本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)多肽領(lǐng)域，具體地說涉及一種胰島素類似物及其合成方法。

背景技術(shù)：

胰島素是由胰臟內(nèi)的胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。外源性胰島素主要用來糖尿病治療。

胰島素于1921年由加拿大人f.g.班廷和c.h.貝斯特首先發(fā)現(xiàn)。顯微鏡下的胰島β細胞顯微鏡下的胰島β細胞。1922年開始用于臨床，使過去不治的糖尿病患者得到挽救。中國科學院腎病檢測研究所主治直至80年代初，用于臨床的胰島素幾乎都是從豬、牛胰臟中提取的，這就是第一代胰島素-動物胰島素。不同動物的胰島素組成均有所差異，豬的與人的胰島素結(jié)構(gòu)最為相似，只有b鏈羧基端的一個氨基酸不同。動物胰島素是最早應用于糖尿病治療的胰島素注射制劑一般是豬胰島素，豬胰島素與人胰島素存在1至4個氨基酸的不同，因此容易發(fā)生免疫反應，注射部位皮下脂肪萎縮或增生，胰島素過敏反應，并且由于其免疫原性高，容易反復發(fā)生高血糖和低血糖，容易出現(xiàn)胰島素抵抗。

80年代初已成功地運用遺傳工程技術(shù)由微生物大量生產(chǎn)人的胰島素，并已用于臨床，這就是第二代胰島素-人胰島素。雖然人胰島素相比于動物胰島素有很多優(yōu)點，但是，在起效時間、峰值時間、作用持續(xù)時間上不能模擬生理性人胰島素分泌模式。需在餐前30分鐘注射、有較高的夜間低血糖風險。

20世紀90年代末，在對人胰島素結(jié)構(gòu)和成分的深入研究中發(fā)現(xiàn)，對肽鏈進行修飾：利用基因工程技術(shù)，改變胰島素肽鏈上某些部位的氨基酸組合；改變等電點；增加六聚體強度；以鈷離子替代鋅離子；在分子中增加脂肪酸鏈，加大與白蛋白的結(jié)合，均有可能改變其理化和生物學特征，從而可研制出更適合人體生理需要的胰島素類似物(insulinsimilitude)，也就是第三代胰島素。胰島素類似物可緊臨餐使用，也稱為餐時胰島素或速效胰島素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種穩(wěn)定性高的胰島素類似物。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種胰島素類似物，其a鏈和b鏈序列及結(jié)構(gòu)如下：

本發(fā)明還提供上述胰島素類似物的合成方法，包括以下步驟：

采用fmoc固相合成法，以樹脂作為固相載體，經(jīng)縮合劑活化，按照權(quán)利要求1所示的序列分別將a鏈和b鏈氨基酸由c端向n端逐個偶聯(lián)到樹脂上，且其中a鏈第11位cys由式1所示的二氨基二酸構(gòu)件單元所替換，待a鏈第11位二氨基二酸構(gòu)件單元耦合完后，由c端向n端繼續(xù)耦合直至a鏈第7位，待a鏈第7位耦合完后，先脫除alloc保護基團和fmoc保護基團，再令a鏈第11位二氨基二酸構(gòu)件單元與a鏈第7位氨基酸進行縮合成環(huán)，最后繼續(xù)耦合a鏈第5位以及余下的氨基酸；

最后經(jīng)切割液處理以及連接后，獲得所述胰島素類似物；

進一步地，合成a鏈所用的樹脂為rinkamamideresin，合成b鏈所用的樹脂為2-cl-trt-cl-resin。

進一步地，所述縮合劑選自hatu、hoat、pyaop中的任意一種或任意幾種。

進一步地，合成溫度為25℃。

進一步地，a鏈第21位氨基酸為fmoc-asp-o^tbu、第7位氨基酸為fmoc-cys(acm)-oh；b鏈第7位氨基酸為fmoc-cys(acm)-oh。

進一步地，alloc保護基團的脫除試劑為四(三苯基膦)鈀與苯硅烷的混合物。

進一步地，fmoc保護基團的脫除試劑為含有20vt％哌啶的dmf溶液。

進一步地，a鏈所用的切割液為三氟乙酸、苯酚、水、茴香硫醚、乙二硫醇的混合液；b鏈所用的切割液為三氟乙酸、水、tips、dtnp的混合液。

本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：

本發(fā)明胰島素類似物具有非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，通過在肽片段的合成中引入s-c鍵替換容易斷裂s-s鍵，不僅可以起到穩(wěn)固蛋白空間構(gòu)象的作用，也可以促進復性過程的剩余二硫鍵的配對提高整體復性效率。另外本發(fā)明方法操作簡便，收率高，獲得的胰島素類似物具有更好的穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1是本發(fā)明胰島素類似物的a鏈hplc色譜圖。

