本發(fā)明屬于生物檢測領域，特別涉及微流控芯片領域，具體涉及多重核酸擴增產物的單熒光通道檢測。
背景技術：
：微流控技術是一種通過微管道及微腔體等結構來控制微流體完成生化反應的一種技術。目前被廣泛應用于組織，細胞，核酸，蛋白及小分子的相關研究中。目前對多個核酸目標的檢測常需要用到多重擴增技術，但往往需要帶有不同熒光標記的探針或者引物來檢測不同的產物，這就需要配套的檢測儀器含有多路熒光檢測的本領，使得儀器結構更加復雜，成本變高。技術實現要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種用于多重核酸擴增產物熒光檢測的微流控芯片。本發(fā)明提供的微流控芯片包括多個操作單元，每個所述操作單元包括加樣孔、擴增腔室、虹吸管道、預分配室、檢測腔室、廢液腔和自通氣管道；所述預分配室和所述檢測腔室的體積相同；所述擴增腔室與所述加樣孔連接，所述擴增腔室遠離旋轉中心一端依次經所述虹吸管道和所述緩沖管道與所述預分配室連接；所述預分配室設置多個，多個所述預分配室通過緩沖管道連通，且多個所述預分配室與緩沖管道的連接處距離旋轉中心的長度根據進樣的先后順序依次增大；將距離旋轉中心的長度最大的所述預分配室設置為廢液腔；除所述廢液腔以外的每個所述預分配室下方均設置有檢測腔室；所述廢液腔還與所述自通氣管道一端連接，所述自通氣管道另一端與所述擴增腔室靠近旋轉中心一側連接；全封閉的所述微流控芯片中的氣體通過所述自通氣管道進行自循環(huán)。上述微流控芯片中，所述微流控芯片還包括第一界面閥、第二界面閥和第三界面閥；所述虹吸管道上設置有所述第一界面閥，所述第一界面閥與旋轉中心之間的距離大于所述擴增腔室與旋轉中心的最小距離；每個所述預分配室下方均通過所述第二界面閥與所述檢測腔室連接；位于所述擴增腔室上方的自通氣管道上設置有所述第三界面閥。上述微流控芯片中，所述虹吸管道親水化修飾。在本發(fā)明的具體實施例中，所述虹吸管道用2％(體積分數)吐溫20溶液(溶劑為酒精)進行親水修飾。上述微流控芯片中，所述第一界面閥和所述第三界面閥表面疏水化修飾。在本發(fā)明的具體實施例中，所述第一界面閥和所述第三界面閥用氟化液fc-1700(3m公司)進行疏水修飾。上述微流控芯片中，所述預分配室與緩沖管道的連接處距離旋轉中心的最大長度與最小長度之差為3mm-9mm。上述微流控芯片中，所述微流控芯片是由高分子聚合物、玻璃、硅和金屬材料中的一種或多種制成，所述高分子聚合物具體為聚甲基丙烯酸甲酯或聚丙烯或聚碳酸酯。在本發(fā)明的具體實施例中，所述微流控芯片是由聚甲基丙烯酸甲酯通過注塑、熱壓、鍵合和粘接等方式封裝而成。上述微流控芯片中，所述操作單位的個數為2個。上述微流控芯片中，每個所述操作單元的所述檢測腔室和預分配室的個數均為7個。上述微流控芯片中，所述微流控芯片為圓形。上述微流控芯片中，所述預分配室與所述緩沖管道的連接處距離旋轉中心的最大長度與最小長度之差為3mm。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測多重核酸擴增產物的方法。本發(fā)明提供的檢測多重核酸擴增產物的方法包括如下步驟：將多重核酸擴增產物分成若干份，每份與相應的熒光探針雜交，根據熒光強度對所述多重核酸擴增產物進行定性或定量判定；其中每份對應的熒光探針序列不同但熒光基團相同。上述方法中，所述方法包括如下步驟：(1)將多重核酸擴增體系通過上述微流控芯片上的加樣孔加入到所述微流控芯片的擴增腔室內，得到待反應的芯片，將所述待反應的芯片進行多重擴增反應，得到反應后芯片；所述反應后芯片的擴增腔室中含有多重核酸擴增產物；(2)將所述反應后芯片進行第一次離心，通過離心作用，使所述多重核酸擴增產物突破所述微流控芯片的第一界面閥；然后進行第二次離心，通過毛細作用，使所述多重核酸擴增產物填滿所述微流控芯片的虹吸管道；然后進行第三次離心，通過虹吸作用，使所述多重核酸擴增產物依次填滿所述微流控芯片的預分配室；然后進行第四次離心，通過離心作用使所述預分配室內的多重核酸擴增產物突破所述微流控芯片的第二界面閥，進入到所述微流控芯片的檢測腔室內，分別與每個所述檢測腔室中預點樣的熒光探針雜交，得到雜交后芯片；所述第一次離心的轉速和所述第三次離心的轉速高于第二次離心的轉速，所述第四次離心的轉速高于所述第三次離心的轉速；每個所述檢測腔室中預點樣的熒光探針中的熒光基團相同；(3)檢測所述雜交后芯片中的每個檢測腔室的熒光強度，實現對所述多重核酸擴增產物的熒光檢測。