本發(fā)明涉及糖尿病治療領(lǐng)域的一類長效化艾塞那肽(exendin-4)類似物及其應用。
背景技術(shù)：
糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病之后第三大嚴重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病。目前，全球約有3億糖尿病患者，預計到2025年將增加至5億。臨床上采用胰島素強化治療的方法來延緩糖尿病進程，但是注射胰島素會有低血糖的風險。治療效果受到劑量、注射部位、注射途徑等因素的影響，且個體差異較大，使用胰島素稍有不慎，就會出現(xiàn)嚴重的低血糖副作用。
胰高血糖素樣肽-1(glp-1)是一種葡萄糖依賴性腸促降血糖多肽激素，glp-1刺激胰島素分泌而不出現(xiàn)低血糖，這種葡萄糖依賴性的促胰島素分泌特性，避免了糖尿病治療中常存在的低血糖危險。因此，glp-1作為一種2型糖尿病治療藥物具有廣闊的開發(fā)前景。
但是天然glp-1在治療糖尿病上具有諸多優(yōu)點，例如，它在體內(nèi)易被二肽基肽酶iv(dpp-iv)快速降解。dpp-iv可特異性識別glp-1的n末端8位丙氨酸(ala)殘基，從肽鏈n末端8位丙氨酸(ala)處切除二肽，使其轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的形式，其體內(nèi)半衰期僅5min左右。glp-1肽鏈n末端是與glp-1受體的結(jié)合部位，若其組氨酸殘基喪失，將導致glp-1完全失去生物活性。目前普遍使用的延長glp-1體內(nèi)半衰期的修飾策略主要是對8位進行修飾，使得glp-1能抵抗dpp-iv酶的降解，另外，將glp-1肽鏈n端8位和9位的氨基酸互換也可以達到此目的。艾塞那肽(exendin-4)是減少dpp-iv酶代謝的典型短效glp-1受體激動劑。然而，由于glp-1會被腎臟快速濾過消除，抵抗dpp-iv酶的降解只能一定程度地延長glp-1的半衰期。
本專利中，在glp-1受體強效激動劑艾塞那肽的基礎上，采用課題組首創(chuàng)的半胱氨酸-馬來酰亞胺綴合策略，設計合成了一類艾塞那肽類似物。該策略通過半胱氨酸的巰基與馬來酰亞胺發(fā)生邁克爾加成反應來方便高效地引入小分子基團，可避免在早期glp-1受體長效化激動劑的研發(fā)過程中，采用賴氨酸作為小分子基團連接臂所引起的選擇性差、反應不方便等問題。引入的雙香豆素小分子基團具有較高的血清白蛋白結(jié)合率，可增強綴合物與血清白蛋白的結(jié)合，很大程度地延長了化合物的半衰期，并可減少化合物的腎臟快速濾過和代謝失活，因而此類化合物的半衰期及體內(nèi)降糖作用時間顯著延長。
同時，本專利中，將雙香豆素小分子末端的酰胺鍵進行翻轉(zhuǎn)后，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，化合物與白蛋白的結(jié)合率大大的提高，使得化合物擁有更長的半衰期，因此能夠減少病人多次注射給藥的痛苦，提高病人依從性，是2型糖尿病治療領(lǐng)域中極具發(fā)展前景的藥物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及一類艾塞那肽類似物，其序列為：
his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-化學修飾的cys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2；或his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-化學修飾的cys-nh2；或his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-化學修飾的cys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-tyr-ile-gln-trp-leu-lys-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly-arg-pro-pro-pro-ser-nh2；或his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-tyr-ile-gln-trp-leu-lys-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly-arg-pro-pro-pro-ser-化學修飾的cys-nh2；
其中化學修飾的cys結(jié)構(gòu)為：
