǎn)換的細胞生存力化驗(promegacorporation的celltiterbluereagent)。試劑被分配到流動入口儲器并且經(jīng)由重力灌注在一段時間（例如，21小時）暴露于細胞。為了更快速地引入試劑或其它流體，可將新流體添加到流動入口儲器，之后抽吸所述細胞入口儲器。

可以在微流體板中在細胞/液體上收集數(shù)據(jù)，諸如將板放置于標(biāo)準(zhǔn)熒光板讀取器內(nèi)(例如，biotekinstrumentssynergy2型)。在某些反應(yīng)中，基板可以擴散到出口培養(yǎng)基內(nèi)，并且因此易于在細胞入口儲器中檢測到。為了進行細胞成像化驗，板可以被放置于掃描顯微鏡或高含量系統(tǒng)上。例如，可以使用自動化olympus1x71倒置顯微鏡工位來利用20x物鏡捕獲/采集培養(yǎng)的肝細胞的生存力。

通過重復(fù)地填充/抽吸所述孔，可以以最小努力維持細胞較長時段（例如，與標(biāo)準(zhǔn)“生物反應(yīng)器”相比，標(biāo)準(zhǔn)生物反應(yīng)器需要較大流體儲器的大量無菌制備，在操作期間，這種較大流體儲器不能被容易地交換）。

示例細胞培養(yǎng)

使用微型培育系統(tǒng)來培養(yǎng)細胞以控制溫度和氣氛。在一示例中，在37℃和5%co2中培養(yǎng)人癌細胞(ht-1080,mcf-7,mda-mb-231)以在24小時監(jiān)視細胞分裂。使用微型培育系統(tǒng)已成功地培養(yǎng)了額外細胞類型，包括酵母、細菌、原發(fā)細胞、神經(jīng)元等。作為一示例，圖13示出了根據(jù)本發(fā)明的具體實施例使用微型培育器系統(tǒng)在t=0（左）和15小時后（右）培養(yǎng)的nih-3t3小鼠成纖維細胞，示出了細胞生長和生存力。當(dāng)不控制溫度或co2時，細胞在2小時內(nèi)快速死亡。

集成系統(tǒng)

用于收集和分析細胞和其它數(shù)據(jù)以及用于編譯、存儲和訪問本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫的集成系統(tǒng)通常包括數(shù)字計算機，數(shù)字計算機包括用于順序搜索和/或分析的指令集，和可選地，高處理量樣品控制軟件、圖像分析軟件、收集數(shù)據(jù)解釋軟件、用于將來自源的溶液轉(zhuǎn)移到可操作地連結(jié)到數(shù)字計算機上的目的地（諸如檢測裝置）的機器人控制電樞、用于將受檢者數(shù)據(jù)錄入到數(shù)字計算機的輸入裝置（例如，計算機鍵盤）中的一個或多個，或者控制分析操作或者由機器人控制電樞進行的高處理量樣品轉(zhuǎn)移。可選地，集成系統(tǒng)還包括閥、濃度梯度、流體多路傳送器（multilextor）和/或用于如所描述那樣與微型腔室形成接口連接的其它微流體結(jié)構(gòu)。

使用標(biāo)準(zhǔn)操作系統(tǒng)的普遍易得的計算硬件資源可以被采用并且根據(jù)本文提供的教導(dǎo)內(nèi)容修改，例如pc(intelx86或pentium芯片兼容型dos?、os2?、windows?、windowsnt?、windows95?、windows98?、linux或甚至macintosh、sun或pc將是足夠的)以用于本發(fā)明的集成系統(tǒng)。軟件科技中的當(dāng)前技術(shù)足以允許在計算機系統(tǒng)上實施本文所教導(dǎo)的方法。因此，在具體實施例中，本發(fā)明可以包括用于執(zhí)行本文所教導(dǎo)的方法中的一個或多個方法的邏輯指令集合（軟件、或硬件編碼指令）。例如，用于提供數(shù)據(jù)和/統(tǒng)計分析的軟件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)編程語言諸如visualbasic、fortran,basic、java等來構(gòu)建。這種軟件也可以使用多種統(tǒng)計編程語言、工具包或庫來構(gòu)建。

圖17示出了信息器具（或數(shù)字裝置）700，其可以被理解為能從介質(zhì)717和/或網(wǎng)絡(luò)端口719讀取指令的邏輯設(shè)備，網(wǎng)絡(luò)接口719可以可選地連接到具有固定介質(zhì)722的服務(wù)器720。設(shè)備700之后可以使用那些指令來指導(dǎo)服務(wù)器或客戶端邏輯，如本領(lǐng)域中理解，來實施本發(fā)明的方面?？梢詫嵤┍景l(fā)明的一種類型的邏輯設(shè)備為如以700所示的計算機系統(tǒng)，包含cpu707、可選的輸入裝置709和711、磁盤驅(qū)動器715和可選的監(jiān)視器705。固定介質(zhì)717、或者在端口719上的固定介質(zhì)722可以用于將這種系統(tǒng)編程并且可以表示圓盤型光學(xué)或磁性介質(zhì)，磁帶、固態(tài)動態(tài)或靜態(tài)存儲器等。在具體實施例中，本發(fā)明可以總體上或部分地實施為在這種固定介質(zhì)上記錄的軟件。通信端口719還可以用于最初接收可用于將這種系統(tǒng)編程的指令并且可能表示任何類型的通信連接。

各種編程方法和算法，包括一般算法和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可以用于執(zhí)行數(shù)據(jù)集、相關(guān)性和儲存功能的方面，以及其它所希望的功能，如本文所描述那樣。此外，數(shù)字或模擬系統(tǒng)諸如數(shù)字或模擬計算機系統(tǒng)可以控制多種其它功能諸如顯示和/或輸入和輸出文件的控制。用于執(zhí)行本發(fā)明的電分析方法的軟件也包括于本發(fā)明的計算機系統(tǒng)中。

自動密封器自動化系統(tǒng)

圖18為示出根據(jù)本發(fā)明的具體實施例的自動化活塞驅(qū)動系統(tǒng)的框圖。根據(jù)另外的具體實施例，自動密封器略微類似于通常用于生物科技中的板讀取器，主要差別在于系統(tǒng)部件的設(shè)計允許自動化處置微流體板。在此實施方式中。仍通過向間隙區(qū)施加真空而實現(xiàn)了在歧管與微流體板之間的可靠密封，但機械地施加了所必需的初始向下力。在歧管上方的區(qū)域為暢通的以允許由自動化液體處置器諸如tecanevo接近。真空和壓力傳感器以及板存在和托架位置傳感器允許基于智能軟件的誤差處置。圖18b為示出自動密封裝置接受和密封歧管到微流體板的圖像順序。單個充氣線性促動器（例如，活塞）提供水平和豎直運動。已發(fā)現(xiàn)這單個操作允許更精確地控制歧管和板并且在充氣歧管操作期間保持板就位。

其它實施例

盡管關(guān)于各種具體實施例描述了本發(fā)明，預(yù)期本發(fā)明并不限于這些實施例。在本發(fā)明的精神內(nèi)的修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然。

應(yīng)了解本文所描述的示例和實施例是出于說明目的并且其各種修改或變化將由本文的教導(dǎo)內(nèi)容暗示給本領(lǐng)域技術(shù)人員并且包括于本申請的精神和范疇內(nèi)以及權(quán)利要求的范圍內(nèi)。

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