圖2是本發(fā)明胰島素類似物的b鏈hplc色譜圖。

圖3是本發(fā)明胰島素類似物的a鏈和b鏈兩步連接反應hplc色譜圖。

圖4是本發(fā)明胰島素類似物的a鏈和b鏈第一步連接產(chǎn)物hplc色譜圖。

圖5是本發(fā)明胰島素類似物的a鏈和b鏈最終連接產(chǎn)物hplc色譜圖。

圖6是本發(fā)明胰島素類似物的a鏈質(zhì)譜圖。

圖7是本發(fā)明胰島素類似物的b鏈質(zhì)譜圖。

圖8是本發(fā)明胰島素類似物的a鏈和b鏈第一步連接產(chǎn)物質(zhì)譜圖。

圖9是本發(fā)明胰島素類似物的a鏈和b鏈最終連接產(chǎn)物質(zhì)譜圖。

圖10是本發(fā)明胰島素類似物與天然胰島素的穩(wěn)定性比較圖。

具體實施方式

下面將參考附圖并結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明。

實施例1

二氨基二酸構(gòu)件單元的制備

反應式為：

具體步驟為：

化合物2：取6.01mg(25.0mmol)胱氨酸溶于10ml70％高氯酸中，然后緩慢加入62.5ml乙酸叔丁酯。反應過夜。反應結(jié)束后，加入水50ml，并將反應冰浴降溫。監(jiān)測反應結(jié)束后，用10m氫氧化鈉調(diào)節(jié)反應體系的ph到10，然后使用乙酸乙酯萃取有機相，再使用無水硫酸鈉干燥，最后將有機溶劑旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到白色顏色固體粉末。將固體粉末溶解于85ml四氫呋喃中，加入3.85ml(34.9mmol)n-甲基嗎啉。將反應體系置于冰水中降溫處理，緩慢加入11.75g(34.9mmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亞胺(fmoc-osu)。反應恢復至室溫過夜。結(jié)束反應后，首先使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋除溶劑，然后加入乙酸乙酯，并用水和飽和食鹽水清洗，再用無水硫酸鈉干燥有機相，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)溶劑，并使用硅膠柱分離純化。洗脫劑為7：3的正己烷：乙酸乙酯，得到10.69g(13.4mmol)白色固體產(chǎn)物2，產(chǎn)率為79％。比移值0.55(2：1的正己烷：乙酸乙酯)。

化合物3：在氮氣保護下將產(chǎn)物2溶解于45ml四氫呋喃溶液中,然后加入1.37ml(5.5mmol)三丁基膦。反應30分鐘后，加入4.5ml水，反應過夜處理。反應結(jié)束后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋除溶劑，再加入40ml*3乙酸乙酯，并用10％的檸檬酸和飽和食鹽水分別清洗有機相，最后使用無水硫酸鈉干燥后旋除溶劑。粗產(chǎn)品使用硅膠柱純化，洗脫劑為4:1的正己烷:乙酸乙酯，得到2.53g(6.33mmol)的無色油狀產(chǎn)物3，產(chǎn)率為86％。比移值0.45(4:1的正己烷:乙酸乙酯)。

化合物4：稱取1.01g(8.48mmol)高絲氨酸和0.90g(8.48mmol)碳酸氫鈉在氮氣保護下溶解于10ml水和5ml乙腈中，使用冰浴冷卻反應體系。再緩慢加入0.9ml(8.48mmol)氯甲酸烯丙酯。等反應體系恢復室溫繼續(xù)反應過夜。反應結(jié)束后旋除溶劑，得到的粗產(chǎn)品無需后處理純化。將粗產(chǎn)品溶解于dmf中，隨后加入0.71g(8.48mmol)的碳酸鈉，緩慢加入0.81ml(9.33mmol)的烯丙基溴，反應過夜。反應結(jié)束后使用乙酸乙酯萃取有機相，并使用水和飽和食鹽水清洗有機相，最后旋除有機相，并使用硅膠柱純化產(chǎn)物，洗脫劑1:1的正己烷:乙酸乙酯。比移值為0.39(1:1的正己烷:乙酸乙酯)。得到1.58g(6.50mmol)的無色油狀產(chǎn)物4，產(chǎn)率為77％。