n取目0～20。
本發(fā)明的優(yōu)選方案，其特征是，氨基酸序列為：
his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-化學修飾的cys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-nh2；或his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-化學修飾的cys-nh2；或his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-化學修飾的cys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-tyr-ile-gln-trp-leu-lys-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly-arg-pro-pro-pro-ser-nh2；或his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-tyr-ile-gln-trp-leu-lys-glu-gly-gly-pro-ser-ser-gly-arg-pro-pro-pro-ser-化學修飾的cys-nh2；
其中化學修飾的cys結(jié)構(gòu)為：
n取自11～16。
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的艾塞那肽類似物：
在一個實施方案中，本發(fā)明涉及具有如下序列的艾塞那肽類似物：
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包括治療有效量的至少一種上述化合物和其藥學上可接受的鹽，或藥學上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明進一步提供了上述化合物和其藥學上可接受的鹽，或藥學上可接受的載體或稀釋劑在制備用于糖尿病的藥物中的運用。
本發(fā)明提供的上述化合物具有顯著的降糖效果，而且化學性質(zhì)穩(wěn)定，部分的化合物的降糖作用維持時間達到了60h以上，較內(nèi)源性glp-1(半衰期2～3min)或上市藥物艾塞那肽(半衰期2.4h)有顯著的提高。同時，還可避免藥劑學長效化方法所引起的局部瘙癢等不良反應。
本發(fā)明還提供了上述化合物的制備方法，本發(fā)明采用固相合成策略高效快速地合成得到上述目標化合物。
以下是本發(fā)明中涉及的艾塞那肽類似物的體內(nèi)降糖藥理實驗方法以及結(jié)果：
(1)艾塞那肽類似物的白蛋白結(jié)合率實驗
蛋白透析袋在使用前用開水煮沸活化30min，配制濃度為35mg/ml的人血清白蛋白pbs溶液以及0.11mg/ml的多肽pbs溶液，向活化后的透析袋中加入2ml人血清白蛋白pbs溶液并進行封閉，然后將其完全浸沒在含有20ml多肽pbs溶液中，整個體系置于37℃的水浴中孵育24h。孵育后，由于分子量小于8000的多肽分子可透過透析袋而白蛋白不能，游離多肽衍生物將在透析袋兩側(cè)達到平衡，取樣進行uplc-ms/ms檢測，計算達到平衡時的多肽濃度以及人體血清白蛋白結(jié)合率。
表1艾塞那肽類似物的白蛋白結(jié)合率
resultsareexpressedasmean±sd，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vssaline.
如表1所示，綴合雙香豆素小分子后，與上市藥物艾塞那肽和利拉魯肽相比，所有化合物的血清白蛋白結(jié)合率總體出現(xiàn)不同程度的提高。酰胺鍵翻轉(zhuǎn)后，與化合物seq.idno：5相比，化合物seq.idno：1的血清白蛋白結(jié)合率都有顯著的提高，最大可提升18％。
(2)艾塞那肽類似物的腹腔葡萄糖耐量實驗
正常昆明小鼠，隨機分組，每組8只，小鼠飼養(yǎng)在標準化動物房中。實驗前12小時禁食，只給予飲水。每組小鼠在給藥前，測初始血糖值，定為-30min，然后腹腔注射25nmol/kg的艾塞那肽或艾塞那肽類似物。30min后，腹腔注射18mmol/kg的葡萄糖溶液，定為0min。在0，15，30，60，90，120min用血糖儀測定血糖水平，檢測艾塞那肽類似物的降糖活性。
表2艾塞那肽類似物的腹腔葡萄糖耐量實驗結(jié)果
resultsareexpressedasmean±sd，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vssaline.