上述方法中，步驟(2)的方法為如下(a1)或(a2)：(a1)將所述反應后芯片進行第一次離心，通過離心作用，使所述多重核酸擴增產物突破所述微流控芯片的第一界面閥；然后停止離心，通過毛細作用，使所述多重核酸擴增產物填滿所述微流控芯片的虹吸管道；然后再次離心，通過虹吸作用，使所述多重核酸擴增產物依次填滿所述微流控芯片的預分配室；然后提高轉速，通過離心作用使所述預分配室內的多重核酸擴增產物突破所述微流控芯片的第二界面閥，進入到所述微流控芯片的檢測腔室內，分別與每個所述檢測腔室中預點樣的熒光探針雜交，得到雜交后芯片；(a2)將所述反應后芯片進行第一次離心，通過離心作用，使所述多重核酸擴增產物突破所述微流控芯片的第一界面閥；然后降低轉速，通過毛細作用，使所述多重核酸擴增產物填滿所述微流控芯片的虹吸管道；然后提高轉速，通過虹吸作用，使所述多重核酸擴增產物依次填滿所述微流控芯片的預分配室；然后再次提高轉速，通過離心作用使所述預分配室內的多重核酸擴增產物突破所述微流控芯片的第二界面閥，進入到所述微流控芯片的檢測腔室內，分別與每個所述檢測腔室中預點樣的熒光探針雜交，得到雜交后芯片。上述方法中，所述第一次離心的條件為4000-6000rpm/min離心至少10s；所述第二次離心的條件為0-100rpm/min離心至少10s；當轉速為0rpm/min時，即為停止離心；所述第三次離心的條件為1000-2000rpm/min離心至少30s；所述第四次離心的條件為4000-6000rpm/min離心至少10s。上述方法中，所述第一次離心的條件為4000rpm/min離心10s；所述第二次離心的條件為100rpm/min離心10s；所述第三次離心的條件為1000rpm/min離心30s；所述第四次離心的條件為4000rpm/min離心10s。上述方法中，每個所述檢測腔室中預點樣的熒光探針中的熒光基團均為fam。本發(fā)明的最后一個目的是提供上述方法的新用途。本發(fā)明提供了上述方法在多重核酸擴增產物的單熒光通道檢測中的應用。本發(fā)明提供了一種用于多重核酸擴增產物熒光檢測的微流控芯片，該芯片具有加樣孔，擴增腔室，虹吸管道，第一界面閥，預分配室，第二界面閥，檢測腔室，廢液腔，自通氣管道和第三界面閥，并基于該芯片提供了一種多重核酸擴增產物的檢測方法。本發(fā)明提供的芯片能夠在離心的作用下，將多重擴增的產物均勻分配至不同的檢測腔室內，檢測腔室內含有預點樣的特異性探針，能夠用單重熒光通道檢測多重擴增產物，大大簡化了檢測儀器的熒光通道數量和常規(guī)多重pcr需用多重熒光通道檢測不同產物的方式。附圖說明圖1為實施例1中的芯片示意圖。圖2為實施例1中的芯片使用示意圖。圖2(a)為加入多重擴增反應體系，并進行擴增，圖2(b)為樣品在離心離心力的作用下突破界面閥，并且停止離心或降低轉速后，在毛細作用下，擴增產物溶液填滿虹吸管道，圖2(c)為在離心的作用下，產生虹吸，并依次填滿預分配室，圖2(d)為在離心的作用下，液體突破界面閥并進入到檢測腔室，和預點樣在里面的特異性探針結合，用于熒光檢測。圖3為實施例2中的熒光檢測結果。圖3(a)為檢測樣品的熒光檢測結果，圖3(b)為陰性對照的熒光檢測結果。圖4為芯片的完整示意圖。圖5為芯片與離心裝置的結合圖。圖5a為離心裝置與芯片結合的卡口；5b為芯片的實物圖；5c為芯片與離心裝置的結合圖。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、一種用于多重核酸擴增產物熒光檢測的微流控芯片1、微流控芯片的設計要求本發(fā)明為了實現多重擴增產物的單一熒光檢測，芯片的設計需要滿足如下要求：1)供多重核酸擴增的腔室：將多重核酸擴增體系加入到芯片上的擴增腔室內進行擴增；2)多重擴增產物的均勻分配：通過結構的設計，將產物均勻分配至不同的檢測腔室內；3)產物的檢測：每個檢測腔室內預點樣一種特定產物的探針，通過檢測孔的空間位置來區(qū)分不同的產物，通過每個檢測孔的熒光信號來定性或定量檢測擴增產物。2、本發(fā)明設計的微流控芯片本發(fā)明設計的滿足上述要求的試樣分析芯片具有如下操作單元：一個供多重擴增的反應腔，一些流體操控結構和檢測腔，芯片流體通過離心的方式操控。