化合物5：在氮氣保護下取4.00g(16.4mmol)化合物4和6.53g(19.7mmol)四溴化碳溶解于45ml二氯甲烷中，并將反應體系置于冰浴中降溫冷卻。然后將溶解于20ml的二氯甲烷中的5.17g(19.7mmol)的三苯基膦緩慢滴加。然后將反應體系恢復至室溫并繼續(xù)反應1小時。反應結(jié)束后，加入20ml二氯甲烷稀釋，并使用水和飽和食鹽水清洗有機相，然后使用無水硫酸鈉干燥有機相，之后再旋干有機溶劑。之后加入過量1:1的正己烷:乙酸乙酯使副產(chǎn)物三苯氧膦重結(jié)晶析出，濾除固體。液體有機相旋除并使用硅膠柱純化分離，洗脫劑為2:1的正己烷:乙酸乙酯。分離得到4.02g(13.1mmol)無色油狀液體5，產(chǎn)率為80％。

化合物6：在氮氣保護下將1.60g(4.01mmol)化合物3和1.29g(4.21mmol)化合物5溶解于20ml乙酸乙酯中，再加入5.17g(16.0mmol)的四丁基溴化胺溶解于0.5m碳酸氫鈉的水溶液，然后反應過夜。反應結(jié)束后加入乙酸乙酯稀釋，并加入水和飽和食鹽水清洗有機相，然后使用無水硫酸鈉干燥有機相，再將有機相旋干，并使用硅膠柱純化分離，洗脫劑為2:1的正己烷:乙酸乙酯。分離得到2.01g(3.36mmol)的無色油狀液體產(chǎn)物6，比移值為0.20(3:1的正己烷:乙酸乙酯)。

化合物1：取2.00g(3.20mmol)的化合物6溶解于16ml的二氯甲烷中，然后加入0.44ml(3.52mmol)的苯硅烷，隨后加入16ml三氟乙酸，反應在室溫下攪拌兩小時后旋除溶劑，然后溶解于1:1的苯:乙腈中，液氮冷卻并凍干得到1.72g(3.03mmol)的白色固體產(chǎn)物1，即為二氨基二酸構(gòu)件單元，產(chǎn)率為95％。

化合物2核磁共振-氫譜(cdcl3,400mhz)：7.75(d,4h,j＝7.6hz,ch),7.60(d,h,j＝7.6hz,ch),7.41-7.36(m,4h),7.30(t,4h,j＝7.2hz,ch),5.75(d,2h,j＝7.6hz,nh),4.59(dd,2h,j＝13.2hz,5.6hz,hα),4.38(app.q,4h,j＝18.0hz,10.4hz,och2),4.21(t,2h,j＝7.2hz,ch),3.27-3.17(m,4h,sch2),1.50(s,18h,tbu)。高分辨質(zhì)譜：hrms(es)calcdforc44h48n2o8s2na819.2746,found819.2744。

化合物3核磁共振-氫譜(cdcl3,400mhz)：7.77(d,2h,j＝7.5hz,ar-ch),7.62(d,2h,j＝7.0hz,ar-ch),7.41(t,2h,j＝7.5hz,ar-ch),7.33(m,2h,ar-ch),5.68(d,1h,j＝7.0hz,nh),4.58-4.52(m,1h,hα),4.46-4.38(m,2h,ch2),4.24(t,1h,j＝7.0hz,ch),3.05-2.88(m,2h,sch2),1.51(s,9h,tbu),1.35(t,1h,j＝9.0hz,sh)。高分辨質(zhì)譜：hrms(es)calcdforc22h25no4sna422.1396,found422.1396。

化合物4核磁共振-氫譜(cdcl3,400mhz)：5.94-5.86(m,2h),5.67(d,j＝7.3hz,1h),5.35-5.21(m,4h),4.65(d,j＝6.0hz,2h),4.60-4.53(m,3h),3.76-3.65(m,2h),2.64(bs,1h),2.20-2.14(m,1h),1.77-1.71(m,1h)。高分辨質(zhì)譜：calc.forc11h17no5na266.1004,found266.1008。

化合物5核磁共振-氫譜(cdcl3,400mhz)：5.95-5.85(m,2h),5.37-5.21(m,5h),4.65(dt,j＝5.6hz,1.2hz,2h),4.58(d,j＝5.6hz,2h),4.52(m,1h),3.44(t,j＝7.0hz,2h),2.48-2.41(m,1h),2.29-2.22(m,1h).高分辨質(zhì)譜：hrms(esi):calc.forc11h17brno4306.0341,found306.0339.