如表2所示，降血糖實驗結(jié)果表明，本發(fā)明中涉及的艾塞那肽類似物的降血糖效果與艾塞那肽相當。
(3)艾塞那肽類似物的隔日降血糖實驗
正常昆明小鼠，分為8組，每組6只，小鼠飼養(yǎng)在標準化動物房中。實驗開始時，提前24h給予exendin-4及艾塞那肽類似物，對照組注射生理鹽水。正常飲食飲水12h后，禁食12h。然后進行小鼠單次腹腔葡萄糖耐量實驗。各組小鼠腹腔注射18mmol/kg的葡萄糖溶液，注射葡萄糖時間定為0min，在0、15、30、45、60和120min用血糖儀測定血糖水平。
表3艾塞那肽類似物的隔日降血糖效應
resultsareexpressedasmean±sd，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vssaline.
如表3所示，降血糖實驗結(jié)果顯示，在體內(nèi)代謝24h后仍然具有降低血糖作用，而艾塞那肽早已失去活性。說明修飾后得到的艾塞那肽類似物的生物半衰期都顯著延長，達到了30h以上。
(4)艾塞那肽類似物的不禁食降糖實驗
測定stz誘導的糖尿病模型小鼠的血糖，選擇血糖數(shù)值高于20mmol/l的小鼠進行隨機分組，每組六只，實驗期間小鼠自由采食。陽性對照組腹腔注射艾塞那肽或利拉魯肽，劑量為50nmol/kg，陰性對照組腹腔注射生理鹽水，給藥組分別注射50nmol/kg的艾塞那肽類似物。0h給予化合物，分別在0、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24、36、48、60、72和84h使用血糖儀測定血糖水平。評價指標為腹腔注射化合物后，小鼠血糖數(shù)值低于8.35mmol/l的時間。
表4艾塞那肽類似物不禁食降糖實驗
resultsareexpressedasmean±sd，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vssaline.
由表4可見，在給藥劑量為50nmol/kg時，seq.idno：1穩(wěn)定血糖的時間可達66.9h，seq.idno：2穩(wěn)定血糖的時間也達到了62.5h，高于利拉魯肽的12.7h或艾塞那肽的5.4h，酰胺鍵翻轉(zhuǎn)前的化合物seq.idno：5僅有55.2h。不禁食給藥實驗表明，酰胺鍵翻轉(zhuǎn)后的雙香豆素綴合物具有良好的長效化降糖效果，可以達到更優(yōu)的長效化降糖效果，具有開發(fā)成為每周給藥2次的降糖藥物的潛力。
本發(fā)明的優(yōu)點在于：
1.、提出的一種長效化艾塞那肽類似物，將雙香豆素小分子末端的酰胺鍵進行翻轉(zhuǎn)后，出乎意料地發(fā)現(xiàn)，化合物與白蛋白的結(jié)合率大大的提高。
2、提出的一種長效化艾塞那肽類似物，具有出色的長效化降血糖作用，降糖作用維持時間高達60h以上，較每天給藥一次的利拉魯肽相比顯著延長，該類長效化艾塞那肽類似物具有較好的成藥性，能夠減少病人多次給藥的痛苦，是現(xiàn)有的新化學實體中較具發(fā)展前景的藥物。
3、提出的一種長效化艾塞那肽類似物，收率高、合成周期短、粗品純化容易，生產(chǎn)成本低、易于工業(yè)自動化生產(chǎn)。
綜上所述，本發(fā)明提供的艾塞那肽類似物，結(jié)構(gòu)全新，比內(nèi)源性glp-1更加穩(wěn)定，與上市藥物利拉魯肽相比，白蛋白結(jié)合率更高，降血糖作用時間更長，適合作為糖尿病治療藥物的新型活性成分，給糖尿病治療領(lǐng)域帶來新的突破。
具體實施方式
在本說明書全文中采用以下縮寫：