具體包括如下各組成部分(圖1)：加樣孔301，擴增腔室302，虹吸管道303，第一界面閥304，預分配室305，第二界面閥306，檢測腔室307，廢液腔308，自通氣管道309，第三界面閥310和緩沖管道311。在本發(fā)明提供的具體實施例中，擴增腔室302采用圓形結構，該芯片擴增腔室302與加樣孔301連接，擴增腔室302遠離旋轉中心一端與虹吸管道303一端連接；虹吸管道303另一端經緩沖管道311與預分配室305連接，位于虹吸管道303上設置有第一界面閥304，且虹吸管道親水化修飾；為了保證在擴增反應進行的過程中，液體不會通過毛細作用填滿虹吸管道303和進入預分配室305，第一界面閥304與旋轉中心之間的距離大于擴增腔室302與旋轉中心的最小距離，且表面疏水化修飾。預分配室305采用多個，多個預分配室305頂部通過緩沖管道311連通，且多個預分配室305與緩沖管道311的連接處距離旋轉中心的長度根據進樣的先后順序依次增大；將距離與旋轉中心最大的預分配室305設置為用于收集多余擴增產物的廢液腔308。除了廢液腔308以外的各預分配室305下方均通過第二界面閥306與檢測腔室307連接。廢液腔308還與自通氣管道309一端連接，自通氣管道309另一端與擴增腔室302靠近旋轉中心一側連接，位于擴增腔室302上方的自通氣管道309上設置有第三界面閥310；全封閉的微流控芯片中的氣體通過自通氣管道309進行自循環(huán)。其中，預分配室305與緩沖管道311的連接處距離旋轉中心的最大長度與最小長度之差為3mm～9mm；在本實施例中，預分配室305與緩沖管道311的連接處距離旋轉中心的最大長度與最小長度之差優(yōu)選為3mm。本發(fā)明提供的芯片的大小和每張芯片的操作單元數均可根據不同的需求改變。具體的，在本發(fā)明提供的具體實施例中，芯片半徑為5.5cm，含有2個操作單元(圖4)。每個操作單元中的擴增腔室的形狀、體積，檢測腔室和預分配室的形狀、體積及檢測腔室的個數也均可根據不同的需求改變。具體的，在本發(fā)明提供的具體實施例中，擴增腔室的體積為80μl，預分配室305和檢測腔室307的體積相同，均為10μl。預分配室和檢測腔室的個數均為7個。本發(fā)明提供的芯片的材料是聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯、聚碳酸酯等高分子聚合物或玻璃、硅、金屬材料中的一種或多種制成。在本發(fā)明提供的具體實施例中，芯片的材料是聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)。本發(fā)明提供的芯片是通過注塑，熱壓，鍵合和粘接等方式封裝而成。3、本發(fā)明設計的微流控芯片的使用方法本發(fā)明設計的微流控芯片的使用方法具體如下：將多重核酸擴增體系通過加樣孔301加入到芯片上的擴增腔室內302進行多重擴增反應，得到多重核酸擴增產物。多重擴增反應可以為鏈式聚合酶反應(pcr)、環(huán)介導恒溫擴增(lamp)和滾環(huán)擴增(rca)等恒溫擴增。在擴增反應中，多重核酸擴增產物會被第一界面閥304阻擋。在擴增腔室302中完成擴增反應后，通過離心作用，多重核酸擴增產物會突破第一界面閥304；當離心停止或者降低轉速后，通過毛細作用，多重核酸擴增產物會填滿虹吸管道303；再次離心，通過虹吸作用，多重核酸擴增產物會依次填滿預分配室305；再次加大離心力，通過離心作用，預分配室305內的多重核酸擴增產物會突破第二界面閥306，進入到檢測腔室307內，每個檢測腔室307中含有一種預點樣的特定的熒光探針，孵育一定時間后，可對檢測腔室307內多重核酸擴增產物進行定量或定性熒光檢測。熒光探針為序列特異性探針，例如分子信標(mb)，熒光基團和猝滅基團為常用的適用于分子信標的分子對。本發(fā)明的芯片使用示意圖如圖2所示。實施例2、用于多重核酸擴增產物熒光檢測的微流控芯片在細菌檢測中的應用采用實施例1中用于多重核酸擴增產物熒光檢測的微流控芯片(圖4)及多重核酸擴增產物熒光檢測的方法對沙門氏菌(sa，atcc35640)、單增李斯特菌(lm，atcc7644)和大腸桿菌o157:h7(atcc12900)進行檢測。具體步驟如下：一、檢測前實驗材料準備1、多重pcr體系的建立多重pcr體系的建立方法參照文獻“李金峰，三種食源性致病菌的多重實時pcr檢測研究。