化合物6核磁共振-氫譜(cdcl3,400mhz)：7.76(d,j＝7.5hz,2h),7.61(d,j＝7.5hz,2h),7.40(t,j＝7.5hz,2h),7.32(t,j＝7.5hz,2h),5.94-5.85(m,2h),5.69(d,j＝7.3hz,1h),5.40(d,j＝7.1hz,1h),5.34-5.17(m,4h),4.63(d,j＝6.0hz,2h),4.59-4.46(m,4h),4.39(d,j＝7.0hz,2h),4.24(t,j＝7.0hz,1h),2.97(dq,j＝13.4hz,4.9hz,2h),2.65-2.60(m,2h),2.15-1.96(m,2h),1.49(s,9h).高分辨質(zhì)譜：hrms(esi):calc.forc33h41n2o8s625.2584,found625.2582.

化合物1核磁共振-氫譜(cdcl3,400mhz)：7.81(d,j＝7.5hz,2h),7.70(d,j＝7.5hz,2h),7.41(t,j＝7.5hz,2h),7.35-7.30(m,2h),5.98-5.90(m,2h),5.36-5.17(m,4h),4.63(m,2h),4.55(m,2h),4.43-4.33(m,4h),4.24(t,j＝7.0hz,1h),3.12-2.86(m,2h),2.74-2.60(m,2h),2.14-1.97(m,2h).高分辨質(zhì)譜：hrms(esi):calc.forc29h33n2o8s569.1958,found569.1957.

以上化合物已經(jīng)有人在文獻中有過報導，故其具體核磁及質(zhì)譜數(shù)據(jù)參照文獻：acschem.biol.2011,6,753–760。

實施例2

胰島素類似物的合成

所述胰島素類似物的a鏈和b鏈序列及結(jié)構(gòu)如下：

其中，a鏈的氨基酸序列如seqidno.1所示；b鏈的氨基酸序列如seqidno.2所示。

具體合成步驟為：

(1)a鏈和b鏈的合成

采用fmoc固相合成法，以樹脂作為固相載體，經(jīng)縮合劑活化，按照序列分別將a鏈和b鏈氨基酸由c端向n端逐個偶聯(lián)到樹脂上；

其中a鏈的反應式為：

a鏈的合成：稱取rinkamamideresin(0.1mmol)于固相合成管中，使用dmf/dcm混合溶劑(體積比為1:1)溶脹15min后，抽干，然后按照常溫的fmoc固相合成法合成上述胰島素類似物(0.4mmol氨基酸，0.38mmolhatu，0.4mmolhoat，0.8mmoldipea；反應時間為45min，反應溫度為25℃)，其中a鏈第11位cys由由化合物1，也即二氨基二酸構(gòu)件單元所替換，待a鏈第11位二氨基二酸構(gòu)件單元耦合完后，由c端向n端繼續(xù)耦合直至a鏈第7位，待a鏈第7位耦合完后，先采用四(三苯基膦)鈀與苯硅烷的混合物(摩爾比1:5)作為脫除試劑脫除alloc保護基團，采用含有20vt％哌啶的dmf溶液作為脫除試劑脫除fmoc保護基團，再令a鏈第11位二氨基二酸構(gòu)件單元與a鏈第7位氨基酸進行縮合成環(huán)，最后繼續(xù)耦合a鏈第5位以及余下的氨基酸，其中，a鏈第21位氨基酸為fmoc-asp-o^tbu、第7位氨基酸為fmoc-cys(acm)-oh，除二氨基二酸構(gòu)件單元及上述特殊氨基酸外，其他所用氨基酸均為普通fmoc保護的氨基酸。

b鏈的合成：稱取2-cl-trt-cl-resin(0.1mmol)于固相合成管中，使用dmf/dcm混合溶劑(體積比為1:1)溶脹15min后，抽干，然后按照常溫的fmoc固相合成法合成上述胰島素類似物(0.4mmol氨基酸，0.38mmolhatu，0.4mmolhoat，0.8mmoldipea；反應時間為45min，反應溫度為25℃)，其中b鏈按照序列將氨基酸由c端向n端逐個偶聯(lián)到樹脂上，b鏈第7位氨基酸為fmoc-cys(acm)-oh，其他所用氨基酸均為普通fmoc保護的氨基酸。