ala：丙氨酸；arg：精氨酸；asn：天冬酰胺；asp：天門冬氨酸；dcm：二氯甲烷；dic：n，n’-二異丙基碳二亞胺；diea：n，n′-二異丙基乙胺；dmap：4-二甲氨基吡啶；dmf：二甲基甲酰胺；dmso：二甲亞砜；edc.hcl：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽；esi-ms：電噴霧質(zhì)譜；et3n：三乙胺；fmoc：n-9-芴甲氧羰基；gln：谷氨酰胺；glu：谷氨酸；gly：甘氨酸；hbtu：苯并三氮唑-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸酯；his：組氨酸；hobt：1-羥基-苯并三氮唑；hplc：高效液相色譜；ile：異亮氨酸；leu：亮氨酸；lys：賴氨酸；met：甲硫氨酸；nmp：n-甲基吡咯烷酮；phe：苯丙氨酸；pro：脯氨酸；ser：絲氨酸；thr：蘇氨酸；trp：色氨酸；tyr：酪氨酸；val：纈氨酸。
本發(fā)明是通過下列實施例來進行說明的，但這些實施例不做任何限制本發(fā)明的解釋。
實施例1
的固相合成。
1、半胱氨酸改構(gòu)多肽肽鏈的合成
1.1、樹脂的溶脹
稱取fmoc-rinkamide-mbharesin50mg(取代度0.4mmol/g)，經(jīng)dcm7ml溶脹30min，抽濾去dcm，再用nmp10ml溶脹30min，最后分別用nmp，dcm，nmp7ml沖洗干凈。
1.2、fmoc保護基的脫除
將溶脹好的樹脂放入反應器中，加入含0.1mhobt的25％哌啶/nmp(v/v)溶液7ml，反應1min，結(jié)束后濾去溶液；再加入含0.1mhobt的25％哌啶/nmp(v/v)溶液7ml，反應4min，結(jié)束后濾去溶液，用nmp洗滌干凈。得到脫去初始連接的fmoc保護基的樹脂。
1.3、fmoc-ser(tbu)-rinkamide-mbharesin的合成
將fmoc-ser(tbu)-oh(15.3mg，0.04mmol)，hbtu(15.1mg，0.04mmol)，hobt(5.4mg，0.04mmol)和dipea(13.9μl，0.08mmol)溶于nmp10ml中，再將此溶液加入步驟1.1得到的樹脂中，反應7min，結(jié)束后濾去反應液，用dcm和nmp各7ml洗滌樹脂3次。
1.4、偶合效率的檢測
取少量樹脂顆粒dmf洗滌，放入透明小瓶中加入3滴1％的溴酚藍溶液，常溫振搖3分鐘，樹脂顯藍色即為陽性，透明為陰性。若為陰性才可進入下一個偶合循環(huán)。
1.5、肽鏈的延長
按照肽鏈的序列，重復上述脫保護和偶合的步驟依次連接上相應的氨基酸，依次連接上相應的氨基酸直至肽鏈合成完畢，得到連有多肽鏈的樹脂。
1.6、樹脂上多肽的裂解
將上述得到的連有多肽鏈的樹脂放入反應瓶中，加入裂解劑reagentk(tfa/苯甲硫醚/水/苯酚/edt，82.5∶5∶5∶5∶2.5，v/v)10ml，先在0℃下振搖30min，再在常溫下反應3h。反應結(jié)束后抽濾，加少量tfa和dcm洗滌三次，合并濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標多肽的粗品。最終得到化合物的粗品36.7mg，收率為88.2％。
2、化學修飾基的合成
3，3’-(4-羧基苯亞甲基)-二-4-羥基香豆素的合成
對羧基苯甲醛(0.45g，3mmol)溶解于無水乙醇20ml，然后加入4-羥基香豆素(0.98g，6mmol)。加熱回流12h后，反應液冷卻至室溫后過濾，濾餅使用乙醇10ml洗3次，即得產(chǎn)品1.09g，收率80.1％，ms(esi，m/z)：456.4[m+h]+.