華中農業(yè)大學碩士畢業(yè)論文，2008.”，與文獻中的區(qū)別為分子信標的熒光基團均為fam。沙門氏菌(sa，atcc35640)、單增李斯特菌(lm，atcc7644)和大腸桿菌o157:h7(atcc12900)的檢測引物和分子信標序列如表1所示。表1、檢測引物和分子信標序列及終濃度名稱引物和探針序列(5'-3')終濃度(μm)sa-fctcaccaggagattacaacatgg0.6sa-ragctcagaccaaaagtgaccatc0.6sa探針fam-ccccgacttttagccactgacgacgggg-dabcyllm-ftgcaagtcctaagacgcca0.48lm-rcactgcatctccgtggtatactaa0.48lm探針fam-cgccgatttcatccgcgtgtttcttttcggcg-dabcylo157-faagattgcgctgaagcctttg0.48o157-rgccaatattgcctatgtacagc0.48o15探針fam-ccgtgacaaccattccaccttcacgg-dabcyl多重擴增的反應體系(pcr混合液)為80μl，其中包含pcrmastermix40μl(北京百泰克生物技術有限公司)、引物(終濃度如表1所示)、牛血清蛋白(bsa)200g/l和三種細菌的基因組dna(終濃度均為103copies/μl)，剩余體積用水補齊。2、芯片的準備(1)探針點樣用移液槍將分子信標(0.4μl，原濃度為10μm)分別點樣在各個檢測腔室307，檢測腔室307從右至左依次編號為1-7。1和2號檢測腔室點樣sa探針，3和4號檢測腔室點樣lm探針，5和6號檢測腔室點樣o157探針，7號檢測腔室不點樣探針，室溫下將探針晾干。(2)親疏水修飾芯片的虹吸管道303用2％(體積分數)吐溫20溶液(溶劑為酒精)進行親水修飾，第一界面閥304和第三界面閥310用氟化液fc-1700(3m公司)進行疏水修飾。進行完探針點樣和親疏水修飾后，用單面膠將芯片的一面封閉。二、檢測1、pcr擴增從加樣孔301注入80μl配置好的pcr混合液，加樣完畢后用單面膠將另一面的加樣孔封閉，從而使芯片完全密封。將芯片放入平板pcr儀內進行pcr擴增反應，得到多重pcr擴增產物。pcr反應條件如下：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃30s，35個循環(huán)。2、多重pcr擴增產物的分配及雜交pcr完畢后，將芯片轉移至離心裝置(圖5)，離心裝置的離心半徑即為芯片的半徑，4000rpm/min離心芯片10s，通過離心作用，使液體(多重pcr擴增產物)突破第一界面閥304；然后降低轉速至100rpm/min，持續(xù)10s，通過毛細作用，使液體(多重pcr擴增產物)填充虹吸管道303；再次提高轉速至1000rpm/min，持續(xù)30s通過虹吸作用，使液體(多重pcr擴增產物)填充各個預分配室305，多余的液體進入廢液池308；然后繼續(xù)提高轉速至4000rpm/min，持續(xù)10s，通過離心作用，使液體(多重pcr擴增產物)突破第二界面閥306進入到檢測腔室307的各個檢測孔內，分別和預點樣在其中的探針雜交(室溫孵育30min)，得到雜交后芯片。同時以不加入細菌模板的pcr擴增后體系和探針雜交后的熒光強度為陰性對照。3、熒光強度檢測將雜交后芯片放入檢測儀器內測定每個檢測孔的熒光強度。具體步驟如下：將雜交后芯片中檢測腔室內液體吸出至20μl的ep管里，通過rtcycler136(北京博奧生物集團有限公司)檢測各個檢測腔室內液體的熒光強度。檢測溫度為37℃，熒光通道設置為fam，檢測時間為10min。取末點熒光值作為每個孔的熒光強度。結果如圖3所示。從圖中可以看出，和不加細菌模板的檢測孔相比，加入細菌模板的檢測孔中均檢測得到熒光強度，實現對沙門氏菌(sa，atcc35640)、單增李斯特菌(lm，atcc7644)和大腸桿菌o157:h7(atcc12900)的定性檢測。和文獻中的方法相比，本發(fā)明的方法不需要按照文獻中使用三種不同的熒光基團標記探針，僅需要一種熒光基團即可實現多重核酸擴增產物的定性檢測，簡化了檢測儀器的熒光通道數量。當前第1頁12