待所有的氨基酸耦合完后，用dmf，dcm，dmf各洗5次，加入含有哌啶(體積分數(shù)20％)的dmf溶液反應2次(2min，10min各一次)，脫除fmoc保護基。

肽鏈連接完成后，加入8ml切割試劑于多肽合成管內(nèi)，a鏈所述切割液為[v(tfa):v(苯酚):v(水):v(茴香硫醚):v(乙二硫醇)＝82.5:5:5:5:2.5]，b鏈所述切割液為[v(tfa):v(水):v(三異丙基硅烷,tips)＝93:5:2，400mgdtnp]反應2h，將多肽從樹脂上切下，并脫除側(cè)鏈保護基團，將切割液聚集于離心管中，用n2鼓泡，濃縮溶液，最后用冰乙醚沉淀，離心，得到粗肽(a鏈粗肽220mg，b鏈粗肽180mg)，使用半制備型hplc分離得到純肽(a鏈純肽32mg，b鏈純肽41mg)。

(2)a鏈和b鏈的連接

a鏈和b鏈的連接反應式如下：

具體步驟為：

分別取合成得到的6mg胰島素a-chain和9mgb-chain，混合溶解于3ml8mgnhcl,0.1mtrisbuffer。ph為8以上。監(jiān)測反應，15min反應即結(jié)束，待其反應完全之后加入5ml20mg碘的acoh溶液，30min后加入1ml0.1m的抗壞血酸淬滅反應。然后使用rp-hplc分離純化即可得到胰島素類似物6mg(兩步反應的分離產(chǎn)率40％)。

本發(fā)明胰島素類似物的a鏈和b鏈的色譜圖分別參見圖1和圖2，連接反應色譜圖參見圖3，第一步連接反應產(chǎn)物色譜圖參見圖4，最終產(chǎn)物胰島素類似物的色譜圖參見圖5，胰島素類似物的a-chain【hrms(esi):calc.for2434.74,found2433.70】、b-chain【hrms(esi):calc.for3655.19,found3654.82】、第一步連接反應產(chǎn)物a-bdimer【hrms(esi):calc.for5933.77,found5933.40】和最終產(chǎn)物胰島素類似物a(ch2-s)insulin【hrms(esi):calc.for5788.77,found5788.98】的質(zhì)譜圖分別參見圖6、圖7、圖8和圖9。

色譜圖1、圖2、圖4、圖5對應的物質(zhì)結(jié)構(gòu)分別對應a鏈和b鏈的連接反應式中的四個物質(zhì)結(jié)構(gòu)，即a-chain、b-chain、a-bdimer、a(ch2-s)insulin。

色譜圖3為a鏈和b鏈的連接反應的反應物和產(chǎn)物色譜檢測對比圖。

質(zhì)譜圖6、圖7、圖8和圖9對應的物質(zhì)結(jié)構(gòu)分別對應a鏈和b鏈的連接反應式中的四個物質(zhì)結(jié)構(gòu)，即a-chain、b-chain、a-bdimer、a(ch2-s)insulin。

實施例3

胰島素類似物熱穩(wěn)定性試驗

分別取天然胰島素和本發(fā)明胰島素類似物100ug溶解于1ml水中，調(diào)ph為2溶解完全后將反應液置于60攝氏度恒溫浴中。然后在0h、3h、6h、20h、24h、48h、72h分別取樣100ul進hplc分析c18柱分析。然后取剩余原料峰面積占零時刻原料峰面積百分比。最終數(shù)據(jù)整理后見圖10。

由圖10可見，對比天然胰島素10h左右即降解50％，本發(fā)明胰島素類似物需要近50h才會降解50％。由此可見該胰島素類似物相比于天然胰島素熱穩(wěn)定性有明顯提高。因此可見，本發(fā)明得到的胰島素類似物是熱力學更加穩(wěn)定的產(chǎn)物。

應當理解本文所述的例子和實施方式僅為了說明，并不用于限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)它做出各種修改或變化，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

sequencelisting

序列表：

<110>中國科學技術(shù)大學先進技術(shù)研究院

<120>一種胰島素類似物及其合成方法

<130>1

<160>2

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>38

<212>prt

<213>odonthobuthusdoriae

<400>1

glyilevalgluglncyscysthrserilecysserleutyrglnleu

151015

gluasntyrcysasn

20

<210>2

<211>38

<212>prt

<213>odonthobuthusdoriae

<400>1

phevalasnglnhisleucysglyserhisleuvalglualaleutyr

151015

leuvalcysglygluargglyphephetyrthrprolysthr

202530