(12-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1h-吡咯-1-基)十二烷基)氨基甲酸叔丁酯的合成
將n-boc-十二烷基二胺(1.2g，4mmol)與馬來酸酐(0.49g，4.8mmol)溶于冰醋酸中，120℃加熱反應6h，薄層板檢測反應完全后，將反應液冷卻至室溫，倒入水中，用乙酸乙酯萃取(3×20ml)，合并上層萃取液，萃取液使用飽和食鹽水洗3次，無水na2so4干燥過夜。將萃取液減壓濃縮，得到的粗品經(jīng)柱層析純化得淡黃色純品1.15g，產(chǎn)率75.2％，ms(esi，m/z)：380.5[m+h]+.
4-(雙(4-羥基-2-氧代-2h-色烯-3-基)甲基)-n-(12-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1h-吡咯-1-基)十二烷基)苯甲酰胺的合成
(12-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1h-吡咯-1-基)十二烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.76g，2mmol)用hcl飽和的乙酸乙酯溶解，攪拌3h后減壓蒸餾去除溶劑，dcm復溶，加入3，3’-(4-羧基苯亞甲基)-二-4-羥基香豆素(0.91g，2mmol)、dic(0.30g，2.4mmol)和hobt(0.32g，2.4mmol)，室溫攪拌過夜。薄層板檢測反應結(jié)束后將反應液倒入水中并用乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，分別用飽和k2co3溶液，hcl1m，飽和食鹽水洗三次。萃取液加入無水na2so4干燥過夜，減壓濃縮，得粗品，柱層析純化得純品1.00g，收率70.1％。ms(esi，m/z)：719.4[m+h]+.
3、化學修飾的cys12-艾塞那肽綴合物的合成與純化
將上步得到的4-(雙(4-羥基-2-氧代-2h-色烯-3-基)甲基)-n-(12-(2，5-二氧代-2，5-二氫-1h-吡咯-1-基)十二烷基)苯甲酰胺用dmso溶解配成約10mg/ml的溶液，將cys替換的改構(gòu)艾塞那肽多肽類似物也溶解于dmso，兩者混合后室溫下攪拌反應，加入20μldiepa以加快反應進行，使用lc-ms監(jiān)測反應情況。色譜條件為：c18反相柱(1.7μm2.1×50mm，waters)；流動相a：0.1％甲酸/水(v/v)，流動相b：0.1％甲酸/乙腈(v/v)，流動相梯度：流動相b10％～90％，2min，b90％～90％，3min；流速為0.3ml/min；紫外檢測波長為214nm。反應結(jié)束后，反應液使用含有1％三氟乙酸的乙腈稀釋后高速離心并使用0.45μm的微孔濾膜過濾后，使用制備液相色譜進行純化，色譜條件為：c18反相柱(320mm×28mm，5μm)；流動相a：0.1％三氟醋酸/水(v/v)，流動相b：0.1％三氟醋酸/乙腈(v/v)；流動相梯度：流動相b40％～80％，30min；80％～85％，10min；85％～95％，10min；95％～40％，10min；流速為5ml/min，檢測波長為214nm。收集溶液，減壓濃縮去除乙腈，凍干即得純品。理論相對分子質(zhì)量為4881.0。esi-msm/z：calcd.[m+3h]3+1628.0，[m+4h]4+1221.3；found[m+3h]3+1628.6，[m+4h]4+1221.5。
實施例2
合成方法同實施例1，理論相對分子質(zhì)量為5009.2。esi-msm/z：calcd.[m+3h]3+1670.7，[m+4h]4+1253.3；found[m+3h]3+1670.4，[m+4h]4+1253.2。
實施例3
合成方法同實施例1，理論相對分子質(zhì)量為4996.1。esi-msm/z：calcd.[m+3h]3+1666.4，[m+4h]4+1250.0；found[m+3h]3+1666.6，[m+4h]4+1250.1。
實施例4
合成方法同實施例1，理論相對分子質(zhì)量為5124.3。esi-msm/z：calcd.[m+3h]3+1709.1，[m+4h]4+1282.1；found[m+3h]3+1709.5，[m+4h]4+1282.1。